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微生物生态学的研究方法——磷脂脂肪酸分析（PLFA）【内容摘要】定量描述微生物群落是微生物生态学的难题之一。
应用传统的微生物培养方法和显微技术, 需要在选择性培养基上培养微生物, 即首先从环境样品中分离出纯菌株, 再对该菌株进行一系列的生理生化分析。
文章综述了磷脂脂肪酸谱图分析法在微生物生态研究中的应用，包括估算微生物生物量、确定群落结构、指示特定微生物，指示生理和营养状况等，并指出此种方法存在的问题及改进方法。
【关键词】磷酸脂肪酸微生物生态学应用及发展一、引言：环境中微生物的种类和数量是及其丰富的[1]，微生物能把有机质作为营养源转化为组成物质和能量，它们在环境治理过程中扮演着极其重要的作用。
分离和鉴定处理系统中的优势菌，了解特定环境下微生物群落的种群分布、遗传多样性及其动态变化规律和认识微生物群落的稳定性及功能菌的作用，是环境微生物学研究的重要内容。
传统的微生物鉴定和群分析方法建立在微生物纯种培养分离基础上，但自然环境中有 99%以上的微生物还不能通过人工培养，在微生物的分析和研究工作中具有很大的局限性。
二、正文：1．磷脂脂肪酸(PLFAs)谱图分析技术概述1.1 PLFA 概念、分类和命名磷脂是含有磷酸基团的脂质，目前已发现了1000多种磷脂类物质。
磷脂作为微生物细胞膜主要成分，是甘油分子的第3位羟基被磷酸或其他羟基所酯化形成的。
其结构特点是：具有由磷酸相连的取代基团（含氨碱或醇类）构成的亲水头（hydrophilic head）和由脂肪酸链构成的疏水尾（hydrophobictail）。
PLFAs(磷脂脂肪酸，phosphohpids fattyacids)谱图分析方法的原理是基于磷脂——几乎是所有生物细胞膜的重要组成部分，细胞中磷脂的含量在自然条件下(正常的生理条件下)恒定[ 2 ]，其长链脂肪酸的形式——磷脂脂肪酸PLFAs 可作为微生物群落的标记物。
此外，磷脂不能作为细胞的贮存物质，在细胞死亡后将很快降解(厌氧条件下约需2d，而好氧条件下约需12—16d)m，可代表微生物群落中“存活”的那部分群体阁。
随着人们对环境问题的日益关注，从２０世纪７０年代开始，微生物生态学得到了迅速的发展［１．２］。
传统的微生物生态学技术包括显微形态观察，选择性培养基计数，纯种分离和生理生化鉴定［３］等。
但随着研究的深入，人们发现自然环境中存在的大多数微生物不可培养，传统的方法不能够满足微生物生态研究的需要，使微生物生态研究一直较为落后。
近年逐步建立起来的１６ＳｒＲＮＡ／ＤＮＡ实验技术则为微生物生态学的研究提供了新的研究方法，建立了对难以培养的微生物和不依赖于培养的微生物生态学的研究方法，使关于微生物多样性、微生物种群分析、重要基因的发现、以及遗传物质在微生物之间或微生物与植物之间的水平转移对生态系统的影响等方面都取得很大进展，开辟了微生物生态学研究新的领域。
１微生物多样性研究微生物多样性的研究是微生物生态学研究的基本内容，由于微生物具有生存环境多样，生长繁殖快，适应性强，代谢途径多样以及生活方式多样的特点，使得微生物分布广泛，变异快，种类多，通过对微生物多样性的研究，可以探知蕴藏其中的大量基因资源。
因此对微生物多样性的研究，无论对于生态系统功能的完整理解还是对微生物资源的利用，都具有极其重要的意义［４］。
但是，传统的分析方法是通过分离、培养和鉴定，需要一个非常复杂的形态特征鉴定和生理生化试验，这种方法试验周期长，工作量大，更重要的尽管是最复杂的组合，也难于将样品中的微生物全部分离，而且不能对分离物进行准确的鉴定，不能反映分离物之间的系统发育关系［５］。
