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谷氨酸对神经元钙离子内流和凋亡的_省略_及谷氨酸受体拮抗剂保护作用的研究_李小刚

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·基础研究·谷氨酸对神经元钙离子内流和凋亡的影响及谷氨酸受体拮抗剂保护作用的研究李小刚1,朱　克2,李　楠2,马向晨2,李建国2(1.北京大学第三医院神经内科,北京100083;2.中国人民解放军总医院神经内科,北京100853)摘要:目的　探讨兴奋性氨基酸谷氨酸介导神经元钙离子内流与诱导神经元凋亡间的关系。

方法　体外培养新生大鼠皮质神经元,用原位末端标记技术显示凋亡细胞;用激光共聚焦方法来观察细胞内钙离子浓度变化;谷氨酸处理神经元造成兴奋性氨基酸毒性;用MK -801做保护研究。

结果　体外培养9d 的大多数神经细胞,用1mmol /L 谷氨酸处理后,细胞内钙离子快速增加;谷氨酸处理后细胞死亡的形式主要是凋亡。

预先用MK -801(10μmol /L )可明显的减少由谷氨酸介导的钙离子反应,并且MK -801可同时减少谷氨酸诱导的细胞凋亡。

结论　谷氨酸诱导的神经元钙离子内流与细胞凋亡有明显的关系,钙离子内流在与谷氨酸毒性导致的细胞凋亡中起重要作用。

关键词:谷氨酸;细胞培养;凋亡中图分类号:Q517 文献标识码:A 文章编号:1009-0126(2001)02-0122-04Stu dy on glutamate -induced Ca 2+influx and apoptosis -like death in cu lturedneurons and protective effect of glutamate receptor antagonistLI Xiao -gang ,ZHU Ke ,LI Nan ,et al(Depa rtment of Neur ology ,Third H osp ital ,Beijing University ,Beijing 100083,China )A bstract :Objective To clarify the relationship between neuronal Ca 2+influx and apoptosis -like death in -duced by a toxic glutamate challenge .Methods Cer ebral cortical neuronal culture ,TUNEL technique in situ for examination of apoptotic cells ,fluo -3and confocal laser micr oscopy for measurement of intracellular calcium levels ,gluta mate -induced neurotoxicity and MK -801protection were used in this study .Results In most cellscultured in vitro for 9days ,the Ca 2+increased rapidly after exposure to 1mmol /L glutamate .Glutamate in -duced death in cultured neurons was mainly apoptosis -like death .Pretr eatment of the cultured neurons with MK -801(10μmol /L )caused a marked reduction in the calcium signals generated by subsequent glutamate stimulation ,and ,further more ,MK -801could also reduce gluta mate -induced apoptosis -like death .Conclusions There is striking correlation between neur onal Ca 2+influx and apoptosis -like death induced by a toxic gluta -mate challenge .These data suggest that Ca 2+influx plays a major role in apoptosis -like death associated with glutamate toxicity .Key words :glutamic acid ;cell culture ;apoptosis 收稿日期:2000-11-09作者简介:李小刚,男,1964年11月生,江西省南丰县人,主治医师,博士,从事神经病学专业。

谷氨酸是脑组织内主要的兴奋性氨基酸,在某些情况下,对神经元也有毒性作用[1]。

有学者认为,兴奋性毒性是脑卒中、低血糖、癫痫、Huntington 病和Alzheimer 病[2]的发病机制。

谷氨酸及其化合物所致的神经元损害可能是由于过度刺激受体的结果,而钙离子在这个过程中起关键作用,细胞内钙离子超载介导N -甲基-D -门冬氨酸(NMDA )受体过度刺激引起细胞死亡。

虽然已提出钙离子和钠离子内流增加、自由基的产生、代谢酶的破坏、细胞膜衰竭及细胞骨架的破坏等学说[1],但兴奋性氨基酸引起的神经细胞死亡的机制仍不清楚。

早期研究认为,兴奋性毒性导致的细胞死亡的形式是坏死[1]。

然而,近来研究结果证明,有些细胞死亡实际上是凋亡[3,4]。

细胞死亡的模式决定于损伤的程度[5]。

这种不一致性可能是由于同时存在坏死和凋亡[4,5]。

我们用新生大鼠原代培养的皮质神经元、激光共聚焦显微镜、Fluo -3荧光染色、TUNE L 法等技术重点研究谷氨酸处理后,单个神经元早期细胞内钙离子变化和形态改变及谷氨酸受体拮抗剂MK-801的保护作用。

