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干细胞标志物胚胎干细胞的标志物Oct-4: Oct-4（也叫Oct-3或Oct3/4）属POU转录因子一员，最初鉴定为DNA结合蛋白，可通过顺式元件活化基因转录。
它在全能胚胎干细胞(ES)和生殖细胞表达。
该表达对于维持干细胞的自我更新和多能性是必要的。
4 ES的分化导致Oct-4的下调。
5 Oct-4不仅是细胞系多能分化的主要调节因子，而且也是首要的作为鉴定全能ES细胞的标志物。
SSEAs: SSEAs 最初是用来鉴定识别糖脂表位的三个单抗。
SSEA-1表达在前移植期的鼠胚表面（如八细胞期）并且也发现存在于畸胎瘤干细胞表面，但不存在分化的衍生细胞中。
输卵管上皮、子宫内膜、附睾, 成年鼠脑和肾小管区域也发现和SSEA-1抗体反应。
SSEA-3和4在卵子发生时合成，在卵母细胞、受精卵和早期卵裂球细胞膜上存在。
这些与糖链相关的分子的生物学功能被认为是调控发育期的细胞膜间的相互作用。
未分化的灵长类ES细胞，人的EC和ES细胞表达SSEA-3和SSEA-4,但不表达SSEA-1。
未分化的小鼠ES细胞表达SSEA-1,但不表达SSEA-3或SSEA-4.造血干细胞的标志物CD34（细胞表面的唾液粘蛋白）：CD34自从被发现存在于少量人骨髓细胞以来就是兴趣的焦点。
从骨髓和外周血来源的CD34阳性富集的细胞群体显出大部分的造血活性。
CD34被认为是造血干细胞(HSCs). 的标志物。
CD34在原始细胞分化为成熟细胞后表达下降.这点也发现在克隆的祖细胞和一些细胞系的干细胞。
尽管CD34功能未知，但现在认为它参与早期造血CD34是HSCs的标志物的理论近年受到挑战。
Osawa等人首先证明小鼠HSCs可以是CD34阴性。
并且，人的CD34阴性细胞也有低水平的嫁接和造血能力。
移植研究表明胎绵羊CD34阴性细胞有重新繁殖的能力。
并且也表明人和鼠的CD34阳性细胞可能来源于CD34阴性细胞。
总的说来，这些报告提示，HSCs可能是CD34+或CD34-。
CD133和CD34CD133是一种独特的干细胞标志，分子量为120kDa，具有5个跨膜区，曾命名为AC133。
2000年，在英国Harrogate举行的第7届人类白细胞分化抗原国际工作会议（7th International Workshop on Human Leucocyte Differentiation Antigens，HLDA7）上被正式命名为CD133。
CD133抗原可被3种CD133抗体识别：克隆AC133、293C3和AC141。
AC133直接与CD133/1糖基化抗原表位结合，可用于从外周血、骨髓、脐带血及其它组织中分析和分选CD133+细胞。
单克隆抗体293C3和AC141识别抗原表位CD133/2，主要用于MACS分选后CD133+细胞的荧光染色。
多数情况下CD133/1和CD133/2识别同种细胞，只是有表达强度的差别，但是在骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）和某些急性髓性白血病（acute myeloid leukemia，AML）中发现CD133/1和CD133/2表达不同，或者正常表达强度紊乱。
造血系统中，CD133在35-75%的CD34+细胞亚群上表达，主要见于人类胎肝、骨髓、脐带血、外周血中CD34bright干细胞和前体细胞，包括CD34bright、CD38neg/dim、HLA-DRneg/dim、CD90+和CD117+细胞。
此外，CD133也见于这些组织的一小部分CD34-细胞，在成熟的血细胞上不表达。
与CD34抗原不同的是，CD133在晚期祖细胞，如前B细胞、红系集落形成单位（colony forming unit-erythrocyte, CFU-E）、粒系集落形成单位（colony forming unit-granulocyte, CFU-G）上不表达。
最近发现CD133也表达于内皮前体细胞、胎儿神经干细胞和发育中的上皮细胞。
一造血干细胞分离（一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。
4℃400 g离心10 min得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。
2 percoll液密度梯度离心法①按体积比为(1.5～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。