用分子生态学的方法可以直接从核酸水平对样品进行研究，通过提取样品中不同微生物的总ＤＮＡ，然后进行分析，避免了样品中微生物的丢失，样品序列的多样性和不同序列的丰度在一定程度上反映了原始样品中微生物种群的多样性和丰度。
从而可以保证实验能更真实地体现研究对象的结构组成，因此分子生态学技术和研究策略在揭示自然环境中微生物多样性的真实水平及其物种组成上显示出了极大的优越性。
通过以土壤细菌１６ＳｒＲＮＡ基因的一段２６碱基变异区为基因标签，连接成基因标签串测序，用标签类基于１６ＳｒＲＮＡ／ＤＮＡ分析的土壤微生物生态学效应黄进勇，周伟（郑州大学生物工程系，河南郑州４５０００１）摘要：基于１６ＳｒＲＮＡ／ＤＮＡ分析的实验技术为微生物生态学的研究提供了新的研究方法，从而在微生物多样性、微生物种群分析、重要基因的发现以及遗传物质在微生物之间或微生物与植物之间的水平转移对生态系统的影响等方面都取得了很好的研究进展。
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一、生态学(ecology）是研究生物有机体与其栖息地环境之间相互关系的科学。
海洋生态学是研究海洋生物之间以及海洋生物与其环境之间关系的科学。
二、海洋生态学围绕着全球面临的重大生态课题进行了空前规模的研究。
研究成果为：（本题只需记下大点，内容课堂上后面的章节都讲了，自己发挥就可，不用死记硬背）1、海洋初级生产力总量的研究方面（1）将14C同位素示踪技术应用于海洋初级生产力的测定（2）近20年来，随着海洋调查和研究的深入，发现：一些超微型浮游生物在初级生产中起着极为重要的作用(3)70年代以前过低估计了海洋初级生产总量的水平（少估算了浮游生物输送到海水中的部分）2、微型和超微型浮游生物的研究发现许多过去用普通显微镜观察不到的微细生物.蓝细菌3、新生产力与物质通量研究方面首先:1967年提出了“新生产力”的概念，认为初级生力应包括再生生产力和新生生产力两部分.意义：与生物泵联系，对调节全球气候变化（温室效应）的调节有重要意义其次：C与其他生源要素（N、P、SI等)在不同海洋界面的通量研究日益受到重视4、海洋生态系统食物链、食物网研究方面Ryther1969年提出大洋食物链,沿岸大陆架和上升流区食物链三种类型并估计它们的生态效率；食物网研究中提出生物粒径谱5、海洋微型生物食物环研究。
海洋异养微生物既是分解者，也是生产者。
除了二条经典的能流途径--捕食食物链和碎屑食物链外，提出了微食物链和微型食物网微型生物食物环:DOM－细菌和真菌－原生动物－后生动物6、大海洋生态系统的管理方面大海洋生态系统的管理目的：（1) 保护海洋生物的多样性(2）合理开发利用生物资源（3）维持海洋生态系统的健康7、全球海洋生态系统动力学研究(Global Ocean Ecosystem Dynamics, GLOBEC)GLOBEC科学研究涵盖了物理海洋学、生物海洋学、化学海洋学和资源生态学（或称渔业生态学）等多个学科，更重要的是侧重于多学科的交叉与综合。
海洋生物学知识点教案一、名词解释1、潮下带：不超过两百米的水层区，海底地形较为平坦，坡度较小，以大陆缘为外界2、生物沉降：是指由生物活动结果形成的沉积物。
它包括由生物遗体或遗物（如粪便）直接形成的沉积物，如硅藻土、贝壳层、鸟粪层、泥炭、煤等；也包括与生物生命活动有密切关系的各种沉积物，如磷块岩，某些石灰岩、石油等。
生物沉积物多形成于海洋中3、海洋雪：在深海中，由有机物所组成的碎屑向雪花一样不断飘落，称作海洋雪。
海洋雪主要由有机物碎屑所组成，起源于海洋上部透光层的有机物生产活动。
海洋雪的组成包括：已死或将死的动植物（浮游生物）、原生生物（如硅藻）、细菌、粪便颗粒、泥沙和尘土等。
4、大陆边缘沉积：经河流、风、冰川等作用从大陆或临近岛屿携带入海的陆源碎屑5、珊瑚礁：热带海洋中一些海岸、岛屿、暗礁周围和海滩大量生长造礁石珊瑚为主的骨骼堆积形成的礁体，统称为珊瑚礁。
