荧光定量PCR(染料法)实验操作SOP

荧光定量PCR实验操作流程1. 检查实验室条件在进行荧光定量PCR实验前，首先要检查实验室的环境是否适合实验。

实验室应该保持干燥、清洁和无菌。

检查PCR仪和读板器是否能正常运转，并准备所有必需的试剂和器械。

2. DNA/RNA的提取和纯化从组织和细胞中提取和纯化DNA/RNA是实验的第一步。

在提取和纯化DNA/RNA的过程中，需要保持无菌和正确的技术。

同时需要注意使用适当的缓冲液和酶切剂，以避免DNA/RNA的损伤和降解。

3. DNA/RNA质量检测检测DNA/RNA的质量和浓度，以确保实验结果的准确性。

可以使用紫外线光谱仪或其他质量检测设备。

同时，需要记录下每个样本的质量和浓度值。

4. 反转录如果需要检测RNA，需要首先进行反转录（Reverse Transcription，RT）。

反转录反应将RNA转录成相应的cDNA，可以使用逆转录酶和随机引物进行反转录反应。

5. 荧光定量PCR反应体系和引物设计荧光定量PCR反应体系包括模板DNA/RNA，荧光探针，引物和PCR反应缓冲液。

引物的设计是至关重要的，需要确保引物与目标序列的特异性和敏感性。

引物的设计可以使用NCBI或其他引物设计软件进行。

6. PCR反应设置PCR反应参数：温度梯度，反应时间和DNA量，浓度和样本装载量等。

注意反应器核心温度的控制，以确保反应的准确性和重复性。

7. 数据分析使用荧光定量PCR的结果进行数据分析。

可以使用数据分析软件，例如GenEx或其他软件。

计算出每个样本的阈值循环数（Ct值），并使用标准曲线法进行定量计算。

总之，荧光定量PCR是一种高灵敏度和高特异性的分子生物学检测技术，不仅可以用于基础研究，还可以用于临床诊断和治疗监测等领域。

在实验前需要认真准备，操作流程中需要注意无菌和正确的技术，以确保实验结果的准确性。

荧光定量PCR实验操作流程1、实验器材多样品研磨珠均质仪台式高速冷冻型微量离心机荧光定量PCR仪超净工作台分光光度计离心管TIP头2、主要实验试剂及耗材RNA提取液三氯甲烷异丙醇无水乙醇引物75%乙醇：HyPure TMMolecular Biology Grade Water配制离心管、TIP头均购湿热灭菌40min，干燥。

二、荧光定量PCR实验步骤1、总RNA抽提（枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶）1）取匀浆器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上预冷。

2）取100mg组织，加入到匀浆器中。

3）充分研磨直至无可见组织块。

4）12000rpm离心10min取上清。

5）加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。

6）4℃下12000rpm离心10min。

7）将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。

8）-20℃放置15min。

9）4℃下12000rpm离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。

10）吸除液体，加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。

11）4℃下12000rpm离心5min。

12）将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。

13）加入15μl无RNA酶的水溶解RNA。

14）55℃孵育5min。

15)使用UV1800检测RNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5μl 待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。

16）将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为200ng/μl.左右。

2、反转录（枪头和PCR均经过湿热灭菌，无RNA酶）1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。

2）加入1μl 逆转录引物。

3）用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。

4）于PCR仪上65℃保温5min，迅速置冰上冷却。

5）依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶，用枪抽吸混匀。

荧光定量pcr实验步骤荧光定量PCR实验步骤引言：荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术，可用于准确、快速地定量检测DNA的含量。