4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。
取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。
②取鼠股骨和胫骨, 在两头关节处切开骨骼, 反复用培养基冲洗骨髓腔, 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上, 2 000 r / min 离心20 min。
吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。
3 Ficoll分离法方法一在15ml分离管中加7.5ml比重为1.017的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。
方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM 洗涤细胞两次，每次以1000r/min离心10min，去上清液。
（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。
取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。
在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼, 反复用PBS 缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。
造血干细胞 marker 基因
造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells，HSCs）是一类具有
自我更新和多能性的干细胞，它们能够不断分化并产生各种血液细胞。
在HSCs的表面，有一些特定的标记物（marker）和基因表达，
用于鉴定和研究这些细胞。
以下是一些与HSCs相关的标记物和基因：
1. CD34，CD34是HSCs表面的一种标记物，它在HSCs和一些
早期血细胞的表面上高度表达。
CD34阳性细胞通常被认为是具有造
血干细胞活性的细胞。
2. CD133，类似于CD34，CD133也是HSCs的标记物，它在人类
和小鼠的HSCs中都有表达。
3. c-Kit（CD117），c-Kit是一种受体酪氨酸激酶，它在HSCs
和其他干细胞中都有表达，并且在干细胞的增殖和存活中起重要作用。
4. Sca-1，Sca-1是小鼠的一个表面标记物，它在小鼠的HSCs
中具有表达，但在人类中并不常见。
5. GATA-2，GATA-2是一个重要的转录因子，它在HSCs的发育和功能中发挥关键作用，是HSCs特异性基因的调控因子之一。
除了上述标记物和基因外，还有许多其他分子和基因与HSCs的特性和功能密切相关，例如CD38、CD90、CD45等标记物，以及HOXB4、Notch信号通路相关基因等。
这些标记物和基因的研究有助于我们更好地理解HSCs的生物学特性和临床应用，对于造血干细胞移植、干细胞治疗等方面具有重要意义。
希望这些信息能够帮助你更全面地了解造血干细胞的标记物和基因。
ＣＤ３４＋细胞计数 外周血现已被广泛地被用作骨髓移植、癌症患者接受大剂量化疗或放疗后骨髓重建造所需血干细胞（Hemotopoietic Progenitor Cells HPC）的来源。
外周血源性干细胞现主要被运用自体移植，其应用面也逐步拓展至异基因骨髓移植中。
使用外周血替代骨髓作为造血干细胞的来源有着以下优点：1，易采集；2，对供者无需全身麻醉；3，减少了采集后并发症的发生；4，受者造血系统重建快；5，费用低；6，住院时间缩短或可部分或全部在门诊处完成操作。
相对于骨髓，外周血中的造血干细胞一般只出现一次高峰，其数量取决于供者血体积和/或单个核细胞的数量。
由于外周血中造血干细胞含量很低，固常规中运用多极分离技术来收集这些细胞。
在早期临床研究中，收集的干细胞作为移植物数量是否足够很不清楚。
因为要检测这些细胞数量需要使用集落形成实验，但此法明显不适用于临床，因其大致需要12-15天时间出结果，故无法满足临床中当天出报告决定移植是否继续的要求。
此问题自发现CD34抗体可鉴别造血干细胞，并成功地被运用流式细胞仪定量检测造血干细胞后被圆满解决了。
CD34+造血干细胞植活最低数量要求是2-5 x 106/公斤体重。
然而正常人外周血中干细胞数量只占所有有核细胞的0.1%。
很明显这些数量的干细胞是不足够运用于移植的，除非使用恰当技术增加外周血干细胞的含量供采集。
此技术可通过给予供者集落刺激因子（通常是粒或粒-单集落刺激因子），同时可联合骨髓抑制剂（如环磷酰胺）的方法动员造血干细胞进入循环外周血中。