有岸礁、堡礁和环礁三种类型。
6、真红树植物：是指专一性生长在潮间带的木本植物,它们只能在潮间带环境生长繁殖,在陆地环境不能够繁殖。
其特征是胎萌、呼吸根与支柱根、泌盐组织和高渗透压。
7、赤潮：海洋中一些微藻、原生动物或细菌在一定环境条件下爆发性增殖或聚集达到某一水平，引起水体变色或对海洋中其他生物产生危害的一种生态异常现象。
8、广盐性生物：又称“盐度变化生物”。
指能够在海水含盐度变化较大的海水中生活的生物。
海岸带及河口区的生物多属于广盐性生物。
如某些双壳类及腹足类、介形类、海绵等。
如紫菜能在32‰—24‰的盐度中生长。
9、寒流：水温显著低于流经海域的海流。
即：自冷水区向暖水区流动的洋流。
10、上升流：海底富含营养盐的高密度海水向海表面涌升的现象。
1、海洋环境：地球上海和洋的总水域，按照海洋环境的区域性可分为河口、海湾、近海、外海和大洋等，按照海洋环境要素可分为海水、沉积物、海洋生物和海面上空大气等。
2、大洋区：远离大陆，深度较大，面积广阔的区域。
水文地球化学研究现状、基本模型与进展摘要：1938 年, “水文地球化学”术语提出, 至今水文地球化学作为一门独立的学科得到长足的发展, 其服务领域不断扩大。
当今水文地球化学研究的理论已经广泛地应用在油田水、海洋水、地热水、地下水质与地方病以及地下水微生物等诸多领域的研究。
其研究方法也日臻完善。
随着化学热力学和化学动力学方法及同位素方法的深入研究, 以及人类开发资源和保护生态的需要, 水文地球化学必将在多学科的交叉和渗透中拓展研究领域, 并在基础理论及定量化研究方面取得新的进展。
早期的水文地球化学工作主要围绕查明区域水文地质条件而展开, 在地下水的勘探开发利用方面取得了可喜的成果( 沈照理, 1985) 。
水文地球化学在利用地下水化学成分资料, 特别是在查明地下水的补给、迳流与排泄条件及阐明地下水成因与资源的性质上卓有成效。
20 世纪60 年代后, 水文地球化学向更深更广的领域延伸, 更多地是注重地下水在地壳层中所起的地球化学作用( 任福弘, 1993) 。
1981 年, Stumm W 等出版了5水化学) ) ) 天然水化学平衡导论6 专著, 较系统地提供了定量处理天然水环境中各种化学过程的方法。
1992 年, C P 克拉依诺夫等著5水文地球化学6分为理论水文地球化学及应用水文地球化学两部分, 全面论述了地下水地球化学成分的形成、迁移及化学热力学引入水文地球化学研究的理论问题, 以及水文地球化学在饮用水、矿水、地下热水、工业原料水、找矿、地震预报、防止地下水污染、水文地球化学预测及模拟中的应用等, 概括了20 世纪80 年代末期水文地球化学的研究水平。
特别是近二十年来计算机科学的飞速发展使得水文地球化学研究中的一些非线性问题得到解答( 谭凯旋, 1998) , 逐渐构架起更为严密的科学体系。
1 应用水文地球化学学科的研究现状1. 1 油田水研究水文地球化学的研究在对油气资源的勘查和预测以及提高勘探成效和采收率等方面作出了重要的贡献。
论微生物在海洋中的作用作者：周浩王璐中文摘要：21世纪人类社会面临“人口剧增、资源匮乏、环境恶化”三大问题的严峻挑战，随着陆地资源的日趋减少，开发海洋，向海洋索取资源，尤其是海洋微生物资源越来越受到人们关注。
本文将从海洋微生物多样性、海洋药物及保健功能的生物活性物质、海洋极端酶、海洋微生物在消除海洋污染物等方面给予介绍。
中文关键词：海洋微生物资源生物药物资源前言洋中生活许许多多各种各样的微生物，它们是以单细胞或以群体形式存在，能独立生活的生物，包括病毒、细菌、真菌、单细胞藻类及原生动物等等。
但按狭意所指仅为病毒、细菌和真菌等。
目前研究较多的是细菌。
微生物体积大多非常微，需在显微镜下才能看见。
如海洋微生物，它的直经大多仅为几个微米到零点几个微米。
