茶树查尔酮异构酶基因克隆及序列分析

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茶树紫阳种RbcL基因片段的克隆与序列分析

茶树紫阳种RbcL基因片段的克隆与序列分析张妍;杨金宏【摘要】RbcL基因是绿色植物进行光合作用的关键基因,其序列是分子系统学研究中使用最为广泛的分子标记之一.利用PCR扩增和测序,获得了茶树紫阳种RbcL 基因744 bp的序列.对来自山茶科7个样品的RbcL序列进行比对和系统聚类分析.结果显示,山茶属的白毛变种、金花茶和丹寨秃茶首先与紫阳茶聚合,其他山茶科植物位于核心聚类群的外围.以大头茶RbcL基因为参照,进行山茶属植物SNP位点的分析,结果显示,在所比对的744 bp的序列中,山茶属共存在10个SNP位点,其中,同义替换4个,非同义替换6个.【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2016(044)012【总页数】4页(P1772-1775)【关键词】茶树紫阳种;RbcL基因;序列分析【作者】张妍;杨金宏【作者单位】安康学院现代农业与生物科技学院,陕西省蚕桑重点实验室,陕西安康725099;安康学院现代农业与生物科技学院,陕西省蚕桑重点实验室,陕西安康725099【正文语种】中文【中图分类】S571.1DNA条形码（DNA barcoding）是根据生物的遗传物质序列种内变异小于种间变异而实现物种鉴定的一种方法[1]。

通过利用1个或几个DNA片段序列对物种进行识别和鉴定，具有快速、准确、客观性强的特点，可以避免在传统鉴定方法中人为因素所造成的主观误判，能够提高鉴定的效率和准确性。

RbcL基因的编码蛋白是1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（RuBisCo）的活性中心，在光合和光呼吸过程中起重要作用，其含量占绿色植物叶片总蛋白的50%，是自然界中含量最丰富的蛋白质[2]。

RbcL基因不具有内含子，位于叶绿体基因组的大单拷贝区（LSC），以单拷贝形式存在，已经被广泛应用在绿色植物的系统进化研究中。

迄今为止，已经测定了被子植物、裸子植物、苔藓、海藻、光合细菌等多种不同材料中的RbcL基因序列[3]。

茶树CsMCC1和CsMCC2基因的克隆及表达特征性分析

茶树CsMCC1和CsMCC2基因的克隆及表达特征性分析代洪苇;刘洁强;张丽;童华荣;袁连玉【期刊名称】《作物学报》【年(卷),期】2024(50)3【摘要】组蛋白乙酰化修饰由组蛋白乙酰化酶(histone acetyltransferases,HATs)和脱乙酰化酶(histone deacetylase,HDACs)共同催化完成,是重要的表观遗传调控方式之一,在植物生长发育、逆境胁迫响应和激素响应的调控过程中均具有重要意义,但对茶树(Camellia sinensis)组蛋白乙酰化修饰的研究还比较少。

本研究从‘福鼎大白茶’茶树中克隆获得了2个HATs家族的MCC(MEIOTIC CONTROL OF CROSSOVERS)基因:CsMCC1和CsMCC2,通过生物信息学分析、实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative PCR,qRT-PCR)和亚细胞定位试验对其功能进行解析。

结果显示,CsMCC1和CsMCC2基因分别位于茶树1号和7号染色体,分别编码257 aa和269 aa,均属于碱性不稳定亲水性蛋白,与拟南芥AtMCC1具有高度相似的基因结构和蛋白空间结构。

系统进化树和保守结构域分析表明,CsMCC蛋白与葡萄、番茄的同源蛋白有较近的亲缘关系,MCC蛋白序列高度保守,均含有GNAT保守结构,属于HAT蛋白的GNAT(GCN5-related N-terminal acetyltransferases)亚家族。