1　材料和方法1.1　材料　程序性细胞死亡检测试剂盒(德国Boehringer公司):试剂盒包括TdT酶、含生物素化duTP缓冲液,含NBT和BCIP底物的显色液、含链亲合素化的碱性磷酸酶(HRP-streptavidin)的反应液等; Fluo-3-AM、Triton X-100、L-谷氨酸、MK-801(美国Sig-ma公司);HE PE S(德国B oehringer公司);D ME M培养液(美国Gibco-BRL公司)。

1.2　细胞培养　取出生1～2d的Wistar大鼠(二级),在无菌条件下断头、取脑,分离出双侧皮质,置于0.125%胰蛋白酶消化液中,在37℃、5%CO2条件下孵育30min,用细口径滴管吹打数次,以种植培养液稀释成5×106个细胞/ml密度,接种于涂有多聚赖氨酸(50mg/L)的96孔板和含盖玻片的(18mm×18mm)玻璃培养皿(直径35m m,2ml/每皿)中,置标本于37℃、5%CO2培养箱中。

细胞培养液含80% DMEM培养液、10%马血清、10%胎牛血清、葡萄糖6g/L、苄基青霉素100kU/L和链霉素100mg/L。

接种第3天,在血清培养液中加入细胞分裂抑制剂阿糖胞苷(10μmol/L)以抑制非神经细胞的过度增殖。

48h后更换新鲜饲养液。

以后每周换液2次,每次更换一半新鲜饲养培养液。

用NSE单克隆抗体免疫组化染色证明细胞是神经元。

培养第9天开始做谷氨酸实验。

1.3　凋亡细胞的检测　原位凋亡细胞的检测用TUNEL技术稍做改动[6]。

在盖玻片上培养的神经细胞用4%多聚甲醛在4℃固定2h,用10mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)冲洗,加入20mg/L蛋白酶K,室温30min,PBS洗5min,加入0.3%H2O2(甲醇溶解),PBS洗2次,加0.1%Triton X-100(0.1%醋酸钠配制),冰浴2min,PBS洗2次,凉干,加TUNEL反应液(1μl TdT+9μl含Biotin-dUTP缓冲液),置湿盒中,37℃,60min(阴性对照组不加酶);加入显色液,置于暗盒中60min,0.5%甲基绿复染20s,二甲苯透明,明胶封片,显微镜下观察有蓝紫色颗粒者为阳性。

在显微镜下记数凋亡细胞。

1.4　Fluo-3测定细胞内钙离子的含量　激光共聚焦显微镜(美国Meridian公司)培养的细胞用含AM 的Fluo-3(10μmol/L)在室温(26℃)染色2h。

用含钙、镁的PBS洗3次后,将96孔培养板放入激光共聚焦显微镜扫描平台。

在40倍长工作距离的物镜下动态观察Fluo-3指示钙离子的变化。

在时间序列程序下,开始预扫描。

在对照的图像确定后,立即用微量加样器将少量1mmol/L谷氨酸加入培养孔中,神经元的荧光图像每4s记录1次,共250s,并绘制出细胞内Fluo-3的荧光强度在加药后随时间变化的曲线。

在保护实验中,MK-801(10μmol/L)在用谷氨酸之前5min加入。

2　结　果2.1　培养神经元用谷氨酸处理后凋亡细胞的结果　在对照组中,可观察到少数染色阳性的细胞,与用相似方法培养的神经元中持续少量细胞死亡一致。

培养神经元在1mmol/L谷氨酸处理后24h,染色阳性的细胞与非凋亡细胞相比,在显微镜下可见浓缩和核裂解,(56±3)%(计15个视野)表现为染色阳性的细胞。

预先用10μmol/L MK-801后,染色阳性的细胞为(11±1)%(共进行4批实验,P<0.05)。

2.2　谷氨酸导致细胞内钙离子快速增加　用Fluo-3染色后用激光共聚焦显微镜观察钙离子浓度。

当加入1mmol/L谷氨酸时,80%以上的细胞(观察30个视野)显示Fluo-3的荧光强度增加,经校正后绘制荧光强度的时间曲线向上,说明钙离子增加。

尽管谷氨酸持续存在,但信号强度在数分钟内减弱。

在这个反应中,MK-801完全阻断Fluo-3这种荧光强度的增加。

3　讨　论在本研究中,我们用原位末端标记法,在谷氨酸处理后24h可见大多数聚集在一起的死亡细胞表现为凋亡样形态,由于MK-801能明显地减少这些染色阳性的凋亡细胞,因此,这种由谷氨酸诱导的细胞凋亡很可能是通过谷氨酸受体介导的。