海洋微生物种类繁多，数量颇大。
如胶州湾每毫升海水中生活着几百个，多至几千万个细菌。
它们对我们生活及工农业生产有着极为密切的关系。
浩瀚的海洋是地球上生命的摇篮，它覆盖着地球表面积海水总体积占地球总水量的70%，海洋中生物资源极为丰富，生物活性物质种类繁多，已引起世界各国的重视，仅在过去10年中有近5000种新的海洋天然产物被发现。
大多数都分离自海洋微生物,且许多是陆地生物所没有的，显示出巨大开发潜力，因此，海洋微生物资源研究已成为海洋资源研究的重要内容之一。
正文1海洋微生物的生物多样性海洋是一个十分独特的生态环境，包罗了高盐、高压、低温、尤其是深海低光照、寡营养等特点，还有无光照以及局部高温的极端环境，来自海洋的微生物大部分都是适应了极端环境的极端微生物，据估计海洋微生物可达0.1~2亿种，已发现的类群主要包括病毒、古菌细菌、粘细菌、微藻、真菌，海洋微生物的物种多样性决定了其代谢产物多样性，海洋环境是新型生物活性物质的源泉2海洋微生物药物资源海洋放线菌中活性物质研究报道的最多，现已从海水，海底泥，海鱼胃内容物，柳珊瑚表面含有河豚毒素的叉珊藻、毒蟹、河豚、毛颚动物等的体内或体表等各种采自海洋的样品中分离到的细菌、放线菌可产生多种生物活性物质，包括抗氨基糖苷类耐药菌株的新氨基糖苷类抗生素，对绿脓杆菌和一些耐药性革兰氏阴性菌具有较强的活性，抗菌谱广，毒性低的抗菌物质和肌醇胺霉素；寡霉素的羟衍生物，肠菌素的脱氧衍生物以及两种全新的细菌化合物辛内酰亚胺和八氢内酰亚胺、亚酮乳酰胺、大环内酰亚胺、喹唑啉哈利凯等具有抗病毒或抗肿瘤活性的物质，一种具有增强免疫活性，促进体液免疫和细胞免疫，能抑制多种动物移植肿瘤的杂多糖，与化疗药物在抗肿瘤方面有协同作用，已用于临床，海洋真菌的次级代谢产物具有生物活性，包括小分子内酯化合物、真菌毒素，对中枢神经系统有抑制活性的新物质：十二醇、不饱和烃、酸、酯可抑制植物和人的真菌病菌作用于真菌细胞壁合成新靶位的脂肽类抗生素，微藻中某些甲藻能形成不寻常结构类型的多醚类抗生素，螺旋藻富含蛋白质、维生素、矿物质、必需氨基酸和必需脂肪酸的含量也很丰富具有降低血液中的胆固醇含量，防癌抗癌，增强肠道乳酸菌群，降低重金属和药物的毒性以及放射防护等诸多方面的潜在药用价值，除了海洋微生物的直接产物外，海洋微生物产生的具有药理功能的先导生物活性物质，我国第一个抗艾滋病一类新药就是从海洋提取分离后经分子修饰后而得到的，目前该药已经完成临床前药学和药效学实验，批准进入临床研究阶段。
Science &Technology Vision 科技视界海洋微生物产物在医药卫生方面的开发利用概况卢文珺1卢文琼2房逢立1(1.山东中医药高等专科学校,山东烟台264199;2.即墨市疾病预防控制中心,山东青岛266200)【摘要】由于经济和人口的增长，人类正面临着日益严重的资源紧缺问题。
资源的减少以及需求的增长使陆地微生物资源越来越不能满足人们的需要，由此研究者的目光自然而然地转向了海洋微生物。
海洋微生物在医药卫生、工业生产、海水养殖、环境保护等方面都有重要作用，海洋微生物资源在医药卫生方面的开发利用前景十分广阔。
【关键词】海洋微生物；医药卫生；开发利用0前言由于经济和人口的增长，人类正面临着日益严重的资源紧缺问题。
自从1929年青霉素的发现开始，人类已着手从微生物中提取生物活性物质。
而以前由于研究手段的局限，大多数研究者把注意力集中在陆地微生物的代谢产物上。
抗生素的滥用使病原微生物获得抗药性的速度远快于人类从陆生微生物中获得新抗生素的速度，资源的减少以及需求的增长使陆地微生物资源越来越不能满足人们的需要。
由此研究者的目光自然而然地转向了海洋微生物。
地球面积的71%是海洋，开放、复杂、多变的海洋环境使海洋微生物产生了许多独特的生理生化模式，其更有可能产生与陆地环境中微生物所不同的生理代谢物。
