实验17 植物抗旱性鉴定
水分亏缺是一种最普遍的影响植物生产力的环境胁迫，尽管蔬菜作物一般都在水源充足的地区栽培，但是通常蔬菜需水量大，而且几乎整个生育期对水分的要求都比较多；而果树大多栽培于丘陵、土地，更易受到水分亏缺的影响。
因此深入研究植物的抗旱性，进行抗旱育种显得特别重要。
抗旱育种的成败在很大程度上取决于拥有抗性资源的多少和深入研究的程度，因此，种质资源的抗旱性鉴定、评价与筛选是抗旱育种的关键环节，受到世界各国育种工作者的重视。
进行抗旱性鉴定所采用的方法很多，主要包括田间直接鉴定法、干旱棚法、人工气候室法、盆栽法及室内模拟干旱条件法等。
这些方法各有优缺点，适用于不同时期、不同目的抗旱性鉴定与研究。
本实验将以抗旱性存在差异的普通小麦品种为试材介绍植物抗旱性鉴定的主要方法和步骤。
一、试材及用具
小麦幼苗，发芽箱，滤纸，培养皿，打孔器，天平，干燥器，电导仪，20ml具塞刻度试管，双面刀片，恒温水浴锅，温度计，玻璃棒，研钵，过滤漏斗，容量瓶（50ml），移液管（2ml、5ml、10ml），高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（反应试管处光照强度为4000lx）；刻度吸管，G3垂熔玻璃漏斗等。
二、方法步骤
（一）田间直接鉴定
当土壤干旱来临时，尤其在小麦孕穗至灌浆阶段发生旱性时，植株因失水而逐渐萎蔫，叶片变黄并干枯。
在午后日照最强、温度最高的高峰过后根据小麦叶片萎蔫程度分5级记载。
级数越小，抗旱性越强。
“1”级无受害症状；
“2”级小部分叶片萎缩，并失去应有光泽，有较少的叶片卷成针状；
“3”级大部分叶片萎缩，并有较多的叶片卷成针状；
“4”级叶片卷缩严重，颜色显著深于该品种的正常颜色，下部叶片开始变黄；
“5”级茎叶明显萎缩，下部叶片变黄至变枯。
以上是根据凋萎程度定性鉴定品种的抗旱性，也可以把各品种分别种植于旱地（胁迫）和水地（非胁迫），测定旱地小区产量和水地小区产量，以下列公式定量评定品种的抗旱性。
抗旱系数（DC）＝）非胁迫下的平均产量（）胁迫下的平均产量（PDYY
抗旱指数（DI）＝的平均值所有品种）旱地产量（）抗旱系数（DDCYYD×
品种的抗旱系数或抗旱指数越大，其抗旱性越强。
（二）发芽试验鉴定
该方法是在室内人工模拟干旱条件，进行小麦芽期抗旱性鉴定。
1．将供试种子置于0.1%氯化汞溶液中，灭菌消毒10～15min；
2．在直径10cm培养皿内放4张定性滤纸，加入15%PEG（聚乙二醇）溶液6ml或17.6%
蔗糖溶液30ml，每皿1个品种，均匀摆放整齐健
康籽粒30粒，重复3～4次；
3．将培养皿放入发芽箱内，25℃发芽7d；
4．分别在萌发后第三天和第七天，测定种子的发芽势和发芽率，评定品种的抗旱性。
也可以同时测定芽鞘长度、根长等，以反映品种的抗旱性强弱。
（三）离体叶片持水力测定
具体测定步骤如下：
1．用万分之一电子天平称量小麦旗叶5～10片（或取幼苗展开顶叶若干片，分别称其鲜重），并对每份样品进行编号，重复3～4次；
2．将称过鲜重的叶片放入25℃～30℃的干燥器中，在黑暗条件下干燥2～6h，再称量失水后叶片的重量；
3．计算每份样品的失水率：
失水率（%）＝%100×鲜重鲜重－失水后重
计算出每一供试品种叶片的平均失水率，并进行比较。
一般抗旱性强的品种叶片持水力高于抗旱性差的品种。
（四）游离脯氨酸含量的测定
用磺基水杨酸提取植物体内的脯氨酸，不仅大大减小了其他氨基酸的干扰，快速、操作简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。
酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。
脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。
2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mol/L磷酸以3:2混合，作为溶剂进行配制，于70℃下加热溶解，冷却后置棕色试剂瓶中，4℃下保存备用，两天内稳定。
1．绘制脯氨酸标准曲线
（1）称取10mg脯氨酸，蒸馏水溶解后定容至100ml，其浓度为100μg/ml母液。
（2）取母液0.0、0.5、1.25、2.5、5.0、7.5、10.0ml分别放入7个50ml容量瓶中，再分别加入蒸馏水定容至50ml，配成0.0、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0μg/ml的系列溶液。
