饲料中粗蛋白的测定方法
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饲料中粗蛋白的测定方法
本标准参照采用ISO 5983—1979《动物饲料—氮含量的测定和粗蛋白含量计算》1.1主要内容与适用范围
本标准规定了饲料中粗蛋白含量的测定方法。
本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料。
1.2引用标准
GB 601 化学试剂滴定分析(容量分析)用标准溶液的制备
1.3原理
凯氏法测定试样中的含氮量,即在被催化剂的作用下,用硫酸破坏有机物,使含氮量转化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出,用硼酸吸收后,再用酸滴定,测出氮含量,乘以换算系数6.25,计算出粗蛋白含量。
1.4试剂
1.4.1硫酸(GB 625):化学纯,含量为98%,无氮。
1.4.2混合催化剂:0.4g五水硫酸铜,6g硫酸钾或无水硫酸钠,均为化学纯,
磨碎混匀。
1.4.3氢氧化钠(GB 629):化学纯,40%水溶液(M/V)。
1.4.4硼酸(GB 628):化学纯,2%水溶液(M/V)。
1.4.5混合指示剂:甲基红0.1%乙醇溶液,溴甲酚绿0.5%乙醇溶液,两溶液等
体积混合,在阴凉处保存期为三个月。
1.4.6盐酸标准溶液:邻苯二甲酸氢钾法标定。
1.4.70.1mol/盐酸(HCL)标准溶液:8.3ml盐酸(GB 622),分析纯,注入1000ml
蒸馏水中。
1.4.80.2 mol/盐酸(HCL)标准溶液:1.67ml盐酸(GB 622),分析纯,注入
1000ml蒸馏水中。
1.4.9蔗糖(HG 3—1001):分析纯。
1.4.10硫酸铵(GB 1396):分析纯,干燥。
1.4.11硼酸吸收液:1%硼酸水溶液1000ml,加入0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10ml,
0.1%甲基红乙醇溶液7ml,4%氢氧化钠水溶液0.5ml,混合,置阴凉处保
存期为一个月(全自动程序用)。
1.5仪器设备
1.5.1 实验室用样品粉碎机或研钵。
1.5.2 分析筛:孔径0.42mm(40目)。
1.5.3 分析天平:感量0.0001g。
1.5.4 消煮炉或电炉。
1.5.5 滴定管:酸式(A级),10、25mL。
1.5.6 凯氏烧瓶:250mL。
1.5.7 凯氏蒸馏装置:常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式。
1.5.8 锥形瓶:150、250mL。
1.5.9 容量瓶:100mL。
1.5.10 消煮管:250 mL。
1.5.11 定氮仪:以凯氏原理制造的各类型半自动、全自动蛋白测定仪。
1.6试样的选取和制备
选取具有代表性的试样用四分法缩减至200g,粉碎后全部通过40目筛,装于密封容器中,防止试样成分的变化。
1.7分析步骤
1.7.1 试样的消煮
称取试样0.5g~1g(含氮量5mg~80mg)准确至0.0002g,无损失地放入凯氏烧
瓶中,加入6.4g混合催化剂与试样混合均匀,再加入12 mL硫酸和2粒玻璃珠,将凯氏烧瓶置于电炉上加热,开始小火,待样品焦化,泡沫消失后,再加强火直至呈透明的蓝绿色,然后再继续加热,至少2h。
1.7.2 氨的蒸馏
1.7.
2.1 常量蒸馏法
将试样消煮液冷却,加入60 mL~80 mL蒸馏水,摇匀,冷却。将蒸馏装置的冷凝管末端浸入装有25 mL硼酸吸收液和2滴混合指示剂的锥形瓶内。然后小心地将凯氏烧瓶中加入50 mL氢氧化钠,轻轻摇动凯氏烧瓶,使溶液混合均匀后再加热蒸馏,直至流出体积为100 mL。降下锥形瓶,使冷凝管末端离开液面,继续蒸馏1min~2min,并用蒸馏水冲洗冷凝管末端,洗液均需流入锥形内,然后停止蒸馏。
1.7.
2.2半微量蒸馏法
将试样消煮液冷却,加入20 mL蒸馏水,转入100 mL容量瓶中,冷却后用水稀释至刻度,摇匀,做为试样分解液。将半微量蒸馏装置的冷凝管末端浸入装有20 mL硼酸吸收液和2滴混合指示剂的锥形瓶内。蒸汽发生器的水中应加入甲基红指示剂数滴,硼酸数滴,在蒸馏过程中保持此液为橙红色,否则需补加硫酸。准确移取试样分解液10 mL~20 mL注入蒸馏装置的反应室中,用少量蒸馏水冲洗进样入口,塞好入口玻璃塞,再加入10 mL氢氧化钠溶液,小心提起玻璃塞使之流入反应室,将玻璃塞塞好,且在入口处加水密封,防止漏气。蒸馏4min降下锥形瓶使冷凝管末端离开吸收液面,再蒸馏1min,用蒸馏水冲洗冷凝管末端,洗液均流入锥形瓶内,然后停止蒸馏。
1.7.
2.
3. 蒸馏步骤的检验
精确称取0.2g硫酸铵,代替试样,按7.2.1或7.2.2步骤进行操作,测得硫酸铵含氮量为21.19%±0.2%,否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。
1.7.3 滴定
用7.2.1法蒸馏后的吸收液立即用0.1mol/L或0.02mol/L盐酸标准溶液滴定,溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。
1.8 空白测定
称取蔗糖0.5g,代替试样,按5测定步骤进行空白测定,消耗0.1mol/L盐酸标准溶液的体积不得超过0.2mL。消耗0.02mol/L盐酸标准溶液体积不得超过
0.3mL。
1.9 分析结果的表述
1.9.1 计算见下式:
粗蛋白质(%)= (V2—V1)×C×0.0140×6.25/m×V’/V×100 ——滴定试样时所需标准酸溶液体积,mL;
式中: V
2
V
——滴定空白时所需标准酸溶液体积,mL;
1
C——盐酸标准溶液浓度,mol/L;
m——试样质量,g;
V——试样分解液总体积,mL;
V’——试样分解液蒸馏用体积,mL;
0、0140——与1.00ml盐酸标准溶液【c(HCL)=1.000mol/L】相当的、以克表示的氮的质量。
6.25——氮换算成蛋白质的平均系数。