海洋微生物种类繁多，分布于海洋的不同部位，如海水中、海洋底泥中、海洋动植物体表及内部等，其中以海洋底泥中居多。
海洋微生物主要由细菌、真菌和放线菌组成。
其中海洋细菌在海洋微生物中数量最大，分布最广。
深海由于具有极端的温度、压力和pH 等，对微生物的细胞膜形成、蛋白质结构、核酸结构都产生影响[1]，并使深海微生物的种类与多样性远远超出我们的想象。
充分利用海洋微生物的各种优势研究开发出各种生物制剂前景十分广阔。
1海洋生物活性物质海洋生物活性物质主要包括新型抗菌物质、抗肿瘤化合物、抗病毒物质，维生素、酶抑制剂及极端酶等。
第３４卷第１期 ２０１５年２月 应用海洋学学报
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｃｅａｎｏｇｒａｐｈｙ Ｖｏ１．３４．Ｎｏ．１
Ｆｅｂ．，２０１５
三大洋深海沉积物样品可培养真菌多样性研究 徐 炜，李广伟，黄翔玲，骆祝华 （国家海洋局第三海洋研究所、国家海洋局海洋生物遗传资源重点实验室，福建厦门３６１００５）
摘要：深海真菌是深海微生物的重要组成之一，在深海环境生态系统中起着非常重要的作用，但目 前人们对于深海沉积物中的真菌群落多样性关注较少．本研究对来自东太平洋、南大西洋和西南印 度洋（三大洋）的１５个沉积物样品进行真菌的分离培养，共获得１７５株真菌，包括９３株酵母菌和 ８２株丝状真菌．基于形态学观察和ＩＴＳ序列的系统发育分析显示，９３株酵母分别属于红冬孢酵母 属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）和胶红酵母属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）的两个种［海洋红酵母（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｌｕｄｉｇｅ— ｎｌｔｍ）和胶红酵母（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）］．８２株丝状真菌分别属于曲霉属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、枝孢 属（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、青霉属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、链格孢属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、镰刀菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、支顶孢属（Ａｃｒｅ— ｍｏｎｉｕｍ）、茎点霉属（Ｐｈｏｍａ）、麦轴梗霉属（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）、毛壳菌属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）、外瓶霉属（ 一 ｏｐｈｉａｌａ）、侧齿霉属（Ｅｎｇｙｏｄｏｎｔｉｕｍ）、肉片齿菌属（Ｓｉｓｔｏｔｒｅｍａ）、裂褶菌属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、腥掷抱菌 属（Ｔｉｌｌｅｔｉｏｐｓｉｓ）和Ｈｏｒｍｏｎｅｍａ．其中曲霉属为丝状真菌中的优势属，占总菌株的４７．６％．上述研究结 果表明大洋深海沉积物中存在着较为丰富的真菌资源，有助于加深我们对于不同大洋区域深海环 境中真菌群落结构的认识． 关键词：海洋生物学；深海沉积物；可培养真菌；多样性；ＩＴＳ序列 ＤＯＩ：１０．３９６９／Ｊ．ＩＳＳＮ．２０９５４９７２．２０１５．０１．０１４ 中图分类号：Ｐ７３５ 文献标识码：Ａ 文章编号：２０９５４９７２（２０１５）０ｌ－０１０３－０８