联合使用化疗药物与集落刺激因子造成短暂的循环血中髓系细胞抑制，随后使骨髓代偿性地释放髓祖细胞、造血干细胞至外周血，从而达到动员干细胞的目的。
联合使用细胞毒药物与集落刺激因子可延长抑制时间，相对于单独使用集落刺激因子可增加动员至外周血中的干细胞。
对于正常人供者不可使用化疗药物来抑制外周血，常使用G或GM-CSF、血小板刺激因子来动员。
关于如何使用动员药物请参见其他相关文献。
早期外周干细胞计数在尚未应用流式细胞仪定量检测CD34+细胞时，外周血干细胞计数常运用单位-粒/巨噬细胞集落形成实验间接求得。
这项检测技术通过直接计数干细胞形所的集落来反映干细胞的数量，故被认为是检测是否存干细胞的金标准。
但也有学者置疑此检测是否与移植成活率有很好的相关性。
因为在这项技术中，各研究单位缺乏统一的检测标准；刺激因子不同的处理方法和不同的配伍使用；集落形成后不同的计数方法都造成了统计数据具有很大的变异性。
常规体外集落形成实验主要检测髓系祖细胞并要求大约14天取得结果，使得该项检测无法来确定临床何时采集干细胞；所以以前只根据循环血中的最大集落数（CFU而非CFU-GM）来确定采集多少细胞。
使用CD34识别造血干细胞自从发现、纯化、标记抗CD34单克隆抗体开始，使流式细胞定量检测在外周血或骨髓中的CD34阳性造血干细胞成为了可能。
CD34抗原存在于各种祖细胞上，其中包括多能干细胞和间质干细胞。
在某些组织的上皮细胞上也有表达。
CD34抗原的分子量为105-120KD，具有一个高度糖基化的类粘蛋白的结构。
内皮细胞的CD34抗原与L选择素结合，然而造血干细胞上的CD34抗原的配体至今还未发现，有学者认为此抗原在细胞粘附中起作用。
通过技术支持： 电子邮件：service@与不同特异性的Vibrio cholera神经氨酸苷酶和Pasturella hemolytica起源的糖蛋白酶作用可区分出此抗原的不同位点。
这些位点根据其与不同的抗体结合情况可分为I，II和III 类，最近有报道I和II类抗原应属同一家族，因为它们具有相似的抗原结构和功能属性。
这些研究都是基于交叉封闭实验的，故不可作为评价抗体结合效率或抗原空间结构之用。
II类抗原位点具有由非糖基化氨基酸构成的线性申展结构，四周由在远N未端组成CD34的I抗原的类糖酶结构环绕。
尽管I类与II类抗原几乎合二为一，但它们化学和物理性质是不同的． Siena领导的工作组是第一个报道使用流式细胞仪定量检测CD34+造血干细胞的含量，来决定动员干细胞及采集最佳时间，并研究CD33在干细胞上的表达与移植效果的相关性。
CD34阳性细胞运用SSC与CD34双参数流式点图来检测。
在此项研究中发现所有的CD34阳性细胞均与形成CFU-CM集落相关；并证实CD34+细胞计数是决定干细胞采集时间有效方法。
此外，Fritsch及其工作组发现CD34阳性细胞比例与外周血单个核细胞数量和CFU-GM和CFUGEMM检测的集落形成能力有相关性。
这些结果被其他学者相继证实，并使流细胞仪成为定量检测CD34+细胞成为监测动员干细胞和计数移植中造血干细胞数量的有效、精确的工具。
尽管以前工作已证实造血干细胞表达CD34抗原，但鉴别多能干细胞的复杂工作才刚刚开始。
Siena及其工作组发现CD34+CD33+双阳性细胞数量与早期移植成功有相关性。
同时Tertappen注意到骨髓中提取的CD34+CD38-阴性的细胞在IL-3，IL-6和GM-CSF刺激下能够形成最原始的集落；随着CD38抗原的增加，CD34阳性细胞形成这种原始集落的能力下降。
在CD34+细胞中，CD34+CD38-表型的细胞占1.0%左右。
随后又发现了其他细胞表面抗原在识别多能干细胞中起着重要作用。
对于绝大多数临床应用来说，计数CD34阳性细胞已足够为移植提供可靠、持久的参数。
然而计数更为原始的多能干细胞能够提供其他重要的信息，所以有必要发展下面将叙述的技术来达成此目标。
此外可发现、鉴别更新的一些干细胞抗体来提供更为直接的检测方案，如：ACC-133和F84.1。
在达到一个稳定、长期的移植成功的疗效中，CD34+阳性细胞最少需求量方面还存在争议。
Bender发现大约2x106 CD34+细胞/公斤体重的剂量能够保证可靠的移植成功率。
在许多病例中，这个剂量很容易从动员的病人或正常人中收集到。
Bensinger及其工作组发现CD34+阳性细胞与血小板、粒细胞重建时间有很强的相关性，并建议CD34+细胞最佳剂量是5x106/kg。
一个对692例自体移植病例研究也得出了相似的结论。
