细胞污染及处理方法

细胞培养的四个步骤细胞是组成生物体的基本单位，生物体由各种类型的细胞组成。

在显微镜下不同的细胞有不同的形态。

利用免疫荧光、流式荧光标记、免疫组化都能进行细胞观察。

培养细胞的最终目的：拿到细胞进行后续的下游实验WB、ELISA等蛋白检测DNA、RNA等分子检测凋亡、增殖、周期等功能检测原代细胞培养、冻存等细胞实验细胞培养几乎是所有细胞生物学实验的基础，细胞养得好，实验没烦恼！原代细胞培养，细胞的传代，冻存、复苏，细胞污染的防与治，我们的经验都在这篇文章里！一、细胞培养相关设备和试剂1、细胞培养的相关设备生物安全柜的安全保护等级>超净工作台，当涉及到病毒，需要使用生物安全柜。

生物安全柜：对柜内外的安全保护超净工作台：对工作台内部的安全保护超净工作台/生物安全柜的工作流程：2、细胞培养用相关试剂①培养基作用：人工模拟细胞体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质，提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。

不完全培养基：直接购买或者配置的培养基。

完全培养基：不完全培养基+血清（提供营养物质）+双抗（保证无菌环境）+其他。

由于细胞种类和培养条件不同，适宜的合成细胞培养基也不同，在动物细胞培养中最常用基础细胞培养基有6～7种，如BME、MEM、DMEM、HAMF12、RPMI1640、199等。

②血清血清的功能：生长、分化必须的物质：生长因子、激素、基础培养基中没有的微量物质、小分子营养物转运维生素、脂类、金属离子和微量元素等；促进细胞贴壁、铺展；毒素灭活，蛋白质与有毒金属和热源物质结合；提供蛋白酶抑制剂；起酸碱度缓冲液作用。

血清的分类最常用的是胎牛血清。

胎牛还未接触外界，免疫系统激活最少，血清中所含的抗体、补体等对外来物质排斥最小，对细胞有害的成分最少。

③胰酶常用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA胰酶：胰脏中分离，选择性的水解蛋白质中有赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，最佳作用温度37℃，PH=8.0，常用浓度0.1%—0.25%，一般用不含Ca2+、Mg2+的平衡盐缓冲液配制（PBS或Hanks），可用含有血清培养基终止胰酶对细胞的作用（观察细胞的剥离状态确定终止时间）。