拟南芥原生质体亚细胞定位结果显示,CsMCC1和CsMCC2蛋白均定位于细胞质膜。

启动子分析显示,在CsMCC1和CsMCC2基因启动子中包含多个与胁迫、光和植物激素调节响应相关的元件。

转录组数据和表达分析发现,CsMCC1基因在叶、花和根发育早期的表达量明显高于后期;CsMCC2基因在茶树根部有最高表达,并在根部发育的较长阶段均有较高水平的表达量;2个CsMCC基因均能够被多种非生物胁迫(干旱、盐和冷)和外源激素(MeJA、GA3和IAA)诱导表达。

茶树基因组与测序技术的研究进展

茶叶科学 2021，41（6）：743~752Journal of Tea Science 收稿日期：2021-07-27 修订日期：2021-08-31基金项目：福建省“2011协同创新中心”中国乌龙茶产业协同创新中心专项（闽教科〔2015〕75号）、福建农林大学茶产业链科技创新与服务体系建设项目（K1520005A01）作者简介：王鹏杰，男，博士，主要从事茶树遗传育种与生物技术研究。

*通信作者：********************；**************茶树基因组与测序技术的研究进展王鹏杰1,2，杨江帆1，张兴坦1,2*，叶乃兴1*1．福建农林大学园艺学院，茶学福建省高校重点实验室，福建福州 350002；2. 中国农业科学院深圳农业基因组研究所，广东深圳 518120摘要：茶树具有高度杂合、基因组庞大及高度重复等特点，这导致茶树基因组的前期研究进展缓慢。

基因组测序技术的迅速发展有力推动茶树基因组的解析与完善。

综述了基因组测序技术的发展，将近年来茶树基因组的组装与研究进展按照草图水平、染色体水平和单体型水平进行分类，探讨茶树基因组未来的应用与发展方向，为茶树功能基因组学研究和精确分子育种提供参考。

关键词：茶树；测序技术；基因组；染色体水平；单体型中图分类号：S571.1；Q52 文献标识码：A 文章编号：1000-369X(2021)06-743-10Research Advance of Tea Plant Genomeand Sequencing TechnologiesWANG Pengjie 1,2, YANG Jiangfan 1, ZHANG Xingtan 1,2*, YE Naixing 1*1. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Key Laboratory of Tea Science at Universities in Fujian, Fuzhou 350002, China;2. China Agricultural Genome Institute at Shenzhen, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shenzhen 518120, ChinaAbstract: The tea plant has the characteristics of high heterozygosity, large genome and high duplication, which has led to the slow progress of the preliminary research on the tea plant genomes. The rapid development of genome sequencing technologies has strongly promoted the deciphering and improvement of the tea plant genomes. This article reviewed the development of genome sequencing technologies, and classified the assembly and research progress of tea plant genomes in recent years according to the draft level, chromosome level and haplotype level. By discussing the future application and development direction of tea plant genomes, it provided a reference for the functional genomics research and precision molecular breeding in tea plants.Keywords: Camellia sinensis , sequencing technology, genome, chromosome level, haplotype茶树[Camellia sinensis (L.) O. Kuntze]是我国重要的经济作物，我国是世界上最早栽培茶树和利用茶叶的国家[1]。

茶树体胚APX基因克隆及其在体胚发生过程中的表达与酶活性分析

GUO Yuqiong1, HUANG Daobin1,2, LI Xiaozhen1, ZHU Chen1,2, ZHANG Shuting1,2, FU Haifeng1, ZHOU Chengzhe1, OUYANG Mingqiu1, CHEN Lan1, LAI Zhongxiong1,2*
1. 福建农林大学园艺学院，福建福州 350002；2. 福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建福州 350002
摘要以铁观音茶树体胚为材料，克隆了茶树抗坏血酸过氧化物酶基因 CsAPX（Genbank 登录号为 MG799534.1）。
CsAPX 基因包含一个长度为 753 bp 的开放阅读框（ORF），共编码 250 个氨基酸，并对其进行相关生物信息学分析。
收稿日期基金项目
作者简介
2018-07-30；修回日期 2019-03-05 福建省自然科学基金项目（No. 2018J01701）；福建农林大学科技创新专项基金项目（No. CXZX2017164，No. CXZX2018069）；福建省高原学科建设经费项目（No. 102/71201801101）。郭玉琼（1974—），女，博士，副教授，研究方向：茶树生物技术与茶叶生物化学。*通信作者（Corresponding author）：赖钟雄（LAI Zhongxiong），Email：laizx01@。
APX 酶活性测定结果表明在球形胚至子叶胚阶段 APX 酶活性呈现下降趋势，并在子叶胚阶段到达最低值，随着体胚进
一步的分化，在子叶胚、成熟胚和萌发胚阶段，茶树 APX 酶活性不断上升，总体呈“先降后升”的趋势。在体胚发生
过程中 CsAPX 基因的表达分析显示，CsAPX 基因在茶树体胚发生的 5 个阶段均存在显著差异表达，总体呈“升—降—