真菌广泛存在于各种海洋环境中 ，主要作为 分解者参与到海洋生态系统的物质循环中 ．也有 报道提及真菌可以作为寄生菌、病原菌以及共生微 生物存在于海洋环境中 ．深海是一个低温（除热 液口区域外）、高压、无光照的极端生态环境．深海 的极端环境造就了其丰富且广泛未知的微生物群 落，同时也给生态考察带来了很多技术上的难题．近 年来，随着深海取样技术的不断进步，对深海环境中 的真菌群落结构的研究，已经成为科学家们的一个 研究热点。。 ． １９６４年，Ｒｏｔｈ等（１９６４）首次从大西洋４ ５００ ｍ 深的海水中分离到深海真菌 Ｊ．此后，越来越多的 研究开始关注各种深海环境中的真菌分离与多样性 分析．目前，对于深海真菌多样性的研究主要依赖于 传统的分离培养方法和以分子生物学为基础的免培 养方法．基于环境基因组总ＤＮＡ为基础的免培养方 法可获得丰富的真菌多样性信息，在新的深海真菌 类群的发现方面取得了许多突出的进展 ’ “ ．而 传统的分离培养方法除了可获得深海真菌的多样性 信息外，还可以对分离获得的菌株进行生理生化分 析及其对深海高压、低温、寡营养等极端环境的适应 机制研究，对于深海真菌资源的获取与开发有重要 意义．目前已在多种深海环境中分离得到真菌菌株， 包括深海热液区［ 。 、缺氧区 、冷甲烷渗出区¨ 和沉积物环境¨ ．这些分离培养获得的深海真菌 大多属于子囊菌门（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ），还有少数担子菌 门（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）真菌． 本研究对来自东太平洋、南大西洋与西南印 度洋不同站位的多个深海沉积物样品进行真菌的 分离培养，并通过形态学观察结合ＩＴＳ序列分析对 所获得的真菌进行分类鉴定，为认识不同海域深 海环境中可培养真菌的多样性提供基础资料．同 时也为未来的深海真菌资源的进一步开发利用奠 定基础．
收稿日期：２０１４－０６－０９ 基金项目：中国大洋协会资助项目（ＤＹ１２５－１５－Ｒ－０１）；国家自然科学基金资助项目（４１３７６１７１） 作者简介：徐炜（１９８７～），男，博士；Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｗｋｈｊ＠１６３．ｅｏｍ 通讯作者：骆祝华（１９７７～），男，博士，副研究员；Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｕｏｚｈｕｈｕａ＠ｒｉｏ．ｏｒｇ．ｃｎ ・１０４・ 应用海洋学学报 １材料与方法 １．１ 样品采集 本实验中所用的１５个深海沉积物样品均来自 科考船“大洋一号”２１航次在２００９年１０月到２０１０ 年４月所采集的深海沉积物样品．沉积物样品由电 视抓斗采集获得．样品采集到甲板后，去除表层２
ｅｍ的沉积物样品以避免环境污染．将２～５ ｅｍ层次 的沉积物样品混合均匀，放人无菌袋中置于４℃中 保藏，待样品运回实验室后立即进行后期的真菌分 离．１５个沉积物样品分别来自东太平洋（６个）、南 大西洋（２个）与西南印度洋（７个）（表１）．
表１ 深海沉积物样品来源信息 Ｔａｂ．１ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｅｐ ｓｅａ ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
