单克隆抗体药物关键技术分析
1.高通量的动物细胞表达技术
一方面，从表达体系来看，近年来，人们不断发展和完善了许多抗体分子的表达体系,如：细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞表达系统和体外翻译系统等.哺乳动物细胞表达系统具有活性高、稳定性好等重要优点，已成为抗体等生物技术产品最重要的系统。2007年销售额排名前列的6类生物技术药物中，有5类是由动物细胞表达生产（肿瘤治疗抗体类、抗TNF-α抗体类、EPO类、β干扰素类、凝血因子类)，仅胰岛素类药物是由大肠杆菌和酵母表达的。欧美国家哺乳动物细胞表达产品种类占60％-70%，市场份额占65％以上.
另一方面，从抗体制备规模、速度和功能来看,高通量抗体制备技术的发展十分重要。哺乳动物细胞表达生物技术产品大规模高效培养技术是生物医药产品主要的生产方式和关键“瓶颈”技术。目前,国际上该项技术发展较快,已趋成熟，以默克公司为代表的流加培养生产规模达10,000L以上，以贝尔公司为代表的灌流培养生产规模达200L以上，蛋白表达浓度为0。5—2g/L；我国在该技术领域起步较晚，基础较差,但近年来经过努力，已经实现了该项技术的突破。 2.人源化抗体的构建及优化技术
随着免疫学和分子生物学技术的发展以及抗体基因结构的阐明，DNA重组技术开始用于抗体的改造。抗体药物已经进入基因工程抗体时代。基因工程抗体具有以下优点：①降低人体对异种抗体的排斥反应；②减小抗体的分子量，利于其穿透血管壁，进入病灶的核心部位；③根据需要，制备新型抗体；④采用多种表达方式，大量表达抗体分子，降低生产成本。
(1)表面重塑抗体
对鼠抗体表面氨基酸残基进行人源化改造.该方法的原则是仅替换与人抗体SAR差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换；另外，所替换的区段不应过多，对于影响侧链大小、电荷、疏水性,或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区（CDR）构象的残基尽量不替换。我国也已经开始这方面工作的尝试.
单克隆抗体制备的技术原理
单克隆抗体是由一个杂交瘤细胞及其后代所产生的抗体，具有单一、特异与纯化的特性。该抗体在医学临床诊断及治疗上具有极其重要的作用。因此它的问世在现代免疫学上具有划时代的意义。
大家知道，当外源性物质在人体或动物血液中出现时，机体中有一些淋巴细胞便会做出反应，产生一些特殊的免疫球蛋白，叫做抗体。而那些外源性物质则称为抗原。抗体与抗原能发生特异结合，从而清除异物，达到保护肌体的作用。抗原不同，它所诱发的抗体也不一样。如细菌或病毒表面存在着几种抗原，因此它们就会对应地诱发出几种不同的抗体。过去人们为了获得抗体，就根据上述原理，反复注射某种抗原到动物（如兔、羊、马等）体内，然后从其血清中分离出所需的抗体。长期以来，用这种经典方法得到的抗体，往往存在着两个严重的缺点：第一，这些抗体不是均质的，而是一种抗体的混合物，特异性差，效价低；第二，抗体的产生是有限量的，因为分泌抗体的成熟淋巴细胞寿命很短，一般只能存活几天，无法大量生产。
为了克服上述缺点，许多免疫学家曾进行了长期的研究与探索，这一难题终于在1975年被国外两名免疫学家考勒和米尔斯坦解决了。他们利用自己创立的杂交瘤技术，使产生抗体的淋巴细胞能在体外长期存活，并源源不断地分泌抗体。这就是有高特异性和非常均质的单克隆抗体。
单克隆抗体的技术原理并不十分复杂。它是把能产生单一抗体的淋巴细胞与有增殖能力的骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞，又称杂交瘤。由于这些杂种细胞继承了双亲细胞的遗传物质，因此它们不仅能表现出淋巴细胞分泌单一抗体的能力，而且还能表现出骨髓瘤细胞在体外大量繁殖的本领。就这样，取长补短，使杂交瘤变成了一座制造单克隆抗体的理想“工厂”。
目前制备单克隆抗体的具体方法，主要有以下三步（图2－9）。
第一步：将抗原注射到小鼠体内进行免疫，取出受免脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合。