应用共聚焦显微镜,我们检测到谷氨酸诱导神经元内的钙浓度快速增加,细胞质和细胞核内的钙离子都增加。

这种反应可被MK-801抑制,表明钙离子的增加依赖细胞外离子的存在,说明由谷氨酸诱导的钙离子增加可激活核酸内切酶,导致神经元内DNA断裂。

本研究结果显示,谷氨酸对神经元有兴奋性毒性,与以往的研究结果一致[7],虽然兴奋性毒性的浓度、处理的时间及神经元的成熟等会影响神经元变性的最大程度。

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中药单体及有效部位的神经保护作用机制研究进展

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中药单体及有效部位的神经保护作用机制研究进展摘要:从清除自由基、对抗谷氨酸毒性、抑制胞内Ca^2＋超载和NO生成、干预细胞凋亡、拟雌激素作用等诸方面，综述中药单体和有效部位的神经保护作用机制研究进展.关键词:中药单体有效部位神经保护作用机制Advances in the Mechanistic Study on Neuroprotective Actions of the Monomers and Active Components from Chinese Traditional MedicinesAbstract:Advances in the mechanistic study on neuroprotective actions of monomers and active components from Chinese traditional medicines were reviewed, which included free radical scavenging, resistance against glutamate-induced excitotoxicity, inhibition of cellular Ca^2＋ overload and NO production, intervention in cell apoptosis and estrogen-like activity.Key words:Chinese traditional medicine; Monomer; Active component; Neuroprotective; Mechanism of action在缺血、缺氧条件下，大脑神经组织会发生一系列的缺血瀑布级联反应，如自由基的大量释放、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸损伤、炎性过程及凋亡等，它们发生在不同的时段，彼此交叉，相互联系。

缺血性脑卒中的神经保护则是对级联反应的各个环节加以影响和控制，对受到损伤的神经组织予以积极保护或修复，避免相邻正常的神经组织进一步受到损伤，挽救损伤的神经组织，并使之恢复或部分恢复原有功能。

离子型谷氨酸受体途径-概述说明以及解释

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离子型谷氨酸受体途径-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述离子型谷氨酸受体途径是神经递质谷氨酸通过作用在神经元膜上的离子通道蛋白而引发的一种信号传导机制。