污染是细胞培养的大敌。

预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。

一开始就要十分重视，防止污染，否则会前功尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。

细胞培养中常见的生物污染类型有7种，分别是细菌污染、支原体污染、原虫污染、黑胶虫污染、真菌污染、病毒污染以及非细胞污染。

他们在细胞培养中污染的特点如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。

2、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。

而且它不能用过滤的办法除去。

支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。

3、黑胶虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。

常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。

对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。

4、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。

真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。

5、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。

他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。

这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。

6、病毒：组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。

细胞管理规范细胞管理规范是指对实验室中使用的细胞进行合理管理的规定。

合理管理细胞可以保证实验室研究的准确性和可靠性，也可以避免细胞的交叉污染和不必要的浪费。

下面是对细胞管理规范的一些建议和要求：1. 细胞保存和标识：在实验室中，应该定期保存细胞的备份样品。

备份样品应该存放在合适的低温环境中，以保证其健康和稳定性。

此外，每个细胞株都应有唯一的标识，以便于在实验室成员之间进行交流和识别。

2. 细胞文书记录：对于每个细胞株，都应该建立详细的文书记录，包括来源、鉴定信息、培养条件、传代次数等。

这些记录对于后续实验中的验证和参考非常重要。

3. 细胞传代的合理控制：细胞传代次数的控制对于维持细胞株的稳定性和功能的正常表达非常重要。

一般来说，细胞传代次数不宜超过一定的阈值。

具体的阈值可以根据实验室的经验和研究领域的要求来确定。

4. 细胞安全操作：在进行与细胞培养相关的实验时，应注意安全操作。

例如，佩戴手套、口罩和实验室衣物；定期对操作台面、通风设施和实验室设备进行清洁和消毒等。

5. 细胞交叉污染的预防：为了防止细胞之间的交叉污染，实验室成员应注意严格的实验操作流程和细胞的隔离。

每次使用细胞前，都应进行彻底的洗手和实验台面的清洁，以减少外源性细胞的污染。

6. 细胞质量的鉴定：定期对实验室中使用的细胞进行质量检测是很重要的。

例如可以通过检测细胞生长状态、染色体数目、细胞表面标记物等来进行质量鉴定。

7. 细胞废弃物的处理：实验室中产生的细胞废弃物应进行妥善处理。

例如，可以将废弃培养物进行高温高压处理，或者使用其他适当的消毒方法进行处理，以避免对环境和人体产生负面影响。

通过遵守和执行上述细胞管理规范，可以提高实验室的工作效率和科研质量，保证实验结果的准确性和可靠性。

同时，也可以降低实验中出现意外情况和细胞交叉污染的风险，更好地保护实验室成员的健康和安全。

因此，细胞管理规范对于实验室研究是至关重要的。

细胞培养中的黑胶虫污染及解决方案点击次数：2365 发布时间：2011-4-2细胞培养中的黑胶虫污染摘要：预防和避免污染是细胞培养成功的关键，黑胶虫(也称黑焦虫)是近几年来几乎出现在每个细胞培养实验室。

但是现在无法对黑胶虫的确认和鉴别，导致学术界说法不一，笔者收集了关于黑胶虫的资料，对黑胶虫进行类系统描述，对黑胶虫出现的情况对细胞培养的影响以及黑胶虫污染后的有效处理进行介绍。

关键词：黑胶虫污染处理细胞培养The pollution of black dots in cell culture(Grade 2005, Biotechnology, School of Life Science and Engineering)Abstract Pollution prevention is the key to success in cell culture, black dots (also called black particles) almost appeared in every cell culture laboratory in past few years .But now no one able to confirm and identify what the black dots is. This lead to appear different academic arguments.The author collected information about the black dots to make a description about black spots which similar to the systemic description,and Introduce when aand where the black dots come out. At the same time give some advice to deal with the black dots.Key words Pollution black dots cell culture前言污染是细胞培养的大敌。

生物制药中的生物危害及其防治措施生物制药生产过程中可能存在的生物危害主要包括微生物污染、细胞株突变、病毒污染和内毒素产生等问题。

这些危害对生物制药质量和安全都可能造成严重影响，因此需要采取一系列防治措施。

1. 微生物污染：生物制药生产中常使用大量的微生物，如细菌、真菌、酵母等。

如果这些微生物没有得到严密控制，就可能引起严重的污染。

为预防微生物污染，可以采取以下措施：（1）严格执行洁净生产要求，建立条码标识和记录体系，确保每一批原料和半成品都可以追溯；（2）建立有效的无菌生产操作规程，使用消毒剂消毒设备和生产环境；（3）应用适当的微生物监测方法对生产过程进行严密监控，及时发现并处置污染源。

2. 细胞株突变：在生物制药生产中，细胞株是一种非常重要的生物原料。

细胞突变可能导致细胞株性状或生物产物性质的改变，甚至可能对人体健康造成威胁。

为了防止细胞株突变，可以采取以下措施：（1）对细胞株进行全面的质量控制和检测，确保其稳定性和一致性；（2）将细胞培养环境控制得尽量稳定，确保细胞株在细胞培养过程中不会突变；（3）建立科学完备的细胞株保管和检索体系，对已经使用的细胞株进行跟踪监测和评估。