我国茶树遗传育种的一项重要突破浙江大学茶学系克隆茶树多酚氧化酶基因获得成功

我国茶树遗传育种的一项重要突破浙江大学茶学系克隆茶树多
酚氧化酶基因获得成功
徐波
【期刊名称】《茶叶》
【年(卷),期】2001(027)003
【摘要】@@ 日前,在浙江大学博士学位论文答辩会上,茶学系在职博士研究生赵
东的博士论文“茶树多酚氧化酶基因的克隆和转化系统的研究”得到了专家的高度评价.该项研究采用nest PCR技术在国际上首次成功地克隆出与茶叶品质、人体健康密切相关的茶树多酚氧化酶基因,并在GenBank(美国国家生物技术信息中心核
苷酸数据库)登录,开创了我国茶树育种研究的新领域.
【总页数】1页(P60)
【作者】徐波
【作者单位】浙江大学新闻办公室
【正文语种】中文
【中图分类】S571.1
【相关文献】
1.我国茶树遗传育种研究获得重大突破 [J],
2.茶树多酚氧化酶基因的克隆及其序列比较 [J], 赵东;刘祖生;奚彪
3.我国茶树遗传育种研究获得重大突破 [J], 无
4.我国科学家在龙井茶树品种基因组组装和茶树起源演化研究上取得重要突破 [J],
5.茶树CsCHLI基因的克隆及其在不同叶色白化茶树中的表达分析 [J], 赵逸清;刘政均;张田鑫;赵彦婷;肖斌;高岳芳
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茶树CsGPX基因全基因组鉴定和表达分析

热带作物学报2019, 40(6): 1130 1137 Chinese Journal of Tropical Crops收稿日期 2018-10-11；修回日期 2019-02-21基金项目福建农林大学科技创新专项基金项目“乌龙茶工艺生理分析”（No. CXZX2016102）；“乌龙茶加工体系技术创新及茶类创衍应用研究”（No. CXZX2017350）。

作者简介王赞（1992—），男，硕士研究生，研究方向：茶叶加工和综合利用。

*通信作者（Corresponding author ）：郭雅玲（GUO Yaling ），E-mail ：******************。

茶树CsGPX 基因全基因组鉴定和表达分析王赞，曹红利，岳川，郭雅玲*福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室，福建福州 350002摘要为明确茶树谷胱甘肽过氧化物酶（CsGPX ）基因与非生物胁迫的关系，本研究利用生物信息学手段在茶树基因组中筛选得到3条CsGPX 基因，对其编码蛋白理化性质、基因结构、系统进化树、顺式作用元件进行了分析。

