高效率构建包含内含子的hpRNAi植物载体高效率构建包含内含子的hpRNAi植物载体摘要在植物基因功能分析中广泛使用的双链RNA干扰（RNAi），是一种高效率的系统，对于制作发夹RNA（hpRNA）结构有一个很大的需求量。
在这里，我们描述了一种新的限制性连接方法，提供了包含内含子的hpRNA（ihpRNA）载体的一种简单而高效的建设。
该系统以优势型IIS的限制性内切酶BsaI和我们新的植物RNAi载体pRNAi-GG（GG）以GG克隆为基础。
这种方法需要有感兴趣的基因的BsaI 识别序列侧翼只有一个单一的PCR产物，然后可以克隆到pRNAi-GG 上在正方向和反方向同时形成ihpRNA的构造。
在这个过程中，在一个管与一个限制性连接步骤完成后，产生的重组ihpRNA具有高效率和零背景。
我们证明与pRNAi-GG载体向量生成的ihpRNA结构的效用有效沉默各种单独的内源和外源标志物基因以及同时沉默这两个基因。
此方法提供了植物功能基因组学的大规模分析的新颖的和高效率的平台。
介绍在双链RNA被发现作为一体的能触发RNA干扰（RNAi）之后[1]，RNA干扰也成为一个基因功能[2-4]分析的最强大的工具。
发夹RNA（hpRNA）结构通常用于通过RNA干扰[5]的机制来诱导靶基因的degra-dation。
在植物中，含有发夹RNA的内含子（ihpRNA）配有一个内含子作为间隔序列表示出了最高基因沉默效率[6]。
因此，ihpRNA结构已被广泛用于植物中的基因沉默。
与在植物中基因序列的爆炸性释放和基因组序列，高效率和成本制作ihpRNA结构系统需求量很大。
为了便于ihpRNA结构的产生，几种方法已经被报道。
传统的连接酶的载体如pHANNIBAL和pKANNIBAL首次使用生成ihpRNA结构[6]。
该方法需要几轮限制和连接，并且因此，比较乏味和耗时。
有一种可替代地方法，GATEWAY 克隆系统为基础的RNAi载体如pHELLSGATE系列和PIPK系列已被广泛用于产生ihpRNA结构[7-9]。
碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology 订货热线：400-1683301或800-8283301 订货e-mail ：******************技术咨询：*****************网址：碧云天网站 微信公众号pET-N-His-PreScission-SUMO产品编号 产品名称包装 D2918-1µg pET-N-His-PreScission-SUMO 1µg D2918-100µgpET-N-His-PreScission-SUMO100µg产品简介：pET-N-His-PreScission-SUMO 是一种用于表达N 端同时含有His 标签(His tag)和SUMO 标签(SUMO tag)双标签的目的蛋白的原核表达质粒。
His 标签有利于通过亲和层析方法进行目的蛋白的纯化，而SUMO 标签则有利于改善目的蛋白的折叠，增加目的蛋白可溶性和产量。
表达后的含有目的蛋白的融合蛋白可以通过PreScission Protease (P2302/P2303)酶切去除His 标签但保留SUMO 标签，也可以通过SUMO Protease (P2310)酶切去除N 端的His 和SUMO 两个标签。
如果通过无缝克隆技术(Seamless Cloning Kit, 无缝克隆试剂盒)在SUMO 标签酶切位点后插入目的蛋白ATG 起始的序列，SUMO Protease 酶切后，可以确保表达的目的蛋白氨基端(N 端)刚好从甲硫氨酸(Methione)开始，不会增加或减少任何一个氨基酸，实现目的蛋白的完美正确表达。
本质粒为卡那霉素抗性。
本质粒含有T7启动子/lac 操纵子，可以在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下高效启动目的蛋白表达。
在多克隆位点根据读码框插入目的基因就可以表达N 端含有His 和SUMO 双标签的目的蛋白。