本文将介绍荧光定量PCR实验的步骤，以及注意事项和数据分析方法。

一、实验准备1. 准备所需试剂和仪器：包括PCR反应体系的各种试剂（如引物、探针、酶等）和实时荧光定量PCR仪。

2. 根据实验设计，制定合适的实验方案。

确定需要扩增的目标序列，设计引物和探针。

二、样品处理1. 提取待测样品中的DNA，确保提取得到高质量的DNA。

可以使用商业DNA提取试剂盒进行提取，按照厂家说明进行操作。

2. 测定DNA的纯度和浓度，确保测量到的DNA适用于PCR扩增反应。

使用比色法或分光光度计检测DNA的纯度和浓度。

3. 对提取得到的DNA进行稀释，以便在PCR反应中使用。

确保稀释后的DNA浓度恰当，以避免PCR反应的干扰。

三、荧光定量PCR反应体系的准备1. 根据实验设计和目标序列的长度，计算出所需的试剂和反应体系的配比。

2. 根据计算结果，将引物、探针和模板DNA按照适当的比例加入PCR反应管中。

注意保持反应管的清洁和无菌。

3. 加入合适的PCR反应缓冲液、酶和核酸酶抑制剂等试剂。

根据实验设计的需要，可以在反应体系中添加适当的试剂，如酶切酶、胶束等。

四、PCR扩增反应1. 将PCR反应管放入实时荧光定量PCR仪中，设置好PCR反应的程序和参数。

通常包括预热、变性、退火和延伸等步骤。

2. 启动PCR反应，开始扩增。

在反应过程中，实时监测PCR产物的荧光信号强度，并记录下来。

五、数据分析与结果解读1. 在实时荧光定量PCR仪中，可以实时获得PCR反应体系中荧光信号的强度和变化趋势。

根据实验设计的需要，可以选择合适的荧光信号通道进行监测。

2. 根据荧光信号和PCR反应的周期数，可以绘制荧光增幅曲线。

通过观察曲线的形态和特征，可以初步判断PCR反应的特异性和效果。

第一部分一、基本步骤：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；2、引物、探针的设计；3、引物探针的合成；4、反应体系的配制；5、反应条件的设定；6、反应体系和条件的优化；7、荧光曲线和数据分析；8、标准品的制备；二、技术关键：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；从/网点的genbank中下载所需要的序列。

下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。

保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。

然后，再打开DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。

另一种直接用DNAstar 软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“open entrez sequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。

然后要对所有的序列进行排序。

用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“add all”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。

横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。

有时要设定比较序列的开始与结尾。

有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。

再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。

选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。

荧光定量PCR实验指南荧光定量PCR（qPCR）是一种能够对DNA或RNA的特定序列进行定量分析的技术。

它结合了PCR技术和荧光检测技术，能够检测出非常低浓度的靶分子。

本文将为您提供一份荧光定量PCR实验的指南，以帮助您完成这一实验。

实验前的准备工作：1.设计引物和探针：引物和探针是荧光定量PCR实验的核心组成部分，因此需要确保它们与目标序列特异性结合。

同时，还需选择合适的荧光染料和探针的浓度。

2.准备实验材料：包括引物、探针、荧光染料、模板DNA或RNA、逆转录酶酶、dNTP、聚合酶、缓冲液、MgCl2等。

3.准备质量控制样品：根据需要制备相应的阳性对照样品，并准备阴性对照样品。

实验步骤：1.反应体系的准备：根据PCR试剂盒使用说明或自行优化，将引物、探针、荧光染料、逆转录酶酶、dNTP、聚合酶、缓冲液、MgCl2等加入PCR管（注意按顺序添加，避免污染）。

2.加入模板：将模板DNA或RNA加入PCR管中，注意保持反应体系的稳定。

3.PCR条件设定：根据目标序列的特性和PCR试剂盒的要求设定PCR反应的温度、时间和周期数。

4.PCR反应：将PCR管密封，然后置于热循环仪中进行PCR反应。

5.数据分析：使用荧光定量PCR软件分析PCR反应产生的荧光信号，得到目标序列的定量结果。

注意事项：1.严格控制实验室的污染，使用无核酸污染的试剂和器材，避免引物和探针的降解。

2.对于荧光定量PCR的标准曲线方法，可以使用标准品系列的不同浓度来制作标准曲线，并根据荧光信号的强度进行定量。

3.在实验过程中，建议进行阳性和阴性对照样品的实验，以确保实验结果的准确性。

4.合理选择PCR管的容量，适量调整反应体系的配比，以保证实验的稳定性和可重复性。

总结：荧光定量PCR是一种非常强大的技术，能够在基因表达调控、感染病原体检测、突变检测等多个领域发挥重要作用。

在进行荧光定量PCR实验时，我们需要设计特异性的引物和探针，并合理选择荧光染料和探针的浓度。

荧光定量PCR操作流程1.目的基因引物的合成设计合成200-300bp目的基因片段的引物，利用primer 5.0引物设计工具或者手工合成，引物合成过程中注意上下游的Tm值要相似、GC碱基在上下游的引物里均匀、引物与模板序列紧密互补、引物间避免形成稳定的二聚体或发夹结构等事项。

2 总RNA提取（1）准备研钵（灭菌）、离心管（1.5ML），枪头、手套（一次性）、异丙醇、乙醇，三氯甲烷2）取适量家蚕组织，加液氮充分研磨；匀浆加1ml RNAiso Plus后匀浆；3）室温放置5min （可在-70℃下保存1个月）4）加0.2ml氯仿（chloroform），振荡混匀，室温放置5分钟；5）12000g，15min，4℃；6）取上清（约0.6ml），加与上清等体积异丙醇，室温放置10分钟；7）12000g，10min，4℃；8）取沉淀（RNA呈胶状沉淀），加1ml 75%乙醇（可在-20℃保存1年）洗涤；9）12000g，5min，4℃；10）取沉淀，室温干燥10min；11）溶解于DEPC处理水中12）-80℃保存，尽快使用，或在8）保存。

3 反转录（TOYOBO试剂盒）Nuclease-free water up to 10ul5ⅹRT buffer 2ulRT Enzyme Mix 0.5ulPrimer Mix 0.5ulRNA 0.5-1ug4定量PCR反应（本实验室7300系统）SYBR 10ulForward Primer 1ulReverse Primer 1ulROXⅠ 0.4ulc DNA模板2ul一个模板重复三次以尽量减小误差；每个模板都要设内参。