离子型谷氨酸受体在神经元的兴奋性调节、突触传递以及神经元间的相互作用中发挥着重要作用。

本文将首先介绍离子型谷氨酸受体的定义与特点，然后探讨其在神经传导中的作用，最后分析离子型谷氨酸受体途径在疾病治疗中的潜在应用。

通过对离子型谷氨酸受体途径的系统阐述，有助于深入了解神经递质传导的机制，为相关疾病治疗提供新的思路和方法。

1.2 文章结构本文将首先介绍离子型谷氨酸受体的定义与特点，对其在神经传导中的作用进行详细探讨。

接着，将分析离子型谷氨酸受体途径在疾病治疗中的应用，并对其在这一领域的发展进行展望。

最后，总结离子型谷氨酸受体途径的重要性，并对其未来发展提出建议，以期为相关研究和临床应用提供参考。

}}}请编写文章1.2 文章结构部分的内容1.3 目的：本文旨在全面介绍离子型谷氨酸受体途径在神经系统中的重要作用，并探讨其在疾病治疗中的潜在应用。

通过深入研究离子型谷氨酸受体的定义、特点以及神经传导中的作用机制，我们将更好地了解神经递质的传导过程和神经元之间的相互作用。

同时，探讨离子型谷氨酸受体途径在治疗神经系统疾病如癫痫、帕金森病等方面的应用，将有助于拓展新的治疗途径和药物设计思路。

通过本文的阐述，希望读者能够深入了解离子型谷氨酸受体途径的重要性，并为未来疾病治疗的研究和发展提供参考和启示。

2.正文2.1 离子型谷氨酸受体的定义与特点:离子型谷氨酸受体是一类参与神经递质谷氨酸在神经元间传递的重要蛋白质通道，在神经系统中扮演着至关重要的角色。

这些受体通常由四个亚基组成，每个亚基都具有离子通道的特性，可以对荷带正电荷的离子（如钠、钾、钙等）进行选择性通透。

离子型谷氨酸受体主要分为NMDA受体、AMPA受体和kainate受体三类。

NMDA受体是最为研究广泛的一种离子型谷氨酸受体，其特点在于对于钙离子的通透性较高，参与了突触的可塑性、学习记忆等功能。

青光眼与谷氨酸、细胞凋亡的研究

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青光眼与谷氨酸、细胞凋亡的研究摘要：人们在对青光眼病症的研究中，发现神经损害是以视网膜神经节细胞凋亡的形式发生的，从而造成青光眼神经损害，也就是说，谷氨酸是视网膜神经节细胞凋亡的主要因素。

如今，基因表达跟视网膜神经节细胞的凋亡之间关系还没有起步，当前认为ca2+内流与谷氨酸的释放有可能促进神经营养素的转变，而no、神经营养素、氧自由基可能控制谷氨酸的释放，而ca2+、谷氨酸、自由基、no又成为刺激凋亡的因素，运用一定的信息传递把凋亡的基因激活，从而触发了凋亡。

开展受体抑制剂与谷氨酸的研究就有打破此循环的可能，以此保护视网膜神经节细胞。

从凋亡机制做为开端开展研究，会促进青光眼研究的深入发展。

关键词：青光眼谷氨酸凋亡【中图分类号】r4 【文献标识码】a 【文章编号】1008-1879（2012）11-0015-01青光眼属于常见难病症，它发病非常迅速，随时即可导致患者失明，所以危害性大，受到国内外眼科专家的高度关注。

青光眼的特征为眼内压间断性或者持续性升高的水平超过眼球所能耐受的程度而造成视功损害，在急性期最早二十四小时内就会造成完全失明的危险。

是视神经损害范畴的常见疾病。

我们知道，视神经包括许多神经纤维，一旦眼内压增高，就完全有可能使神经纤维受到损害，造成视野缺损。

青光眼的病因非常复杂，所以，其临床表现更具多变性，其中包括急性闭角型、亚急性闭角型、慢性闭角型、开角型青光眼。

一般情况下在幼儿出现临床表现的青光眼为先天性青光眼，三岁以前发病，通常会产生溢泪、眼睑痉挛、羞明和大角膜，三岁后发病的青光眼则为进行性近视。

据调查，我国青光眼的发病率为1%。

当前，我国对青光眼的发病机理及诊治方法研究在国际处于较领先水平，青光眼病症研究也成为眼科领域的重点，由于青光眼的病因，特别是发病机制依然不十分清楚，所以到目前为止，眼压也依然是眼科关注的核心和重点，并且从视神经损害角度出现二种学说，即血流说和机械学。

血流说认为是由于视乳头的血流异常面是导至的青光眼。

缺氧对谷氨酸能和GABA能突触传递的影响

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缺氧对谷氨酸能和GABA能突触传递的影响李晶;杜永平;张月萍【摘要】Neurons in the mammalian central nervous sysytem (CNS) are highly sensitive to the availability of oxygen. Hypoxia alters synaptic transmission in a few minutes. Both glutamatergic and γ-aminobutyric acid (GABA)ergic synaptic transmissions respond to hypoxic exposure with prominent modification. Glutamate receptors, GABA receptors, adenosine receptor, and some endogenous neuromodulators are involved in the preservation of neuron function. Since the neuroprotection in all hypoxic tolerant species examined so far relies on significant increase in GABA and decrease in glutamate , it may be an important strategy to make a moderate balance of glutamate/GAB A synaptic transmission against hypoxic insults.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2013(029)002【总页数】5页(P371-375)【关键词】缺氧;突触传递;谷氨酸;γ-氨基丁酸【作者】李晶;杜永平;张月萍【作者单位】第四军医大学西京医院儿科脑发育研究室,陕西,西安,710032;第四军医大学西京医院儿科脑发育研究室,陕西,西安,710032;第四军医大学西京医院儿科脑发育研究室,陕西,西安,710032【正文语种】中文【中图分类】R329.21突触传递在神经元信号传递过程中发挥重要作用。