（3）别取上述各溶液２ml，加入已编号的7个试管中，再分别加入２ml冰醋酸，4ml酸性茚三酮试剂，2ml磺基水杨酸溶液；
（4）摇匀后，用玻璃盖上试管口，在沸水浴中反应2h；
（5）将试管取出，冷却至室温，然后向各试管中加入４ml甲苯，手工充分震荡后，静置约10min，红色反应产物被萃取到甲苯层；
（6）用滴管吸取红色的甲苯萃取液于比色皿中，在分光光度计520nm波长处测定吸光度；（7）以脯氨酸含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
2．游离脯氨酸的提取
称取0.3g叶片鲜样（来自经干旱处理和对照的不同材料），剪碎后放入具塞试管中，加5ml 3%磺基水杨酸溶液，加塞后在沸水浴中提取10min，过滤液待测。
3．游离脯氨酸的测定
取提取液2ml于具塞试管中，加入2ml蒸馏水、2ml冰醋酸和4ml酸性茚三酮试剂，摇匀后在沸水浴中加热显色2h，取出后冷却至室温，加入4ml甲苯，充分摇匀以卒取红色产物。
静置约10min，吸取甲苯层，于分
光光度计520nm波长处测定吸光度。
4．计算样品中的脯氨酸含量
脯氨酸含量（μg/g）＝（C×V/A）/W
或
脯氨酸含量（%）＝（C×V/A）/W×10-4
式中：C—由标准溶液查得脯氨酸μg数；
V—提取液总体积（ml）；
A—测定液总体积（ml）；
W－样品重（g）；1g＝106μg。
对许多植物的研究表明，在水分胁迫时，出现游离脯氨酸的大量积累，所以很多研究者主张可将脯氨酸积累的数量作为植物抗旱性的指标。
但是，也有些研究表明，各种植物（包括小麦）品种在水分胁迫时，脯氨酸的积累有很大差异，有些抗旱品种在轻度干旱胁迫时脯氨酸含量并不增加，而一些不抗旱品种，器官组织内部水势下降快，游离脯氨酸积累也快。
因此，用脯氨酸积累作为抗旱鉴定指标时，应结合其它抗旱鉴定指标一起评价。
（五）甜菜碱含量的测定
甜菜碱最早在旱生植物宁枸杞中发现，已知有12种，目前研究最多的是甘氨酸甜菜碱（Glycine betaine），简称甜菜碱，它广泛存在于开花植物的各器官。
甜菜碱在细胞内的积累可提高细胞的渗透调节能力，稳定细胞内大分子蛋白质与生物膜的结构和功能，还可保护细胞内许多重要代谢活动所需酶类的活性。
作为一种非毒性的渗透调节剂，甜菜碱在植物抗逆生理中起着非常重要的作用，研究表明，甜菜碱的积累水平与植物抗胁迫能力成正比。
1．溶液配制
雷氏盐溶液：精密称取1.5g雷氏盐，加水至100ml，用盐酸调pH值为1，室温搅拌45min，须在用前配制。
甜菜碱提取液：甲醇：氯仿：水=12：5：3（V/V）。
甜菜碱标准液：精密称取甜菜碱100mg，用蒸馏水移入100ml容量瓶中，待完全溶解后稀释至刻度，即得浓度为1mg/ml的标准液。
2．标准曲线绘制
标准曲线的绘制，将标准液按每毫升含0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg配制溶液，吸取以上溶液各3.0ml，水浴放置3h，用G3垂熔玻璃漏斗过滤，3×3ml乙醚洗沉淀，待乙醚挥干，用3×5ml 70%丙酮溶液解沉淀并转移至25ml容量瓶中，用70%丙酮溶液补充至刻度，用70%丙酮溶液作空白，在525nm处测其吸光度。
3．甜菜碱的提取
称取1g左右小麦叶片（来自经干旱处理和对照的不同材料），加入10ml甜菜碱提取液，研磨，研磨液于温水浴中保持10min，冷却后于20oC离心10m分钟，收集上层水相，下层氯仿相再加入10ml提取液（甲醇:氯仿:水=12:5:3（V/V））；再离心，取上层水相，下层加入4ml50%甲醇，离心，然后将上层水相合并，调PH5～7，70oC蒸干，再用5ml水溶解。
4．甜菜碱的测定
吸取待测液3.0ml，水浴放置10min，取出，滴加5ml雷氏盐溶液，冷水浴放置3h，用G3垂熔玻璃漏斗过滤，乙醚洗沉淀，待乙醚挥干，用70%丙铜溶液溶解沉
淀并转移至25ml容量瓶中，用70%丙酮溶液补充至刻度。
70%丙酮溶液作空白，在525nm处测其吸光度光度，由标准曲线中查出甜菜碱的含量。
植物体内超氧物歧化酶活性、丙二醛含量及植物组织浸泡的电导率等生理生化指标也可作为抗旱鉴定评价指标，具体测定方法见本教程的实验40，在此不再详述。
三、作业思考题
1．分析比较植物抗旱性鉴定的各种方法的有效性，你认为鉴定植物抗旱性时应注意什么问题？
2．在进行游离脯氨酸含量的测定时，若改变萃取剂，则比色应做哪些改变？如何选择
最适波长？如何选择最佳萃取剂？。