结果表明，CsGPX 包含完整GPX 结构域和3段保守序列，都具6个外显子。

预测启动子上有参与植物激素和非生物胁迫响应的顺式作用元件。

使用实时荧光定量PCR 测定该基因的表达谱，发现它们在不同组织中的表达有显著差异。

进一步分析表明，CsGPX 被低温、ABA 、盐以及干旱处理上调表达，但CsGPX 2和CsGPX 3的表达受低温抑制。

本研究为茶树CsGPX 家族基因克隆和功能验证提供基础。

关键词茶树；谷胱甘肽过氧化物酶（GPX ）；非生物胁迫中图分类号 S571.1 文献标识码 AGenome-wide Identification and Expression Analysis of CsGPX Gene in Tea Plant (Camellia sinensis )WANG Zan, CAO Hongli, YUE Chuan, GUO Yaling *College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University / Key Laboratory of Tea Science in Universities in Fujian, Fuzhou, Fujian 350002, ChinaAbstract To reveal the possible involvement of glutathione peroxidase genes (CsGPX ) in the responses of tea plants to abiotic stresses, three CsGPX genes were identified by bioinformatics tools from the tea genome data, and the gene structures, the cis-elements on their promoters, the physiochemical characteristics of the encoded proteins and the phy-logenetic trees were also studied. The results showed that all the CsGPX genes contained 6 exons and shared the gene family-specific GPX domain in addition to three other conserved domains. Cis-elements for the responses of plants to hormones and abiotic stresses were identified on the promoters. Quantitative real-time PCR analysis of the expression profiles revealed that they were significantly different in expression in different tissues. Further analysis showed that the three C sGPX genes were, in general, up-regulated by treatments of low temperature, ABA, salt and drought except that CsGPX 2 and CsGPX 3 were down-regulated by treatment of low-temperature. The results should have laid down a basis for further characterization of CsGPX family genes in tea plant.Keywords tea plant (Camellia sinensis ); glutathione peroxidase (GPX); abiotic stress DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.06.014生长环境造成的非生物胁迫是农作物减产、品质下降的重要因素[1]。

香石竹查尔酮合酶基因克隆植物反义表达载体构建论文

香石竹查尔酮合酶基因的克隆与植物反义表达载体的构建【中图分类号】r943【文献标识码】a【文章编号】1672－3783(2011)06－0002－02【摘要】根据已发表的查尔酮合酶(chs)基因的序列，设计一对引物，以香石竹品种 master 的总cdna为模板,扩增出香石竹查尔酮合酶基因全阅读框架序列，以pgem-t为中间载体，序列检测的结果显示同henkel,j.等在ncbi的基因库中发表的从香石竹品种“clove pink”花瓣中提取的chs基因全开放阅读框序列一致。

将序列反义克隆到双元载体pbi-121上，并导入农杆菌中，经pcr 及酶切分析鉴定，结果表明该片段的反义序列已克隆于载体中。

【关键词】查尔酮合酶植物反义表达载体基因克隆花色的形成与植物体内一类次级代谢产物类黄酮有关。

在花色形成中起最主要作用的是花色素。

花色素在花瓣中含量的增高或降低都可能改变花的颜色[1]。

查尔酮合酶(chalcone synthase,chs)是花色素合成中的一个关键酶,它催化丙二酰辅酶a的3个乙酸基和对羟基苯丙烯酰辅酶a的一个乙酸基的缩合,产生柚配基查尔酮[2]。

反义ｒｎａ（antisense rna ）技术是通过人工导入反义ｒｎａ,调控细胞内某些基因的表达,从而定向控制某些生物性状。

该项技术在基因功能研究、恶性生长控制、人工免疫及植物基本功能等方面的作用日渐显著。

反义ｒｎａ技术可以专一性地调节某一基因的活动,进一步了解这个基因的作用,这对研究未知基因的功能和表达情况提供了思路和途径,也为人类控制基因活动提供了方法。

由于反义ｒｎａ主要作用于转录水平,所以它可以避免二倍体生物同源基因互补而产生的困难。

此外,反义ｒｎａ对基因的调节不会改变目的基因的结构,在应用上更为安全。

为此,近年来利用反义ｒｎａ技术在花卉的品质改良上取得了很有价值的成果[3]。

在植物中，chs组成了一个多基因家族，具有8—10个成员，位于两个不同染色体上[4]，并且其正常表达主要集中于花组织中（花冠和花药）[5]。

茶树CsASR基因的克隆及其表达分析

茶叶科学 2017，37（4）：399~410Journal of Tea Science投稿平台：茶树CsASR基因的克隆及其表达分析岳川1,2，曹红利1,2，郝心愿2，郭玉琼1，叶乃兴1，王新超2*，杨亚军2*1. 福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室/中国乌龙茶协同创新中心，福建福州 350002；2. 中国农业科学院茶叶研究所/国家茶树改良中心/农业部茶树生物学与资源利用重点实验室, 浙江杭州 310008摘要：逆境胁迫影响茶树生长发育及茶叶品质，ASR（abscisic acid, stress, ripening-induced）基因在植物抗逆响应中具有重要功能。