第二步：用选择培养基，选出杂交瘤细胞，逐一克隆或扩增，从中挑出能产生抗体的杂交瘤细胞。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体是通过从一个单一的B细胞克隆中获得的抗体，具有高度特异性和亲和力。单克隆抗体制备流程主要包括以下几个步骤：免疫原选择、免疫动物注射、细胞融合、筛选和鉴定、扩大培养和纯化。
1. 免疫原选择
选择一个适当的免疫原对于获得高质量的单克隆抗体非常重要。免疫原可以是蛋白质、多肽、糖类或其他小分子。在选择免疫原时，需要考虑其特异性、稳定性以及是否能够激发机体产生免疫应答。
2. 免疫动物注射
选择适当的实验动物（如小鼠）作为宿主，将免疫原与佐剂混合后注射到动物体内，激发机体产生特异性抗体。通常情况下，需要进行多次注射以增强机体对免疫原的应答。
3. 细胞融合
在动物免疫后，需要从其体内获得抗体产生的B细胞。一种常用的方法是选择脾细胞作为B细胞的来源。将脾脏取出并制备成单细胞悬液，然后与骨髓瘤细胞（如SP2/0或NS0）进行细胞融合。这一步骤通过加入聚乙二醇（PEG）等化合物来促进细胞融合。
4. 筛选和鉴定
在细胞融合后，需要对混合细胞进行筛选和鉴定，以筛选出产生特异性抗体的杂交瘤细胞。常用的筛选方法包括限稀稀释法、ELISA法和免疫组化等。将混合细胞进行适当稀释，使每个孔中只包含一个杂交瘤细胞，并培养在含有高浓度免疫原的培养基中。然后使用特异性检测方法检测孔中是否存在特异性抗体。
5. 扩大培养
一旦筛选出产生特异性抗体的杂交瘤细胞，需要将其扩大培养。培养条件需要提供适当的营养物质和生长因子，以确保细胞的生长和抗体的产生。扩大培养一般采用无血清培养基，如Hybridoma-SFM，并在合适的温度和CO2浓度下进行。
6. 纯化
在获得足够量的单克隆抗体后，需要对其进行纯化以去除杂质。常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等。通过这些方法可以将单克隆抗体从细胞培养基中纯化出来，并得到高纯度的抗体样品。 7. 鉴定和验证
需要对制备的单克隆抗体进行鉴定和验证。鉴定主要包括检测抗体的特异性、亲和力和稳定性。常用的方法包括ELISA、Western blot、流式细胞术等。验证则是通过实验确定抗体在特定应用中是否能够发挥预期效果。
单克隆抗体和重组治疗性蛋白质的聚体分析
生物制品中的聚体的来源，类型和大小不同，并且是由多种因素引起的。监管机构特别关注的是具有增强免疫应答从而引起不良临床反应的蛋白质聚体，或可能损害抗体或蛋白药物产品安全性和功效的聚体。在动物和临床研究中已经报道了蛋白质聚体可以增强免疫反应。尽管可以预期对人外源蛋白物质的免疫反应，但免疫系统可能会通过耐受性分解机制对具有内源性的聚集蛋白制品产生强烈反应。在耐受性破坏机制中，蛋白质聚体可在蛋白质复合物的形成中充当促进剂，这些蛋白质复合物可触发B细胞针对该蛋白质抗体的产生，而与T辅助细胞无关。这类反应的基础来自免疫原概念，其中抗原具有多于半抗原的聚合结构形式存在，在病毒样颗粒组织中间隔5-10nm，大小超过100kDa，可以克服免疫力。这种情况可能解释了内源性蛋白质的意外中和，并且产生了深远的临床效果。这种类型的机制最受关注的是高分子量（HMW）聚集体，这些聚体保留了其单体对应物的大多数天然构型，并且可以以这种方式使抗原成核。另外，显示非天然蛋白质构象的聚体可能被免疫系统视为新抗原，这可能会触发抗抗体形成。在这里我们提供了有关蛋白质药物中的聚体的表征，检测方法以及药物制造商已实施的各种控制措施的监管观点。
抗体或蛋白聚体的分类
聚体的分类是一项复杂的任务，目前还没有全面的分类方法。分类的困难在于可以对聚合进行多个类别的分组。下表1列出了生物制药中最常见的聚体类别。为了有助于理解所讨论的聚体类型，常见的聚体类型有：二聚体，可逆聚体，共价聚体和颗粒，这些都是蛋白聚集中常见的形式。聚体的其他分类可以基于聚体的大小，因为这可能与潜在的不良临床反应直接相关。聚体的大小范围从可溶性二聚体和其他多聚体（表观球状直径约5-10nm），包括高分子量（HMW）聚集体到可溶或不溶的有核聚集体，到较大的不溶性物质（被识别为亚可见和可见）颗粒（表观球状直径约20–50µm）。在可溶性聚集体组中，较大的聚集体（例如HMW物）可能更能引发产生不良临床后果的免疫原性应答。就其分子量而言，大小大于10的二次方kDa的聚体潜在的不良免疫原性反应潜力，值得更仔细的评估。