无缝克隆与基因融合基因融合技术是基因功能研究的关键工具。
准确拼接的杂合分子，没有任何无关的序列，使我们可以对分子进行精确的研究。
本篇综述介绍了无缝融合基因和蛋白的应用，以及获得这些杂交分子的方法前言随着各种基因组测序项目的完成，人们越来越关注基因产物的功能分析。
基因融合技术在基因功能研究的许多方面具有重要的作用，包括基因和蛋白标记，报告基因的研究，结构域互换研究，突变研究和基因敲除或者插入实验。
传统的基因融合技术涉及到type II 限制酶消化和DNA连接反应（所谓的剪切/粘贴反应），曾被用来作为构建杂交基因的标准方法。
然而，这种方法常常会在接合处留下操作的序列，例如酶切位点。
这些多余的序列可以改变DNA元件的间隔，在接合处引入多余的氨基酸残基，可能对融合蛋白的结构和功能产生不需要的影响，因此影响对融合基因精确的研究。
这篇综述讨论了精确融合基因的应用之处，概括了实现无缝基因融合的方法。
无缝基因融合及其应用无缝克隆和基因融合就是将两个或者更多DNA片段精确结合在一起，在DNA片段的接合处没有任何不需要的序列。
这是获得杂交基因的理想情况。
以下强调几个例子，以表明无缝基因融合的重要性。
启动子和外显子研究基因启动子含有许多调控元件。
转录因子与它们结合并互相影响来调控转录。
启动子删除分析使我们鉴定到这些功能元件，获得关于基因调控机制的重要信息。
然而，因为不同调控元件之间的间隔常常是非常重要的，通常需要长度不变的linker来维持这些元件的间隔和螺旋面。
基因启动子的linker扫描分析需要无缝DNA融合或者序列替换技术。
分子演化方法例如外显子和DNA转移来获得具有需要生化和/或生理特征的蛋白也需要不同功能元件的无缝拼接。
在真核细胞中，通过内含子介导的RNA拼接可以构建嵌合体基因和/或蛋白。
在这些实验中RNA底物的合成和/或外显子标记核酶需要认真的设计，得到嵌合体前体基因。
只要杂合基因形成正确，无缝融合就可以通过拼接实现。
限制性内切酶酶切位点汇总限制性内切酶（Restriction Endonuclease）是一类存在于细菌体内的酶，它能够识别特定的酶切位点，并在该位点上切割DNA链。
限制性内切酶起源于细菌，原本作为细菌对抗噬菌体感染的防御机制，但现在被广泛应用于分子生物学和基因工程领域。
限制性内切酶的分类和命名依据它们发现的第一个类型的噬菌体。
如EcoRI是从大肠杆菌中分离出的内切酶，与T4噬菌体相关；HindIII是与T4噬菌体有关的内切酶等。
酶名中的缩写首字母通常是酶切位点的首字母，比如EcoRI是指E.coli的RY粘性末端的切点。
现在限制性内切酶已被发现有超过3000多个类型。
下面是一些常见的限制性内切酶的切割位点汇总：1. EcoRI：切割位点为G↓AATTC（↓表示切割位点），产生的切割后的两个DNA片段是G-AATTC和CTTAA-G。
2. HindIII：切割位点为A↓AGCTT，产生的切割后的两个DNA片段是A-AGCTT和TTCGA-A。
3. SmaI：切割位点为CCC↓GGG，产生的切割后的两个DNA片段是CCC-GGG和GGG-CCC。
4. BamHI：切割位点为G↓GATCC，产生的切割后的两个DNA片段是G-GATCC和CCTAG-G。
5. XhoI：切割位点为C↓TCGAG，产生的切割后的两个DNA片段是C-TCGAG和GAGCT-C。
6. NotI：切割位点为GC×GGCCGC，产生的切割后的两个DNA片段是GC-GGCCGC和CGC-GC。
7. EcoRV：切割位点为GAT↓ATC，产生的切割后的两个DNA片段是GAT-ATC和TAC-TAG。
8. KpnI：切割位点为GGTAC↓C，产生的切割后的两个DNA片段是GGTAC-C和CCATG-G。
9. SalI：切割位点为G↓TCGAC，产生的切割后的两个DNA片段是G-TCGAC和CAGCT-G。
10. PstI：切割位点为CTGCA↓G，产生的切割后的两个DNA片段是CTGC-AG和GACG-T。