本研究以龙井43品种茶树为材料，从中克隆了CsASR基因的全长cDNA序列、基因组序列及其启动子序列，分析了该基因的生物信息学特征及在组织间和不同胁迫处理下的表达模式。

结果显示，CsASR的cDNA序列全长875 bp，含有546 bp的ORF序列，编码181个氨基酸，蛋白质分子量19.89 kD，理论等电点 5.69；CsASR蛋白结构序列中74.5%的序列为无序结构，是一种无序蛋白；CsASR的C-端含有ABA/WDS功能结构域，主要定位于细胞质和细胞核中；茶树CsASR与海枣的ASR相似性最高，为87%，而在进化树中与枣的关系最近。

CsASR基因含2个外显子，第1个外显子长363 bp，第2个外显子长183 bp，内含子较大为2 750 bp，内含子中含7种简单重复序列和2种DNA转座子序列。

克隆获得起始密码子ATG上游2 554 bp的启动子区序列，该启动子上含有干旱、低温、高温以及ABA等相关的顺式作用元件。

CsASR在根中的表达量最低；ABA抑制CsASR的表达，而干旱、NaCl和低温胁迫能够显著上调CsASR的表达。

表明CsASR基因可能与茶树抗逆密切相关。

关键词：茶树；ASR基因；逆境胁迫；基因克隆中图分类号：S571.1；Q52 文献标识码：A 文章编号：1000-369X（2017）04-399-12Cloning and Expression Analysis of CsASR Gene inTea Plant (Camellia sinensis)YUE Chuan1,2, CAO Hongli1,2, HAO Xinyuan2, GUO Yuqiong1,YE Naixing1, WANG Xinchao2*, YANG Yajun2*1. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Tea Science in Universities of Fujian Province/Collaborative Innovation Center of Chinese Oolong Tea Industry, Fuzhou 350002, China;2.Tea Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, National Center for Tea Improvement, Key Laboratory of Tea Plant Biology and Resources Utilization,Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, ChinaAbstract: Abiotic stress severely affects the growth and development of tea plant and the quality of tea. ASR (abscisic acid, stress, ripening) genes play crucial roles in the plant response to stresses. The full-length cDNA, genomic sequence and the promoter sequence of CsASR gene were cloned from tea cultivar Longjing 43 in this study, The bioinformatic and the expression analysis of CsASR in tissues under different stress treatments were performed. The results revealed that the full-length cDNA of CsASR was 875 bp, containing a 546 bp ORF encoding 181 amino acid. The predict protein molecular and theoretic isoelectric point of CsASR were 19.89 kD and 5.69. Most regions收稿日期：2017-04-10 修订日期：2017-05-14基金项目：国家自然科学基金（31600555）、福建省自然科学基金项目（2017J01616）、国家茶叶产业技术体系（CARS-23）作者简介：岳川，男，讲师，主要从事茶树种质资源利用与茶叶品质调控研究。

茶树脱落酸β-葡萄糖基转移酶基因CsAOG的克隆和表达分析

茶树脱落酸β-葡萄糖基转移酶基因CsAOG的克隆和表达分析王雷刚;孙琪璐;吴峻琪;蒋家月;李叶云;江昌俊【期刊名称】《安徽农业大学学报》【年(卷),期】2018(45)5【摘要】脱落酸(ABA)β-葡萄糖基转移酶(abscisate beta-glucosyltransferase)是ABA分解代谢途径中的关键酶,在维持植物体内ABA正常生理水平上发挥着重要作用。