内参是生物体或者细胞中稳定表达的基因，表达量几乎不变。

而后按照试剂盒说明操作流程设定仪器参数即可。

荧光定量PCR仪标准操作指导书1、适用范围：AGS AGS4800型实时荧光定量PCR仪。

1、双击桌面“AGS4800”快捷方式，运行程序。

打开AGS4800程序进入用户选择界面。

选择用户后，进入软件操作界面。

2、新建一个检测程序文件单击新建按钮，新建一个检测程序文件。

2.1设置热盖温度调节热盖温度(30-105℃)，默认105℃。

2.2设置试管加液量根据实际试管加液量调节加液量参数（5-100μl），默认25μl。

2.3设置扩增程序单击“添加”创建一个程序段2.4添加程序名称，设置各程序段循环数。

2.5温度设置功能按钮添加--------------------在当前温度节结尾，新建一个温度节插入--------------------在当前温度节前添加一个温度节删除--------------------将当前温度节删除2.6 样本信息录入2.6.1打开样本参数设置界面2.6.2在当前程序染料设置里，选择试剂所对应的染料。

2.6.３样本信息设置选择扩增的染料，选中要设置孔位依次输入“样本序号、样本名称、样本ID”，在荧光信息选择框中选择样本类型，若为标准品可以输入样本浓度信息。

样本浓度信息可以手工输入数值或者使用下拉选择框选取标准样品浓度信息。

最大样本浓度输入值1.00e+10。

2.6.4孔位选择单孔选择-----------------通过鼠标单击选中单个孔位。

相邻孔位选择--------------通过单击鼠标并拖动选择矩形框内相邻孔位或者先选中一个孔位，按住“Shift”功能键单击另一孔位进行选择。

不连续孔位选择---------通过按住“Ctrl”功能键进行依次追加选择孔位。

A（B）行全选----------在A（B）行开始位置单击鼠标则选中A(B)行所有孔位。

孔位全选-----------------在图示位置单击鼠标左键则全选所有孔位。

选择孔位增减-------------按住“Ctrl”键，使用鼠标单击需增加或减少的孔位。

第一部分一、基本步骤：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；2、引物、探针的设计；3、引物探针的合成；4、反应体系的配制；5、反应条件的设定；6、反应体系和条件的优化；7、荧光曲线和数据分析；8、标准品的制备；二、技术关键：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；从/网点的genbank中下载所需要的序列。

下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。

保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。

然后，再打开DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。

另一种直接用DNAstar 软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“open entrez sequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。

然后要对所有的序列进行排序。

用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“add all”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。

横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。

有时要设定比较序列的开始与结尾。

有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。

再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。

选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。

实时荧光定量PCR （Q-PCR）SOP 流程1. 实验前需要确认的信息1.1.客户提供样本的数量、编号、种属、样本来源部位1.2.样本类型（细胞或组织等）。

1.3.保存条件。

1.4.检测方法。

1.5.检测指标。

1.6.上样顺序。

1.7.试剂是否齐全。

1.8.客户基本信息：姓名、邮件地址、电话信息等。

2. 实验开始前需要准备的试剂及仪器2.1. [实验试剂][实验仪器]3. Q-PCR 实验操作流3.1.实验原理（简单描述）通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。

在实时荧光定量PCR 反应中，引入一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。

每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，可通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

3.2. 实验总体注意事项3.2.1.为得到最佳的实验结果，实验人员要尽可能减少样品间交叉污染的可能，避免将核酸从一个实验带入下一个实验。

以下措施有助于避免实验污染问题：3.2.2.用稀释的漂白剂或净化剂以及75%酒精抹擦工作台。

3.2.3.理想的条件是在指定地配有紫外灯的超净室、罩式或台式超净台中准备样品，如果没有要确保操作台的洁净。

3.2.4.在样品准备和配制反应液过程中勤换手套。

3.2.5.使用专门的移液器和枪头，勤用稀释的漂白剂清洁移液器。

3.2.6.只使用PCR 级的水和PCR 专用试剂进行PCR 实验。

3.2.7.用带旋盖的EP 管稀释和配制反应液。

3.2.8.除了注意以上事项，在进行PCR 实验时，还应准备一个无模板的对照来验证有无污染发生。

3.2.9.为最小化实验结果的统计学偏差，先制备混合反应液，建议所有样本有三个重复。

大剂量包装的反应试剂，使用前进行分装，尽量减少试剂的反复冻融。

3.3. 标准步骤:基本流程：RNA 的提取→反转录成cDNA→ 引物设计→Q-PCR的扩增3.3.1. 不同样本RNA 抽提：A 组织样本，先用液氮研磨破碎或者加TRIZOL 溶液后用匀浆机破碎。

荧光定量pcr实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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