１．２真菌分离 样品带回实验室，每个样品取１ ｇ沉积物用来分 离培养真菌．本实验采用５种不同的培养基：麦芽浸 出液琼脂培养基（ｍａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔ ａｇａｒ，ＭＥＡ）、察氏琼脂 培养基（ｅｚａｐｅｋ ｄｏｘ ａｇａｒ，ＣＤＡ）、沙氏葡萄糖琼脂培 养基（ｓａｂｏｕｒａｕｄ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ，ＳＤＡ）、玉米粉琼脂培 养基（ｃｏｒｎ ｍｅａｌ ａｇａｒ，ＣＭＡ）和马铃薯葡萄糖琼脂培 养基（ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ，ＰＤＡ），使用人工海水配 制，然后高温高压灭菌，冷却至６０℃后加入青霉素 和链霉素（终浓度各１ ｇ／ｄｍ ），用于抑制细菌生长． 实验中培养的成分含量减少至常规用量的１／５，用 于刺激深海寡营养环境下的真菌生长．沉积物样品 用样品稀释液（Ｒｉｎｇｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）按１：１０的比例稀释 制成悬液，１０倍稀释平板涂布法分离¨ ．涂布后的 平板置于２５℃恒温培养箱中培养，３ ｄ后每天观察 各种培养基上真菌的生长情况，并根据菌落培养性 状（菌落直径、颜色、质地、菌落反面和可溶性色素、 培养基中渗出物的有无等）简单归类并计数后¨ ， 挑取不同菌落纯化，最后用甘油于一８０℃保种． １．３真菌的形态学观察 真菌的形态学观察采用埋片法．在凝固的ＰＤＡ 平板上用灭菌小刀开２个小槽，宽度小于１．５ ｅｍ． 把真菌菌株接种于小槽边上，盖上灭菌的盖玻片，置 于２５℃恒温培养箱中培养．待真菌菌丝沿着盖玻片 生长后，取下盖玻片，置于载玻片上，显微镜下镜检 观察菌丝及孢子的形态． １．４真菌ＤＮＡ提取与纯化及ＩＴＳ序列扩增 将分离获得的真菌接种到液体的ＰＹＧ培养基 中，于２５℃培养７ ｄ，将所获得的纯培养物真菌ＤＮＡ 提取采用通用的ＣＴＡＢ基因组ＤＮＡ提取法，将提取 所获得的基因组ＤＮＡ通过引物ＩＴＳ１／４（ＩＴＳＩ：５’一 ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３’和ＩＴＳ４：５’一ＣＧＴ— ＴＡＣＴＲＲＧＧＣＡＡＴＣＣＣＴＧＴＴＧ．３’ ，Ｔｍ：５５℃）进行 ＰＣＲ扩增，每个样品做３组平行，扩增所得的ＰＣＲ 产物经质量分数为１％琼脂糖凝胶电泳检测后确定 是否为目的产物．所得的产物经ＰＣＲ产物回收试剂 盒（天根生化科技有限公司，北京）纯化后，送至测 序公司（上海美吉生物医药科技有限公司，上海）进 １期 徐炜，等：三大洋深海沉积物样品可培养真菌多样性研究 ・１０５・ 行测序． １．５真菌序列的进化分析 测序得到的ＩＴＳ序列经过ＤＮＡＳＴＡＲ软件去 除冗余序列，然后对真菌的ＩＴＳ序列进行比对分 析，把序列相似度≥９９％的序列归为一个种，每种 选择一个代表序列在ＮＣＢＩ数据库中进行Ｂｌａｓｔｎ 分析．从Ｂｌａｓｔ结果中挑选每种真菌最相近的真菌 ＩＴＳ序列，用Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ进行完全比对，然后通过 ＭＥＧＡ ５．１采用邻位加入法（ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈ— ｏｄ，ＮＪ）建立系统进化树，选择使用１ ０００次重复 的自展分析（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ａｎａｌｙｓｉｓ）来检验系统发育树 的可信度．
