中科大gene作业
- 格式：doc
- 大小：10.48 MB
- 文档页数：21
Chapter 19 Homologous and Site-Specific Recombination
1.
Please explain why most of engineering E. coli cell strain for protein over-expression has the genetic type of RecA- ?
(3 points)请解释为什么对于蛋白过度表达的大多数工程大肠杆菌细胞株具有遗传型的RecA-
答：大肠杆菌中的RecA蛋白是第一个被发现的DNA链转移蛋白，这类蛋白质在重组中起着核心作用，促进单链DNA片段与同源双链DNA片段发生链置换。如果某质粒可能携带可作为大肠杆菌重组系统的底物的DNA重复序列，那就应该考虑换用重组缺陷型菌株的可能性。用携带有recA基因突变的菌株就几乎没有重组的可能性，这就保证了质粒的稳定。
2. Please read Invitrogen catalog, and explain how a single Gateway entry plasmid can be applied for multiple different
applications. Detail description is expected. (7 points)
答：Gateway技术是一项基因克隆和表达的新技术，在构建好一个入门克隆后不再需要使用限制性内切酶和连接酶。可以直接转移目的基因到Gateway兼容的各种表达载体。由于重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而不必再对新的表达克隆进行测序。这样，在使用每一种新的表达系统时，将会节省更多时间。目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。
Gateway技术基于已深入研究的λ噬菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）（图一）。BP和LR两个反应就构成了Gateway技术。 BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体(Donor
vector)之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。Gateway表达克隆仅需两步（图二）：
1 创建入门克隆，通过PCR或者传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。
2 混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体以及Gateway LR Clonase酶，构建表达克隆（表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析）。
在BP反应中，基因转移形成入门克隆；在LR反应中，入门克隆可以作为反应物产生最终的表达克隆。
用Gateway技术利用了位点特异重组，进行克隆可以去除用多种限制性内切酶克隆的繁琐步骤，可以方便地将目的片段转入多个表达系统（细菌、酵母、昆虫或哺乳动物）。并且克隆效率达95%以上。当基因快速简便地进入目的表达载体时，还能保证正确的方向和阅读框。Gateway也有助于进行带不同数目纯化和检测标签的表达。
3. Please read textbook carefully, briefly design a method to distinguish “sequential exchange” or “concerted cutting”
during recombination between attP and attB. (5 points)
答：att位点对于序列有独特的要求，attP比attB长得多。attP完成功能需要240bp长的序列，而attB仅需要23bp 的片段，从-11位到+11位，其中核心序列的每边仅需要4bp。片段长度的大小差异，说明attP和attB在重组中执行不同的功能，所以可知attP提供了更多的信息，使得它能区别于attB。那么，在attP与attB重组的过程中，是使attP和attB链同时切断并发生交换；还是链每次交换一对位点，第一次交换产生Holliday连接点，第二次切出缺口和连接发生使这个连接点释放？“自杀底物”可以使重组反应停留在中间体的阶段，此时核心序列被切开，而这个切口干扰了重组过程，这样就可以识别出已经起始重组但还未完成的分子，这些中间体结构表明单链交换是按前后顺序发生的。
