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11 生物制药 第2章 基因工程制药

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第二章基因工程制药新版2

第二章基因工程制药新版2

pUC质粒优点：
１．具有更小的分子，更高的拷数 ２．适于组织化学检测重组体．
[C]、 pGEM-3Z质粒
含一个ampR基因和一个
lacZ’编码基因;
有多克隆位点（MCS）;
正选择颜色标记 lacZ’;
Apr
有两个来自噬菌体的强启
动子PT7和PSP6,用于外源基 因的高效表达
lacZ’
PT7
MCS
1、宿主限制现象
病毒或噬菌体在宿主A细胞中生长良好,但在 宿主B细胞中生长很差,原因是它的DNA受 到宿主B的限制,这种现象是宿主控制性限 制 （restriction）与修饰(modification) ,简 称（R/M体系）。
细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别 自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降 解掉。
单链切割 连接
线性DNA （L型）
开环DNA
（oc型）
单链切割 连接
共价闭合环形DNA （SC型）
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型
（3）质粒的分类
F质粒----可使宿主A的部分基因随着F质粒一起 转移到不存在该质粒的另一宿主B的体内。
R质粒----可编码宿主A的一种或者数种抗生素抗 性基因，并能够将它们带到不存在该质粒的另 一宿主B的体内，使得宿主B也获得同样的抗性。
2、作用----主要用于 （1）正常DNA的合成。 （2）损伤DNA的修复。
3、种类 （1）DNA-连接酶----广泛存在于生物细胞之中，主要取 自于大肠杆菌E.coli。 （2）T4-DNA连接酶----来自于经过T4-噬菌体感染的大 肠杆菌E.coli。 （3 T4-RNA连接酶----催化单链DNA或RNA的5‘磷酸与 另一单链DNA或RNA的3’羟基之间形成共价连接。

生物制药技术-第二章-基因工程制药(5,6,7,8,9)

生物制药技术-第二章-基因工程制药(5,6,7,8,9)

对菌体生长的调控主要有两种观点：
一种观点认为能量的供应决定了菌 体的最大比生长速率:另一种观点 认为是小分子前体和催化组分(如 RNA聚合酶，核糖体等)的限制决定 了菌体的最大比生长速率。这两种 观点分别从能量和合成反应的前体 这两个不同的角度研究菌体的生长。
一、菌体生长与能量的关系


Andersen通过比较含不同碳源的培养基中大肠杆菌的比生长速 率和比呼吸速率，发现在不同碳源培养基中虽然菌体比生长速 率差别很大，但菌体的比呼吸速率却都在20 mmol O2/h·g-1 DCW (DCW为细胞干重)左右，因而认为菌体生长是由呼吸控制的。 各种碳源通过有限的呼吸能力所能提供的最大能最决定了菌体 在这种培养基中的最大比生长速率。 当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢所能提供的能量时，由 于呼吸链或二羧酸循环的供能不足，使部分乙酰辅酶A通过转化 为乙酸来供能。菌体往往会产生代谢副产物乙酸。 Meyer对大 肠杆菌进行恒化培养时发现，在含葡萄糖的基本培养基中的比 生长速率大于 0.35/h时，或在含葡萄糖的复合培养基中比生长 速率大于0.2/h时便可以测到乙酸。Hearther在培养温度诱导的 rIL-2工程菌时发现诱导后乙酸积累加快。在温度诱导的rIL-2 工程菌K802(pLY-4)和 rII-6工程菌DH-5(pBV-IL-6)的培养中也 发现了类似现象，其中K802(pLY-4 )在诱导后期乙酸的积累高 达25.7 g/L。
4.分阶段控制培养

外源基因表达水平越高，重组质粒越不稳定。由 于外源基因高效表达造成质粒不稳定时，可 以 考虑将发酵过程分阶段控制，即在生长阶段使外 源基因处于阻遏状态，避免由于基因表达造成质 粒不稳定性问题的发生，使质粒稳定地遗传，在 获得需要的菌体密度后，再去阻遏或诱导外源基 因表达。由于第一阶段外源基因未表达，从而减 少了重组菌与质粒丢失菌的比生长速率的差别， 增加了质粒的稳定性。连续培养时可以专虑采用 多级培养，如在第一级进行生长，维捋菌体 的 稳定性，在第二级进行表达。

