单克隆抗体的制备方法

第 1 页 共 2 页

单抗腹水生产

一、单克隆抗体的生产

获得稳定的杂交瘤细胞系后，即可根据需要大量生产单抗，以用于不同目的。

目前大量制备单抗的方法主要有：一是动物体内生产法，这是国内外实验室所广

泛采用的；二是体外培养法。

（一）动物体内生产单抗

通常情况下均采用动物体内生产单抗的方法 ，鉴于绝大数杂交瘤均有

BALB/c 小鼠的骨髓瘤细胞与同品系的脾细胞融合得到，故首选 SPF 级的BALB/c

小鼠。本方法既是将一定量的杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，杂交瘤细胞在腹腔

内增值并产生腹水。该方法操作简单，经济，但小鼠腹水中含有各种杂蛋白，需

要提纯。

（二）体外培养生产单抗

杂交瘤细胞并不是严格的贴壁生长的细胞，故既可以进行贴壁培养，又可

以进行悬浮培养。 目前杂交瘤细胞的大量培养中主要两种类型的培养系统：

1.悬浮培养系统：采用转瓶或发酵罐式的生物反应器，其中包括使用微载体。

（1） 目前小规模悬浮培养多采用转瓶，通过搅拌使细胞呈悬浮状态；

（2）大规模悬浮培养多采用发酵式的生物反应器，其培养方式可分为纯批式，

流加式，半连续式和连续式；

（3）微载体培养法：其中，微载体是以小的固体颗粒作为细胞生长的载体，在

搅拌作用下微载体悬浮与培养液中，细胞则在固体可立表面生长成单层。微载体

主要以交联琼脂糖或葡聚糖，聚苯乙烯，玻璃等作为基质，其中以 Cytodex I ，

Biosilon 和 Superbeads 为好，近来研究表明，该法收杂交瘤细胞大量培养的理想

途径之一。

2.细胞固定化培养系统：包括中空纤维细胞培养系统和微囊化细胞培养系统。

（1）中空纤维细胞培养系统：该系统由中空纤维生物反应器，培养基容器，供

氧器和蠕动泵等组成。中空纤维的内腔表面是一层半透性的超滤膜，其孔径只允

许营养物质和代谢废物的进出，而对细胞和大分子物质（如 Ig）有滞留作用。

目前使用的中空纤维生物反应器分为柱式，板框式和中心流管式。该方法大规模

单克隆抗体制备及抗体保存

一、单克隆抗体制备

单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合为既能稳定生长又能产生抗体的杂交瘤细胞。单克隆抗体具有理化性状高度均一（纯度高、有效抗体含量高）、生物活性单一、与抗原结合特异性强、来源容易、制备成本低等优点，并且可用于疾病的诊断和治疗。

（1）单克隆抗体制备原理：

抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞可以合成不同的抗体。当机体受外界抗原刺激后，可诱发免疫反应，产生相应的抗体，即单克隆抗体。B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂；肿瘤细胞在体外培养的条件下可以无限传代，是“永久”的细胞，但不能产生抗体。因此将骨髓瘤细胞与经免疫过的小鼠的脾细胞在聚乙二醇等介导下发生融合，融合后的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性，一方面可以分泌特定的抗体，另一方面也具备了肿瘤细胞无限增殖的能力，可在体外培养条件下或移植到体内无限增殖，从而分泌大量单克隆抗体。

（2）单克隆抗体制备流程：

1、免疫动物

免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄Balb/c健康雌性小鼠，按照预先指定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。

２、脾细胞的准备

➢ 拉颈处死小鼠

➢ 无菌操作取出脾脏

➢ 清洗研磨，收集细胞

➢ 离心洗涤

➢ 细胞计数

３、骨髓瘤细胞的准备

➢ 收集细胞

➢ 离心洗涤

➢ 活细胞计数

➢ 调整细胞浓度

４、细胞融合

➢ 骨髓瘤细胞与脾细胞按一定比例混合1：10或1：5。

单克隆抗体的制备流程

1.免疫原的制备和动物的免疫：

在开始制备单克隆抗体之前，首先需要制备免疫原。免疫原可以是蛋白质、多肽、多糖、细胞表面抗原等。制备免疫原的常用方法包括化学合成、原核表达系统、真核表达系统等。制备好免疫原后，将其与适当的佐剂混合，然后通过注射等方式将免疫原引入到实验动物体内。通常使用小鼠、大鼠或兔子作为免疫动物。

2.脾细胞的获取和混合瘤细胞的建立：

在免疫过程中，免疫原会刺激机体产生大量的抗体。当机体免疫反应达到一定水平时，需要从免疫动物体内获取脾脏，获得含有抗体产生细胞的脾细胞悬液。将脾细胞与能激活脾细胞的细胞（如骨髓瘤细胞）进行融合，形成混合瘤细胞。

3.杂交瘤细胞的筛选和鉴定：

将混合瘤细胞进行稀释，分装到96孔板中，使每个孔中只包含一个细胞。这样每个孔中的细胞都是一个潜在的单克隆细胞。随后，每个孔中的细胞在培养基中进行培养，以使细胞形成单个克隆。根据杂交瘤细胞产生的特定抗体，可以使用ELISA等方法进行筛选和鉴定，以确定具有所需抗体的杂交瘤细胞。

4.单克隆抗体的生产和纯化：

将筛选出来的单克隆杂交瘤细胞进行扩大培养，并定期收集培养上清液以获取单克隆抗体。为了提高单克隆抗体的纯度和浓度，通常需要对培养上清液进行多次纯化。典型的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。

综上所述，单克隆抗体的制备流程包括免疫原的制备和动物的免疫、脾细胞的获取和混合瘤细胞的建立、杂交瘤细胞的筛选和鉴定，以及单克隆抗体的生产和纯化等几个主要步骤。每个步骤都需要精确操作和耐心等待，但最终可以获得高纯度和高特异性的单克隆抗体，这在生物医学研究和临床诊断中具有重要的应用价值。

高中生物单克隆抗体的制备过程

高中生物课本中描述单克隆抗体的制备过程是怎么样的？下面是店铺为大家整理的高中生物单克隆抗体的相关知识点，希望对大家有所帮助!

高中生物：杂交瘤技术制备单克隆抗体的具体过程

1、免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的 过程。 一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。

2、细胞融合 采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。

3、选择性培养 选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。

4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化 在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。

5、单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。