通过RACE法克隆了茶树中ABAβ-葡萄糖基转移酶基因CsAOG,NCBI登录号为MF370238。

CsAOG全长为2 108 bp,ORF大小为1 443 bp,无内含子,该基因编码480个氨基酸,分子量约为53.26 kDa,等电点为5.58,亚细胞定位于细胞质。

CsAOG蛋白具有葡萄糖基转移酶(UDPGT)保守结构域。

通过MEME分析工具在CsAOG序列中获得了9个保守元件。

由系统进化和蛋白互作分析可知,CsAOG位于UGT73分支,且UGT73B4与UGT73B5的互作最强。

实时荧光定量结果表明,叶中CsAOG表达水平最高,根部次之,茎中最低;在越冬期间,乌牛早CsAOG表达量先上调后下调,最后维持在较低水平;舒茶早和黄山早芽CsAOG表达量呈下调趋势。

赤霉素处理后,乌牛早CsAOG表达量上调;高温胁迫后CsAOG 表达量呈先升后降的趋势,12 h时表达量最高,而低温胁迫时表达量变化不大。

通过对CsAOG基因的研究,为理解ABA在调控茶树生长发育和抗逆机制中的作用提供了理论基础。

【总页数】7页(P783-789)【作者】王雷刚;孙琪璐;吴峻琪;蒋家月;李叶云;江昌俊【作者单位】安徽农业大学茶与食品科技学院茶树生物学与资源利用国家重点实验室【正文语种】中文【中图分类】S571.1【相关文献】1.茶树丙氨酸氨基转移酶基因的克隆与表达分析2.茶树DNA甲基转移酶基因CsDRM2的克隆及表达分析3.茶树类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因的克隆和表达分析4.茶树DNA甲基转移酶基因CsDRM2的克隆及表达分析5.铁观音茶树甘油-3-磷酸酰基转移酶(CsGPAT)基因克隆及萎凋过程中的表达分析因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

茶树赤霉素受体基因CsGID1a的克隆与表达分析

1
National Center for Tea Improvement, Tea Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2 Graduate
School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3 College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China
作物学报
ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(4): 599608 ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9
/zwxb/ E-mail: xbzw@
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00599
SLY1/GID2 [1]
件—赤霉素受体 GID1 为突破口, 克隆了茶树赤霉素受体(CsGID1a)全长 cDNA, 并对其进行生物信息学和表达模式分析, 为进一步研究赤霉素在茶树越冬芽解休眠过程中的作用奠定 RNA 提取供试材料为特早生国家级茶树品种龙井 43, 种植于中国农业科学院茶叶研究所内国家种质杭州茶树圃。采摘后以液氮速冻并迅速置 –80℃ 冰箱保存待用。 SMART RACE cDNA Synthesis Kit 和 Advantage Polymerase Mix 为 Clontech 公司产品(Mountain View, CA, USA), Prime Script RT reagent Kit、大肠杆菌 TG1 感受态细胞、 Taq 酶购自 Takara 公司 (大连 ), 克隆载体 PCR2.1 vector、逆转录酶 SuperScriptⅢ 购自 Ivitrogen 公司 (Carlsbad, USA), 琼脂糖凝胶回收试剂盒购自 Axygen 公司 , RNA 提取试剂盒购自天根公司 (Tiangen, 北京 ) 。其余试剂均为国产分析纯。参照王新超等 [15]的方法提取茶树总 RNA。

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茶叶科学 2007，27（2）：127~132Journal of Tea Science收稿日期：2006-10-30 修订日期：2006-12-30 基金项目：国家863计划（2006AA10Z171）、浙江省“钱江人才”计划项目（2006R10042）、浙江省重点科技项目（2004C22033）、人事部和教育部留学回国人员科研基金（2005-134，2005-383）内容之一作者简介：马春雷（1982— ），男，黑龙江人，硕士研究生，从事茶树分子生物学研究。