２结果与分析 ２．１ 酵母菌分子鉴定结果及分析 从大西洋ＳＡ．１、ＳＡ一２和东太平洋ＥＰ一３、ＥＰ．６共 ４个站位的样品中分离获得９４株酵母菌．通过对这 些酵母菌的ＩＴＳ序列进行分析，得到了酵母菌的分 子鉴定结果（表２）．Ｂｌａｓｔ结果显示９３株酵母菌ＩＴＳ 序列与ＧｅｎＢａｎｋ数据库中序列相似度都在９９％一 １００％，可归为红冬孢酵母属与胶红酵母属的２个种 海洋红酵母（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｌｕｄｉｇｅｎｕｍ）和胶红酵 母（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）．其中３４株酵母菌是 海洋红酵母，占所鉴定酵母总菌株的３６．５６％；另外 ５９株酵母菌属于胶红酵母，占所鉴定酵母总菌株的 ６３．４４％．从本研究的结果中可以看出，深海沉积物 样品的酵母菌的多样性不高，在南大西洋ＳＡ一１和东 太平洋ＥＰ一３、ＥＰ一６这３个站位中胶红酵母分布比例 比海洋红酵母高，而在南大西洋ＳＡ一２站位中则相 反．此外，本研究中有７３．３％的沉积物样品未能分 离到酵母，推测实验中所使用的培养基可能不适合 于分离培养深海酵母，故导致本实验中所获得酵母 菌的多样性不高．
表２基于ＩＴＳ序列的酵母菌株鉴定结果 Ｔａｂ．２ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
２．２ 丝状真菌分子鉴定结果及分析 从东太平洋（５个站位）、南大西洋（２个站位） 及西南印度洋（７个站位）共１４个站位的沉积物中 共分离获得８２株丝状真菌．通过形态学观察并结合 真菌ＩＴＳ序列分子生物学分析对菌株进行鉴定．结 果显示，８２株真菌属于１５个属，它们分别是：曲霉 属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）３９株、枝孢属（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）１３株、 青霉属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）１０株、链格孢属（Ａｈｅｒｎａｒｉａ）４ 株、镰刀菌属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）３株、枝顶孢属（Ａｃｒｅｍｏｎｉ— ｕｍ）２株、茎点霉属（Ｐｈｏｍａ）２株、麦轴梗霉属（Ｔｒｉｔｉ— ｒａｃｈｉｕｍ）２株、毛壳菌属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）１株、外瓶霉 属（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）１株、侧齿霉属（Ｅｎｇｙｏｄｏｎｔｉｕｍ）１株、 肉片齿菌属（Ｓｉｓｔｏｔｒｅｍａ）１株、裂褶菌属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌ— ｌｕｒｅ）１株，腥掷孢菌属（Ｔｉｌｌｅｔｉｏｐｓｉｓ）１株和Ｈｏｒ— ｍｏｎｅｍａ １株．其中除菌株ＤＳＦ．２７与Ｈｏｒｍｏｎｅｍａ ｓｐ． Ｆ－０５４，２５８的序列相似度为９８％外，其余菌株与 ＧｅｎＢａｎｋ库中参照菌株序列相似性都在９９％～ １００％之问（表３）．菌株及相关信息（形态学特征和 ＩＴＳ序列）均保存在中国海洋微生物菌种保藏管理 中心（ｗｗｗ．ｍｃｃｃ．ｏｒｇ．ｃｎ）．各属菌株所占总菌株数 的比例如图２．采用Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ—Ｊｏｉｎｉｎｇ法构建基于 ＩＴＳ基因序列的丝状真菌系统进化树（图１），显示 所获得的丝状真菌菌株都是子囊菌门和担子菌门真 菌，其中子囊门真菌所占的比例较高，占总菌株的 ９３．９％（图２）．