第二章基因工程制药part1说课讲解

第二章基因工程制药part1说课讲解
第二章基因工程制药part1
一、概 述---几个概念
基因工程药物？
系指先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋
白质，然后将控制该蛋白质合成过程的基因分离、纯
化或进行人工合成，利用重组DNA技术加以改造，最
后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖，
并能进行大规模生产具有预防和治疗这种疾病的蛋白
质，通过这种方法生产的新型药物。
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二、目的基因的获得
3 cDNA第二链的合成
先用碱解或RHase酶解的 方法除去cDNA-mRNA杂交链 中的mRNA链，然后以cDNA 第一链为模板合成第二链。双 链cDNA分子的大小常用变性 琼脂糖凝胶电泳进行测定。
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二、目的基因的获得
4 cDNA克隆
异地结合在柱上，当逐渐降低
盐的浓度洗脱时，或在低盐溶
液和蒸馏水的情况下，mRNA
被洗脱下来，经过两次寡聚
（dt）纤维素柱后，可得到较
20高20/6纯/30度的mRNA。
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二、目的基因的获得
2 cDNA第一链的合成
一般mRNA都带有3‘poly A，所以可用寡聚dT 作为引物，在逆转录酶的 催化下，开始cDNA链的 合成。一次好的逆转录可 使寡聚dT选出的mRNA有 5%~30%被拷贝。
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一、概 述
制备基因工程药物的一般程序
获得目的基因 组建重组质粒
构建基因工程菌（或细菌）
培养工程菌
除菌过滤
半成品检定
2020/6/30
包装
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一、概 述
传统制药存在的问题
1. 许多在疾病诊断、预防和治疗中有重要价值的内
源性活性物质（如激素、细胞因子、神经多肽、调

生物技术制药：2-基因工程制药-2

生物技术制药：2-基因工程制药-2
• 盐析后—疏水性层析
3.根据分离纯化的工艺要求来选择 ➢ 基本原则：
具有良好的稳定性、重复性和较高的安全性 尽可能减少组成工艺的步骤 分离纯化工艺所用的时间尽可能短 工艺和技术必须高效
（四）基因重组蛋白的分析和鉴定
➢ 1. 蛋白质含量的测定
紫外（UV)吸收光谱
基本原理：因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和 色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的 这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶 液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
错流方式可有效降低膜 污染及防止浓差极化现 象，系统连续操作。
① 渗透和透析
➢ 渗透是一个扩散过程， 利用膜的两侧渗透压差 使溶剂产生流动。
➢ 透析是利用膜两侧的浓 度差为驱动力，从溶液 中分离出小分子物质的 过程。
如：医疗上用于处理肾 功能衰竭病人。
透析
② 反渗透、超滤和微滤
从溶液中分离出溶剂的膜分离操作为反渗透；分 离溶液中微粒和大分子的膜分离操作为超滤；使 不溶物浓缩过滤的操作为微滤。
➢ 它是利用蛋白质等电点的差异，来实现不同蛋白 质的分离和纯化。
洗脱 洗脱
离子交换
2. 亲和层析法
➢ 亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间 具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特 殊层析技术。
➢ 具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗 体、DNA与互补DNA或RNA、酶与它的底物或竞 争性抑制剂、激素（或药物）与它们的受体、维 生素和它的特异结合蛋白、糖蛋白与它相应的植 物凝集素等。
下相 杂蛋白 （核酸、多糖）
上相 目的蛋白
白 流 程
第三步两相萃取
静置分层 +盐
下相 目的蛋白
上相 杂蛋白、 PEG、色素

第二章基因工程制药part2

第二章基因工程制药part2
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
•大肠杆菌表面表达技术的建立 •膜蛋白基因在大肠杆菌中表达的技术逐渐成为研究的热点 •领域，膜蛋白表达技术的发展促进了大肠杆菌表面技术的 •建立。 •外源蛋白质在菌体表面表达的优点是大肠杆菌可直接用于 •制备疫苗，进行生物催化和作为探针筛选药物。在一定程 •度上能与噬菌体展示系统相媲美。
• ATG与SD序列之间的碱基组成为A、T碱基丰富时，
mRNA翻译效率较高。
第二章基因工程制药part2
•表达质粒的优化和设计
• 核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因 mRNA 5’端的二级结构，研究表明mRNA 5‘端形成的 “茎环”结构阻碍了mRNA与核糖体30S亚基的结合， 从而抑制了翻译的起始。 • 尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中A/T 碱基的含量，降低mRNA 5’端形成的“茎环”结构的可 能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。 •
采用较弱的启动子或部分诱导强启动子的方法可降 低蛋白质合成的速率，从而达到增加正确折叠重组蛋白质 的目的。
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
改造信号肽的序列和结构，提高分泌效率
• 比较成功的例子是发现了把碱性磷酸酯酶基因phoA信 •号肽的疏水区置换为多聚Leu残基能明显提高分泌效率。 表 •明信号肽核心部位疏水性的增强有利于它与细胞膜的相互 作用。这一结果为天然信号肽优化改造的设计提供了很好 参考依据。
•
大肠杆菌高密度发酵时大规模制备蛋白质过程中
不
• 可缺少的工艺步骤。其目的是在单个菌体对目标基因
的
• 表达水平基本不变的前提下，通过单位体积的菌体数
量
• 的成倍增加来实现总表达量的提高。