*通讯作者: liangchen@茶树查尔酮异构酶基因克隆及序列分析马春雷1,2，赵丽萍1，张亚丽1,2，陈亮1*（1. 中国农业科学院茶叶研究所茶树资源和遗传改良与分子生物学实验室，浙江杭州 310008；2. 中国农业科学院研究生院，北京 100081）摘要：茶叶是世界上最流行的无酒精饮品之一，含有许多有价值的次生代谢产物，如儿茶素类物质。

分离和克隆重要的茶树功能基因，对利用基因工程技术进行茶树遗传调控具有重要意义。

本文采用EST 测序技术和T 4RNA 连接酶介导的5′RACE 技术，获得了一个茶树儿茶素代谢中的重要基因—查尔酮异构酶（CHI ）基因，在GenBank 登录（DQ904329），其序列全长1 163 bp ，其中开放阅读框长723 bp ，编码240个氨基酸，3′端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号，推测的蛋白分子量约为26.4 kD ，理论等电点为5.19。

序列分析表明它与番茄CHI 基因序列的亲缘关系比较近。

关键词：茶树；查尔酮异构酶；基因克隆；序列分析中图分类号：S571.1，Q523 文献标识码：A 文章编号：1000-369X （2007）02-127-06Molecular Cloning and Sequence Analysis of Chalcone Isomerase Gene of Tea Plant (Camellia sinensis )MA Chun-lei 1,2, ZHAO Li-ping 1, ZHANG Ya-li 1,2, CHEN Liang 1*（1. Lab for Tea Germplasm, Genetic Improvement and Molecular Biology, Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China ）Abstract ：Tea is one of the most popular non-alcoholic healthy beverages in the world, which possesses great value as a source of secondary metabolic products, such as catechins. Isolation and cloning of important functional genes of tea plant (Camellia sinensis ) is of crucial significance for using biotechnology method to regulate the metabolism of tea plant. In this paper, the chalcone isomerase gene, which was an important functional gene of catechins biosynthesis pathway, was cloned from tea plant by using EST sequencing and RACE (rapid amplification of cDNA ends) approaches. The full-length cDNA of chalcone isomerase gene is 1 163 bp (GenBank Accession No. DQ904329), containing a 723bp open reading frame (ORF) encoding a 240 amino acid protein, and its 3′ untranslated region has an obvious polyadenylation signal. The deduced protein molecular weight was 26.4 kD and its theoretical isoelectric point was 5.19. Sequence analysis result showed that it is closely related with that of Lycopersicon esculentum. Keywords ：tea plant (Camellia sinensis ), chalcone isomerase, gene cloning, sequence analysis茶树中含有大量的多酚类化合物，含量一般为干重的15％~35％，它是茶叶品质的主要成分之一，其中儿茶素的含量最高，对于改善人体健康效果最为突出，它不仅具有防治肿瘤的功能，而且对增强微血管强韧性，降低血糖、血脂、血压，预防肝脏及冠状动脉硬化都有明茶叶科学27卷128显疗效[1,2]。

儿茶素合成途径中的第一个中间产物是查儿酮(chalcone)，它由4-香豆酰CoA和3个丙二酰CoA分子缩合产生，由查儿酮合成酶(chalcone synthase, CHS)催化。

查儿酮异构酶(chalcone isomerase, CHI)是黄酮类代谢途径中的早期酶，也是增加黄酮醇产物的关键酶之一[3]，它催化查儿酮异构化为黄烷酮柑橘素(柚皮素)。

黄烷酮柑橘素是类黄酮合成途径中第一个稳定的中间产物，由此再经由二氢黄酮4-还原酶(DFR)、黄烷酮3-羟化酶(F3H)等的催化作用就可以生成一系列常见的次生代谢产物[4,5]，从而形成其他黄酮类物质。

至今儿茶素代谢过程中的许多重要酶都已经被克隆，如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、CHS、DFR、F3H 和花青素合成酶等[6]，其中查耳酮合成酶是研究得最清楚的一个酶，已在许多植物中得到纯化。

