HPLC法测定穿心莲注射液中穿心莲内酯的含量

HPLC法测定穿心莲注射液中穿心莲内酯的含量
目的建立穿心莲注射液中穿心莲内酯的高效液相色谱法含量测定方法。

方法采用高效液相色谱法测定含量，色谱柱：Agilent TC-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（50∶50）；检测波长：224 nm；流速：1.0 ml/min。

结果穿心莲内酯在0.02 022～0.1011 mg/ml（r=0.9999）内呈良好的线性关系，平均回收率（n=6）为99.1%（RSD=1.1%）。

结论建立的测定穿心莲内酯的方法准确有效，有助于进一步完成穿心莲注射液的质量控制方法。

[Abstract]Objective To establish the HPLC method for determination of Andrographolide content in Chuanxinlian Injection.Methods HPLC was used in content determination，the chromatographic column was Agilent TC-C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm），the mobile phase consisted of methanol-water （50：50），the detection wavelength was 224 nm and the flow rate was 1.0 ml/min.Results The good linear relation was maintained when Andrographolide was from 0.02 022 to 0.1011 mg/ml （r=0.9999）.The average recovery was 99.1% （n=6，RSD=1.1%）.Conclusion The method of determination of Andrographolide is accurate and effective，which can help to complete the quality control method of Andrographolide Injection.
[Key words]HPLC method；Chuanxinlian Injection；Andrographolide；Content
穿心莲注射液是由穿心莲的乙醇提取物制成的注射液，收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第十九册，具有清热解毒的功效，主要用于咽喉肿痛、肺热咳嗽、热痢，亦可用于上呼吸道感染、细菌性痢疾等。

穿心莲注射液中的主要有效成分穿心莲内酯（Andrographolide），是爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata （Burm.f.）Nees的有效成分之一，具有抗菌、消炎、止咳平喘、清热解毒、凉血消肿等作用，广泛用于上呼吸道、消化道细菌感染所引起的各种疾病[1-6]。

现行质量标准采用紫外分光光度法测定穿心莲内酯含量，操作繁琐，且显色时间的长短对测定结果影响较大。

本实验采用HPLC法对穿心莲注射液中有效成分穿心莲内酯的含量进行测定，通过大量实验研究，建立了穿心莲内酯的HPLC分析方法，方法准确有效，现报道如下。

1仪器与试药
Agilent1100型高效液相色谱仪含真空脫气机、低压四元泵、自动进样器和VWD检测器（美国安捷伦公司）；AUW120D型电子天平（日本岛津公司）；SK8200LH型超声仪（昆山超声仪器有限公司）；穿心莲内酯对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110797-201509）；穿心莲注射液（海南制药厂有限公司，批号：150104、150201、150914）。

甲醇（色谱纯），水（超纯水）。

2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相∶甲醇-水（50∶50）；流速：1.0 ml/min；检测波长：224 nm；进样量：10 μl[7-12]。

2.2线性关系
精密称取穿心莲内酯对照品10.11 mg，置50 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液，分别精密量取对照品贮备液1、2、3、4、5 ml，置10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。

精密量取上述溶液10 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图（图1～2）。

以浓度（mg/ml）为横坐标，峰面积（mAU）为纵坐标，得穿心莲内酯的线性回归方程为：Y=23822X-15.01（n=5），r=0.9999，结果表明穿心莲内酯在0.02 022～0.1011 mg/ml线性关系良好。

2.3空白试验
按照药品质量标准项下的制备工艺，自制不含穿心莲药材的产品作为阴性样品，并按供试溶液的制备方法制成阴性样品溶液。

按照“2.1”项下的色谱条件进样，结果显示阴性样品溶液在穿心莲内酯的样品峰处无干扰峰，表明本实验建立的方法对穿心莲内酯的含量测定无干扰（图3）。

2.4稳定性试验
取供试品溶液，在0、3、6、9、12 h内重复进样5次，每次10 μl，峰面积的RSD=0.6%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.5重复性试验
取同一批号样品，按样品含量测定测定项下方法重复测定5份，得穿心莲内酯含量的RSD=0.8%，表明重复性良好。

2.6精密度试验
精密吸取线性关系范围项下对照品溶液10 μl，重复进样5次，记录对照品峰面积，计算峰面积的RSD=0.7%，表明精密度良好。

2.7加样回收试验
精密量取已知含量的供试品2 ml六份，分别置10 ml量瓶中，分别精密加入标准曲线对照品贮备液0.5、0.5、1.5、1.5、2.5、2.5 ml，加甲醇稀释至刻度，摇匀。

精密量取上述溶液10 μl，分别注入液相色谱仪，记录峰面积，计算平均回收率（表1）。

2.8样品测定
分别精密量取3个批号的穿心莲注射液（批号：150104、150201、150914）
各2 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

精密称取穿心莲内酯对照品10 mg，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取3 ml，置10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

分别精密量取10 μl注入液相色谱仪，测定峰面积，按外标法计算穿心莲内酯的含量，结果分别为1.2、1.1、0.9 mg。

3讨论
3.1本文建立的方法与原检验标准的比较
在穿心莲注射液现行检验标准中，通常采用紫外分光光度法，通过显色反应来测定穿心莲内酯含量，操作繁琐，且吸光度值不稳定，通过实验证实，吸光度会随着时间推移呈迅速下降趋势，这样必然会造成测定结果的不准确。

并且比色法专属性不强，容易给一些不法分子提供造假机会。

本研究提出的HPLC法可直接测定注射液中穿心莲内酯的含量，方法简便、快速、准确，可作为该制剂的含量控制方法。

3.2穿心莲内酯与脱水穿心莲内酯含量的动态变化
穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯在制剂生产过程中会出现动态变化，且不同的提取和生产工艺对穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的转移率有较大的影响[13-16]，本研究组计划在下一步实验中进一步考察本制剂中脱水穿心莲内酯的含量及两者的关系[17-18]。

3.3方法耐用性考察
经过更换色谱柱Sunfire C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Agilent Eclipse XDB C18（4.6 mm×250 nm，5 μm）试验，结果得到良好的色谱图及重现性，且所得含量一致。

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