在移植前处理治疗中，病人的耐受性及用药的强度等因素会造成以上情况，Tricot等观察225例接受PBPC移植的病例和经PBPC输入治疗了难治性骨髓瘤患者，发现以上因素使自体移植中CD34+细胞的最佳剂量各不相同。
此研究表明，对于移植前接受化疗少于24个月的病人，快速植活剂量应>2.0 X 106 CD34+细胞/kg；对于长期接受全身化疗的病人（大于24人月）最低剂量则为>5.0 X 106 CD34+细胞/kg。
此处接受短期化疗的病人更容易、快速地取得CD34+细胞。
总而言之，这些研究表达2-5 X 106 CD34+细胞/kg的剂量对于大多数情况下是足够的，但也有研究表明更高剂量的CD34+细胞移植能够帮助病例更容易克服组织相容性问题。
以下将要讨论有关CD34+细胞的检测技术，有些推荐剂量之间的差异正是由于检测方案不同所引起的。
CD34检测方案变异系数及其标准化流式细胞CD34干细胞计数为成为应用广泛的实时检测PBPC是否足够移植的有效方法。
对动员后供者循环外周血中CD34+细胞绝对计数能够预测采集物中干细胞的数量，并越来越多地用来决定何时可开始采集干细胞。
根据CD34阳性细胞在样本中的含量将决定是技术支持： 电子邮件：service@否继续给予生长因子刺激、采集是否继续。
每次干细胞采集需要志愿者在护士的照顾下进行3-4个小时的干细胞分离过程，采集的细胞在体外需要进行特殊的处理或进行低温保存。
从治疗时间及消耗资源的意义上来说，以上动员、采集过程的费用是非常昂贵的，对于有经济困难的患者来说此部分的费用占了移植总费用的重要比例。
在早期的研究中，干细胞动员方案还未被应用，运用全部有核细胞计数作为移植物采集指标；有时会为单个病人采集相当于现在20倍数量的细胞用于移植，这不仅会增加标本保存成本，还会带来病人体液过量的临床问题。
CD34+细胞计数作为移植物采集量化标准解决以上所及的许多问题，但它也带来许多新的疑问。
米兰方案第一个广泛应用的干细胞计数方案是由Istituto Nazionale Tumori in Milan的Siena等人创立的米兰方案（Milan Protocol）。
在此方案中，需准备三管50 ul的血样或leukapheresis 样本（如白细胞计数小于150ul，如受者样本，则样本和抗体均需加倍）；其中一管留出不作染色，一管加入15ul的抗CD34和CD33抗体，第三管则加入15ul的抗CD2/CD19抗体（计数T、B细胞）。
细胞在4℃下避光孵育25分钟，之后加入红细胞裂解液。
孵育15分钟后加入不含钙、镁离子的PBS洗液300g 离心7分钟洗涤，如果红细胞裂解不彻底则可重复裂解过程。
弃上清后细胞可在4℃保存并于一小时内上机检测。
在光散射参数中分析所有细胞，建立门圈定所有白细胞（排除碎片），并设立一门去除有自发荧光的细胞。
在调节完补偿后，分析10000个细胞，CD34+细胞可通过低SSC信号和CD34阳性表达加以区分。
CD34弱阳性细胞一般不分析。
目前有很多米兰方案的改进版，分别从：运用不同的CD34抗体、不同的溶血技术、加入其他抗体来提高鉴别力、变换荧光标记、使用CD45抗体或其他核酸染料来更方便地鉴别白细胞等方面进行改进。
运用这些技术后，报道的移植所需足够的并且能快速完成的CD34+细胞数量有着巨大差异。
经过仔细研究发现这些差异是由于在CD34细胞计数过程中运用了不同的标本处理、染色和分析方法造成的。
因为在未动员的正常外周血中，CD34阳性细胞通常小于全部有核细胞的1%，在经G-CSF动员后志愿者外周血中会大于5%（有时在用血小板形成因子动员时可大于20%），对它们的精确计数对许多流式实验室是个重要的挑战。
特别在计数小于1%时，又要做出检测来决何时进行采集时，精确计数显得格外重要。
Multi-Center方法研究报告Multi-Center研究所在北美、欧洲、澳大利亚所做的一系列研究使得在精确计数中存在技术支持： 电子邮件：service@的储多问题逐步浮出水面。
其中的一些问题最先在法国马赛招开的欧洲外周血干细胞计数研讨会中提出。
在此次会议中，讨论了临床的CD34计数的价值与在各种检测方案中所应用的不同技术。
并就外周血干细胞计数标准方案达成了一致。
推荐方案中要求标本需预先作白细胞计数，用来染色的标本体积根据对CD34+细胞数量估算来决定，分析时要求收集足够的有统计学意义的标本数量。
方案中推荐使用双标记方法染色，其中包括将2 ul的PE标记的CD3抗体和10ul的FITC标记的CD34抗体（QBEnd10）加入250ul的全血进行染色，室温下孵育20分钟，每5分钟用移液器吹打混匀一次；随后加入Ortho公司的红细胞裂解液孵育9分钟，每3分钟震动混匀一次；之后细胞在300g离心三分钟洗涤一次并用PBS重悬。