南农生物技术制药第二章基因工程药物

南农生物技术制药第二章基因工程药物

感染性疾病治疗
感染性疾病是由病原体（如 细菌、病毒、寄生虫等）引 起的疾病，基因工程药物可
以用于治疗这些疾病。
例如，利用基因工程技术生 产出的干扰素、白细胞介素 等细胞因子药物，能够调节 免疫系统，增强机体对病原
体的抵抗力。
此外，基因工程药物还可以 用于生产疫苗，通过激发机 体免疫系统来预防感染性疾 病的发生。
基因工程药物的临床应用
肿瘤治疗
肿瘤是基因突变导致的疾病，基因工程药物可以通过抑制肿瘤细胞的增殖 、促进肿瘤细胞的凋亡等方式治疗肿瘤。
例如，靶向肿瘤细胞表面抗原的单克隆抗体药物，能够特异性地识别肿瘤 细胞并与之结合，抑制肿瘤细胞的生长和扩散。
基因工程药物还可以用于肿瘤免疫治疗，通过激活患者的免疫系统来攻击 肿瘤细胞。
例如，利用基因工程技术将正常的基因导入到病变细胞中，以替代或修复缺陷基因，从而达到治疗疾病 的目的。
基因疫苗则是利用基因工程技术生产的疫苗，与传统疫苗相比，基因疫苗具有更高的免疫原性和安全性 。
04
CATALOGUE
基因工程药物的未来发展
新型基因工程药物的研发
创新药物靶点发现
随着基因组学和蛋白质组学研究的深入，将不断发现新的药物靶 点，为开发新型基因工程药物提供更多可能性。
法律问题
目前全球范围内对于基因工程药物的 法律法规尚不完善，存在监管空白和 法律争议，需要加强国际合作和立法 规范。
安全性问题
长期影响
基因工程药物可能对人类健康产生长期影响，需要加强长期追踪和观察，评估其安全性 和有效性。
潜在风险
基因工程药物的研发和应用过程中可能存在潜在风险，如基因突变、基因漂移等，需要 加强风险评估和监控。
罕见病治疗
罕见病是指发病率较低的疾病 ，往往缺乏有效的治疗手段。

第二章基因工程制药(一)

可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。
二、基因工程药物生产的基本过程
基因工程技术就是将重组对象的目 的基因插入载体，拼接后转入新的 宿主细胞，构建成工程菌，实现遗 传物质的重新组合，并使目的基因 在工程菌内进行复制和表达的技术。
基因工程药物制造的主要程序
获得目的基因
组建重组质粒
构
建
基
产物分离纯化
将重组体导入宿主细胞
体外包装的噬菌体，感染感受态 大肠杆菌形成噬菌斑。
或转化感受态大肠主要 有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑 颜色改变法。
然后采用凝胶电泳、分子杂交、 DNA序列分析测定等方法进行进 一步筛选和鉴定。
目的cDNA克隆的分离和鉴定
什么是最佳的基因表达体系
目的基因的表达产量高 表达产物稳定 生物活性高 表达产物容易分离纯化
宿主细胞的选择
适合目的基因表达的宿主细胞应满足以 下要求:
容易获得较高浓度的细胞 能利用廉价易得的原料 不致病、不产生内毒素
宿主细胞的选择
发热量低，需氧低，适当的发酵温 度和细胞形态
容易进行代谢调控 容易进行DNA重组技术操作 产物的产量、产率高，产物容易提
应用基因工程技术可十分方便且有 效地解决上述提到的问题，从量、 质上都可以得到改进，且可以创造 全新物质。
癌症、病毒性疾病、心血管疾病以 及内分泌等方面的预防、治疗和诊 断已可通过基因工程技术获得。
利用基因工程技术生产的药物
包括医用活性蛋白和多肽： 免疫性蛋白，各种抗原和单克隆抗体； 细胞因子，干扰素、白介素、生长因
子； 激素: 胰岛素、生长激素； 酶类: 尿激酶、链激酶、蚓激酶、超氧
化物歧化酶。
利用基因工程技术生产药物的优点
可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋 白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子 等），为临床使用提供有效的保障；