4. Please read textbook carefully and describe differences between type I topoisomerase and type II topoisomerase.
答：DNA拓扑异构酶是可以催化DNA拓扑结构变化的酶。它们暂时解开DNA的一条或两条链，使没有断裂的链穿过缺口，然后重新封住缺口。I型拓扑异构酶在DNA中的一条链上产生一个暂时的缺口，II型拓扑异构酶引入一个暂时的双链断裂。I型拓扑异构酶不需要ATP，每一次链环数的改变为1；II型拓扑异构酶需要能量ATP，链环数以2的倍数发生改变。
大肠杆菌中有4种拓扑异构酶,称为拓扑异构酶I、Ⅲ、Ⅳ和DNA促旋酶。DNA拓扑异构酶I和Ⅲ是I型酶; 促旋酶和DNA拓扑异构酶Ⅳ是II型酶。
I型拓扑异构酶与其中的一个断裂末端形成共价键，使其环绕另一条链，然后将共价键连接的末端与另一个
断裂末端相连。因为保留了键，所以这种反应不需要能量。大肠杆菌促旋酶是II型拓扑异构酶，需要ATP水解提供引入DNA负超螺旋的能量。
Chapter 20 DNA Repair System
1. Please list RecA’s function in both DNA recombination and DNA repair (5 points)
答：在DNA重组中：
RecA具有的处理DNA活性使一条单链能与一条双链体中的同源部分发生置换，这个反应称为单链同化。这个置换反应可以发生在几种不同构型的分子之间，并需要三个一般性条件：
其中一个DNA分子必须有单链区域；有一个分子必须有游离的3’端；单链区域和3’端必须位于这两个分子的互补区域中。
单链同化与重组的起始密切相关。单链同化需要一个中间体以使两条单链从一条双链体交叉到另一条，RecA可以催化这个阶段的反应。在细菌中，RecA作用于RecBCD所产生的底物，而RecBCD介导的解链和切割可以产生起始异源双链体连接点形成的末端，RecBCD在chi位点切开释放出3’端，RecA可以携带含此3’端的单链并使它与同源的双链体序列作用，于是就产生了联合分子。
在DNA修复中：
RecA蛋白直接参与重组修复，它还有另一个功能：可以被许多导致DNA损伤或抑制大肠杆菌复制过程的处理激活，这些处理使它引发一系列复杂的表型变化，称为SOS应答。起始应答的事件是RecA被损伤处理所激活，RecA的激活引起LexA基因产物的蛋白酶解切割，这种LexA发生自我切割后导致其自身的阻遏操纵子的活性失活。LexA蛋白能抑制许多基因的表达，包括起修复作用的recA和lexA。RecA的激活引起LexA蛋白的水解，从而诱导所有这些基因表达。
在重组修复系统中，首先RecBC参与在一条子代双链体中产生单链末端，然后被RecA用来与另一条子代双链体配对。
2. Please briefly describe differences between excision repair and recombination repair (5 points)
答：外切修复系统是把DNA链从损伤位点移去，然后替换它；而重组修复系统是利用重组来替换损伤的双链体区域。理论上，外切修复途径可以发生在任何时间，但是重组修复在一条带有损伤序列拷贝的双链体存在时才能发挥作用，也就是说，它发生在复制以后。具体差别如下：
识别酶能辨别出实际的损伤碱基或DNA空间路径上的改变，由此由识别酶所启动的外切修复系统（excision
repair）通常能校正错配。这个系统有两种类型：碱基外切修复和核苷酸外切修复。
而重组修复系统的一个主要作用是重新启动停滞的复制叉。当复制叉遇到损伤，会停止前移，停滞复制叉结构与两条DNA双链体重组产生的Holliday连接点相同，所以成为解离酶的靶标。如果解离酶切割互补链中的任何一对，双链断裂就能产生。这可以用重组系统来修复。
3. Please think about the advantage/disadvantage of the mutation based exploration of biological process and
molecular mechanism of some biological processes. Is there any alternative route to explore biological
questions? If yes (sure, there is), please briefly describe your comments and suggestions. (10 points)
答：优点：碱基突变包括碱基的添加、删除、点突变等。碱基突变是研究生物学过程和其中一些分子学机制的有力工具。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质结构或结构域。对于某些对生物体有影响的碱基，通过这种突变的方法，可以了解基因在生物体中的作用。
缺点：对于一些在生物体中作用不明显的基因，不能通过这种方法对基因的功能有所了解。另外，有一些基因是突变致死的，也不能通过突变的方法来研究其功能。
另外一些研究的方法：
1.可以通过查与其同源的基因在其它生物尤其是亲缘关系很近的生物体内是否有已知功能，来推测想了解的
基因的功能。
2.寻找该基因过量表达的个体，观察表型和一般个体的差异，也可以作为研究其功能的参考。
3.通过RNAi沉默这个基因，干扰基因的表达，来研究基因的功能。
基因簇
Chapter 21, 22 Transposon & Retroviruses and Retroposons
1. Both plasmids and transposons can transfer gene from one location to another location. What are
differences between plasmids and transposons? (3 points)
答：质粒是通过接合作用来转移信息。
转座子是基因组中移动的一段不连续序列，可将其本身在基因组内从一个位置转移到另一个位置。转座子不依赖于供体和受体位点序列间的任何联系。质粒是独立形式的元件，在不同的基因组之间转移基因片段。
2. What are three different effects of transposons bring to target DNA? Explain “Selfish DNA”. (4 points)