而关于茶树查儿酮异构酶的研究却鲜有报道，其全长基因的分离克隆也还处于空白状态。

本试验采用EST(expressed sequence tags)测序技术和T4RNA连接酶介导的5′RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术克隆了茶树查儿酮异构酶的全长基因，为利用基因工程手段调控茶树黄酮类物质的生物合成打下基础。

1 材料和方法1.1 材料春季龙井43新梢上的一芽一叶，采自中国农业科学院茶叶研究所内国家种质杭州茶树圃，样品采集后用液氮迅速冷冻处理，然后将其保存于-80℃冰箱中备用。

1.2方法1.2.1 总RNA的提取总RNA的提取参照赵丽萍等[7]的方法，并稍加修改。

1.2.2 茶树EST序列测定对本实验室保存的EST库中编号TL020A01克隆进行双向测序，得到了一条查尔酮异构酶的EST片段，根据此片段设计了一组引物，扩增其5’端序列。

1.2.3 引物设计按照宝生物工程（大连）有限公司的5′RACE试剂盒要求，根据已获得的查尔酮异构酶EST片段设计并合成了五条引物，包括一系列磷酸化的RT引物和四条反向的嵌套引物（引物所处位置如图1所示），引物序列分别为：S1：5’-CACTGCCAAGGCTAAGATGGTTTCC-3’;A1：5’-CACGGTGGTTGCCATTCTTTGACGA-3’;S2：5’-AAGATTGCCGATGGTGAGATGGGGA-3’;A2：5’-GGTGGTTTTGGCTGGCTATGCTATGG-3’;RT Primer：5’-CAACCGGCACGTCAT-3’，它的5’端磷酸化由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.2.4 合成cDNA第一链按照5′-Full RACE Core Set试剂盒操作方法：在一个DEPC处理过的离心管中加入5 µg 的总RNA，10×RT Buffer 1.5 µl，RNase Inhibitor (40 U/µl) 0.5 µl，AMV Reverse Transcriptase XL(200 U/µl) 1 µl，RT-Primer(200umol/L) 1 µl，最后加DEPC处理的蒸馏水至终体积15 µl，将2期马春雷，等：茶树查尔酮异构酶基因克隆及序列分析129管中组分混匀置30℃水浴10 min，后将其移置50℃水浴30 min，80℃水浴2 min，获得cDNA 第一链。

1.2.5 单链cDNA的环化在得到的cDNA第一链反应液中加入5×Hybrid RNA Degradation Buffer 15 µl，蒸馏水45 µl和RNase H(60 U/µl) 1 µl，混匀后30℃反应1 h，将cDNA第一链上的RNA消化。

在上述反应液中加入100 µl的TE Buffer，500 µl的100%乙醇均匀混合后在-80℃放置15 min，进行乙醇沉淀，12 000 r/min以上离心10 min，除掉上清液。

然后向装有沉淀的离心管中加入500 µl的70%乙醇，12 000 r/min以上离心5 min，除去上清液后将沉淀干燥处理。

在Hybrid RNA分解的乙醇沉淀物（单链cDNA）中加入5×RNA（ssDNA）Ligation Buffer 8 µl和蒸馏水12 µl，溶解DNA。

再加入20 µl 的40% PEG #6 000和T4 RNA Ligase(60 U/µl) 1 µl，均匀混合，16℃过夜反应（15~18 h），得到环化的单链cDNA，产物直接用于PCR 或放-20℃保存。

1.2.6 巢式PCR反应向一经灭菌的0.5 ml微量离心管中依次加入10× PCR Buffer（Mg2+ plus） 2 µl，dNTPs (10 mmol/L each) 1 µl，环化的单链cDNA 0.4 µl，PCR特异引物A1、S1（10 pmol/µl）各0.2 µl，Taq DNA聚合酶（5 U/µl）0.2 µl，加水至终体积20 µl，反应在MJ-PTC220型PCR 仪（MJ Research, Inc., Waltham, MA, USA）上进行，反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性45 s、50℃复性45 s、72℃延伸45 s，35个循环，最后72℃再延伸5 min。