生物技术制药：2-基因工程制药-2


下相 杂蛋白 （核酸、多糖）
上相 目的蛋白
白 流 程
第三步两相萃取
静置分层 +盐
下相 目的蛋白
上相 杂蛋白、 PEG、色素
（二）基因重组蛋白的主要纯化技术
➢ 分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术。色谱 技术分为：
Ion exchange chromatography (IEC) Gel filtration chromatography (GFC) Hydrophobic interaction chromatography (HIC) Affinity chromatography (AC)
二、基因重组蛋白的分离纯化与分析鉴定 (自学）
基因重组蛋白的特点
➢ (1) 目的产物在初始原料中的含量较低; ➢ (2) 含目的产物的初始物料组成复杂,除了目的
产物外,还有大量的细胞、代谢、残留培养基、 无机盐等，特别是产物类似物对目的产物的分 离纯化影响很大；
➢ (3) 目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对 pH、温度、金属离子、 有机溶剂、剪切力、表面张 力等十分敏感，容易是其失活、变性；
① 等电点沉淀法
➢ 两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不 同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可 进行分离。
✓ 如工业上生产胰岛素时，在粗提液中先调pH8.0去除碱性 蛋白质，再调pH3.0去除酸性蛋白质。
② 盐析法
定义：在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度 的增加而升高的这种现象称为盐溶(salting in), 但 当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降， 直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析 (salting out)
➢ 几种盐的盐析能力的排列次序：
• 磷酸钾>硫酸钠>磷酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁。

生物制药 习题答案

第一章绪论一、生物技术药物分为哪些类型？1.应用重组DNA技术制造的多肽、蛋白质类2.基因药物3.来自动物、植物和微生物的天然生物药物4.合成与部分合成的生物药物二、生物技术药物的特性1.分子结构复杂2.具有种属特异性3.治疗针对性强，疗效高4.稳定性差5.基因稳定性6.免疫原性7.体内的半衰期短8.受体效应9.多效应和网络性效应10.检验的特殊性三、生物技术制药的特征是什么？1.高技术2.高投入3.长周期4.高风险5.高收益第二章基因工程制药一、基因工程技术生产药品的优点有哪些？1.利用基因工程技术可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用提供有效的保障。

2.可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围。

3.利用基因工程技术可以发现和挖掘更多的内源性生理活性物质。

4.利用基因工程和蛋白质工程对生理活性物质进行修饰和改造，提高药效价值。

5.利用基因工程技术可以获得新型化合物，扩大药物筛选来源。

二、基因工程药物制造的主要程序有哪些？分离目的基因，目的基因与载体连接构建DNA重组体，将DNA 重组体转入宿主菌构建工程菌，工程菌发酵，目的基因表达产物的分离纯化，产品的检验三、利用基因工程生产蛋白质或多肽首先需要得到其基因，制备目的基因常用的方法有哪些？目的基因来源于原核细胞，可选用合适的限制性核酸内切酶切下目的基因。

目的基因来源于真核细胞，常用的方法有：1.反转录法：为了克隆编码某种特异蛋白质多肽的DNA序列，可以从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA, 以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录生成该蛋白质mRNA互补DNA（cDNA第一链），再以cDNA第一链为模板，在反转录酶或DNA聚合酶Ⅰ作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA序列。

2.反转录PCR：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA第一链（不需要合成cDNA第二链），再以cDNA第一链为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

生物制药工程：第二章 第七节 基因表达

Recombinant protein
• the space between cell membrane and cell wall.
分泌到细胞周间隙中 的重组蛋白质
LOGO
特点：
读码框架固定: The target gene does not need start
Quantity of target protein
in cell, units
IPTG addition
LOGO
Where your expressed protein will be located?
Nothing
Recombinant protein may be hydrolyzed by proteinases
Purify and Identify the protein
问题： 是不是所有基因都可以在E.coli中表达？
SDS-PAGE
Western Blot Analysis
LOGO
外源基因在原核细胞表达的必要条件：
1. 删除内含子和5’非编码区 2.外源基因置于强启动子和SD顺序控制下 3.维持正确开放阅读框架（ORF） 4.mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质
影响目的基因的转录和翻译效率
干扰基因载体的复制等生物学功能
增加受体细胞的无效能量消耗 LOGO
2、原核表达质粒的类型：
成熟型 ------天然完整蛋白
融合型 -----融合蛋白 分泌型 ----分泌性蛋白
减少原核细胞对外 源蛋白的降解
LOGO
表达载体。 ④生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。 ⑤不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空
间构象。 ⑥内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳
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