3. 病毒污染：病毒是一种极小的生物体，容易逃避监视和检测。

如果病毒污染，可能引起严重的健康威胁和质量问题。

为了预防病毒污染，应采取以下措施：（1）在生产过程中对细胞和细胞培养液进行常规病毒检测；（2）在病毒检测过程中，应采用灵敏度高、特异性好的检测方法；（3）对使用的原材料、介质和缓冲液等进行严格的病毒清除和灭活处理。

4. 内毒素产生：内毒素是一种广泛存在于生物体中的毒素，可以引起炎症反应和毒性反应。

在生物制药生产中，内毒素的产生可能导致产品的污染和安全问题。

为了避免内毒素的产生，可以采取以下措施：（1）采用严格的洁净生产操作和灭菌措施，避免污染来源；（2）选用无内毒素的原材料和介质，或者使用内毒素清除技术清除残留内毒素；（3）在生产过程中加强质量控制，确保产品不含内毒素。

最近看到不少问有关细胞培养污染的事，正好我看到了一个有关这方面的总结，很全很好很强大，跟大家分享下细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。

仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。

或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。

CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。

并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。

待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。

孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。

其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。

预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。

，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。

而且它不能用过滤的办法除去。

支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。

用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。

现代医院2021年2月第21卷第6期Modern Hospitals Fed2000Vot21No6一种新的抗生素联合用药方案清除细胞支原体污染的研究黎少梁永康冯思桦彭青高毅【摘要】目的支原体污染是细胞培养过程中最为常见也较为棘手的问题，因此，解决细胞支原体污染问题存在必要性和迫切性。

但是目前可用的商品化去除支原体试剂选择少，价格贵，本研究拟探索一种操作简单，成本低且去除支原体效果佳的抗生素联合用药方案。

方法选取四种抗生素药物联合用药：红霉素、氯霉素、泰乐菌素和环丙沙星，连续2天处理培养支原体污染的C5A肝癌细胞。

首先通过倒置显微镜观察加药处理后，C5A细胞内颗粒、形态等变化；加药处理C3A细胞后通过CCK-8法检测其活率。

其次,进行支原体聚合酶链式反应(PCR)检测和荧光染色，评价抗生素联合用药方案去除支原体的有效性。

最后，实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测C3A细胞主要功能基因角蛋白(CK18)、白蛋白(ALB)、氨甲酰磷酸合成酶l(CPSl)和细胞色素P454酶系1A2(CYP1A2)等功能基因的表达恢复情况。

结果经抗生素联合用药处理后，细胞形态更为规整，胞内颗粒显著减少，形态透亮折光度增强等特征变化，对C3A细胞活率无明显影响，抗生素联合用药组PCR电泳结果显示没有支原体DNA条带，同时荧光结果表明没有出现其余点状或者串点的支原体荧光，支原体去除后功能基因CK18、ALB、CPS1和CYP1A6相对表达量均升高。

结论新的抗生素联合用药方案能够达到支原体去除效果,C3A细胞活率维持较好,去除支原体后细胞主要功能基因表达可得到恢复提升。

【关键词】抗生素处理；支原体去除；支原体检测；基因表达中图分类号：R678.1；R375+.3文献标志码：A doi：10.3969/j.issn.271-332X.2021.02.041A new cambination of antibiotics heytmeet for cellular mycoplasma cantaminationLA SUan*,LIANG Yonzkan,,FENG SiOua,PENG Qin,,GAO Y,[Abstract]Objective Mycoplasma contamination can cousc c wiUe range of WouUlesome podlems associateX with celt cu U uo in bioloyy oseaoO,it is tbeoforo necessay to Veep celt cu U uo free of mycoplasma contamination.However,tbero are few options to cOooso the cvvilaPte commeoict mycoplasma omovct Uogs wOicO are also expensive.It is Oope to explore c new an­tibiotic toatwext wOicO is l ow cost；simple-opeotion,an)eXective in mycoplasma removal.Methods A new antibiotic toct-mext was combineX with four antibiotic Uogs incluUing eothomyciu,cOloompOexicot,tylosiu anU cipo2oxcciu,wOicO was ap-plieX in C3A celt Une contaminateX by mycoplasma for16days.First of alt,we odseoeX the cOanges of the paOicles anU moo of C3A celt afer treatment of the new combination antibiotic Uogs thouah an inveOeX microscope；the viaPility of C3A celt was UetecteX by celt connting Vit-8(CCK-8)assay afer toatwext.Moreover,polymerase cOain reaction(PCR)Uetec-tion an)fnooscext staininu of mycoplasma were peOormeX to evaluate wOetbes the new combination antibiotic Uoas could remove mycoplasma contamination.Finally,oct-tine quantintive PCR(qPCR)metboP was useX to Uefine the recovery of the main functional uenes expression incluUing cytoPeotin13(CK13),albumin(ALB),ccmamoyl pOospUate syptheWse I(CPS1)anU Cuman cytocOome P4501A6(CYP1A2).RescUs Ates the treatment of new combination antibiotic Uoas,more oyulcs an)u­niform celt momholoyicct cOanges were showeX,the suUsequext oXuctions in intocellulcs paOicles an)exUanceX momholoyicct transpaoxey were odseoeX,furthermore no sipnificant eXect on the C3A celt viaPility occoroX.Mycoplasma DNA ban)was no-posexteX by PCR Uetection,anU the fnooscence results inUicateX that the C3A celt Vept away from othes spots os cross-points of mycoplasma2uorescexcc•Ater the removal of mycoplasma,the relative expression level of CK13,ALB,CPS1an)CYP1A6 incoaseX.Conclcsion T0e result of mycoplasma removal could be acOieveX by the new combination antibiotic Uoas toatmext with welt-maintaineX viaPility an)restoration of functional uenes expression in C3A celt.[Key words”Antibiotic toatwext；Mycoplasma removal；Mycoplasma Uetection；Gene expression[Author's address]*ZOujiang Hospital of Sontbern MeXicct University,Guangzhon514230,COinc支原体污染是细胞培养、基础研究和生物制品生产等主要问题［一2。

细胞放在培养箱里注意什么细胞放在培养箱中是一种常见的实验室操作，用于维持细胞生长和进行细胞实验。

在放置细胞进入培养箱之前，需要注意以下几个问题。

首先，需要保持培养箱的洁净。

在将细胞放置到培养箱中之前，需要仔细清洁培养箱内部表面，包括水槽、架子和门等部位。

使用无菌消毒剂进行清洁，以杀灭可能存在的细菌、真菌和其他微生物。

保持培养箱的洁净对于避免细胞污染和细胞生长异常至关重要。

其次，需要确保培养箱内环境的稳定性。

细胞的生长受到温度、湿度、氧气和二氧化碳浓度等因素的影响，因此，放置细胞进入培养箱之前需要调整和维持这些应变因素的适宜状态。

通常，培养箱会配备恒温装置，可以将温度保持在37左右，符合大多数细胞生长的条件。

另外，还需要在培养箱中添加适量的水，以增加湿度，并且定期检查和更换水。

此外，利用阀门来控制气体流量，使培养箱内的氧气和二氧化碳浓度达到适宜的水平，以维持细胞的正常生长和代谢。

再次，要注意培养箱的使用时间和频率。

长时间连续使用培养箱可能会导致电子元件的老化和故障，影响其稳定性和安全性。

因此，在使用培养箱之前，需要检查其电子元件是否正常工作，如温度控制器、湿度计和阀门等。

此外，在每次使用过程中，也应定期对培养箱进行检查和维护，确保其正常运行。

使用过程中要定期清理培养箱，防止细菌和真菌残留。

此外，还需要注意细胞的培养和处理方式。

细胞的培养需要根据不同的细胞类型和实验要求来确定培养基的组成和添加剂的类型。

在放置细胞进入培养箱之前，需要准备好培养基和细胞悬液。

在放置细胞时，应注意避免细胞悬液的浪涌和溅出，以免污染培养箱内部。

同时，还需要注意使用无菌操作技术，以避免细菌和真菌的污染。

在细胞培养过程中，还需要定期观察和检查细胞生长情况。

通过显微镜观察细胞形态、数量和健康状况，并记录相关数据。

对于细胞生长异常的情况，需要及时调整培养环境、培养基配方和处理方式，以确保细胞的正常生长和实验的准确性。

综上所述，放置细胞进入培养箱时，需要注意培养箱的洁净、环境的稳定性、使用时间和频率、细胞的培养和处理方式，以及定期观察和检查细胞的生长情况。

流式细胞术计数法原理流式细胞术(fcm(Flow Cytometry Method))是对细胞和微粒进行快速、灵活、定量分析分类的高精技术，它融合了激光、电子计算机、单克隆抗体、荧光素化学、细胞化学染色等技术的优点。

其基本原理是以激光为光源，将被检细胞用荧光标记抗体结合后输入流式细胞仪，通过高速流动系统对细胞排列成行，一个一个的流经检测区，当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡搅动液流，使液流断裂成一连串均匀的小滴，每滴内最多只含有一个细胞，细胞经荧光探针的光反应和标记物的光散射能力中获取信息，由光电倍增管接收并转化成脉冲信号，并进行增强，数据经电脑处理、分辨细胞的类型从而检测出各类淋巴细胞。

检测方法标本使用抗凝全血，在falcon流式进样管内加入20ul t淋巴细胞cd3cd4cd8抗体和反向加样50ul全血，轻轻充分混匀，置室温避光处放置15min，加入10倍稀释facs （ fluorescence-activated cell sorting）溶血素450ul，置室温避光处放置15min。

用multiset 自动软件获取15000个淋巴细胞，自动分析t淋巴细胞免疫亚型，报告cd4+,cd8+t淋巴细胞百分率cd4+,cd8+t淋巴细胞绝对计数及cd4+/cd8+比值。

实验数据用spss 13.0软件包处理，数据采用均数±标准差（x±s）表示。

细胞培养中常见的污染情况总结如下: 常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。

仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。

细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍（2016年10月16日）哺乳动物细胞的培养，支原体（Mycoplasma）污染是个世界性的问题。

支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误。

从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。

相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。

目前，细胞支原体污染常用的支原体检测方法主要有：一、培养法●原理：将待检测样品先接种到支原体液体培养基中大量繁殖，然后再转接种到支原体固体培养基中，培养一段时间后（大约一个月），如果固体培养中，出现典型的支原体菌落，则说明待测样品有支原体污染。

●优点：支原体培养法是相对可靠的支原体检测技术，也是我国药典认可的方法之一。

●缺点：（1）培养法非常耗时的，需要数周，不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测；（2）通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最常见的支原体，即猪鼻支原体（M.Hyorhinis）。

这是因为猪鼻支原体无法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。

而猪鼻支原体约占所有细胞支原体污染的20-50%。

●《培养法支原体检测试剂盒》》主要厂家：读者可以根据《中国药典》中收录的培养法支原体检测方法进行操作。

二、荧光染色法●原理：将待检测样品接种到专门的指示细胞（如：Vero细胞）中，培养一段时间后，用DNA荧光染料（如：Hoechst 33258，DAPI）进行染色，如果除了细胞核被染色外，细胞质也有大量的絮状核酸物质被荧光染料染色，那么这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA。

●优点：荧光染色法也是我国药典认可的方法之一。

●缺点：（1）该方法灵敏度太低，当检测成阳性时，细胞经常已经严重污染；（2）需要用到专门的指示细胞（如：Vero细胞），如果不用指示细胞而直接对目标细胞进行荧光染色，由于每种细胞繁殖和吸附支原体的能力差异极大，检测的准确性将比用Vero等指示细胞进行检测要低得多；（3）该方法严重依赖实验人员的经验，可重复性较差。