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分子生物学实验指导

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分子生物学实验指导

动植物检疫专业

2012，2

分子生物学实验注意事项

1． 课前要提早预习实验内容，熟悉实验设计的原理，理清实验顺序，制定实验方案（没有方案或者方案不合理者不能进入实验操作）。

2． 由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或者穿插进行，一定要做好统筹安排。

3． 实验课中的所有单项实验都属于一个整体流程。实验时间安排上没有上下午晚上等严格的作息安排，一切服从实验进度，务必在理论课上课期间完成。

4． 实验的每一步都要全面地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！

5． 对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（特别是微量移液器！）。在操作的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。

6． 写作实验报告或者实验论文一定要文理通顺、逻辑清晰、图表说明全面，讨论分析透彻。

7． 在实验室内不能大声喧哗。

8．在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或者先放在自己的桌面一角），严禁随地丢弃！特别注意对废弃细菌的杀灭与有毒垃圾的定点投放。

9．实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验实。

10．值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。

11．实验时损坏的任何物品都要及时申报。

实验一 质粒DNA的提取 1．目的

学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。

2．原理

根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.012.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，通过离心与蛋白质与大分子RNA一起沉淀下去。

3．器材

超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。

4．试剂

pMD18-T-F载体菌，LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液 I），NaOH/SDS溶液(溶液 II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液 III)，RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。

5．实验准备

氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20C储存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL dd water 搅拌完全溶解，用约200L 5N NaOH调pH至7.0，加dd water至1L，121C 20min灭菌）；溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L

Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）；溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）；溶液III（60mL

5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补dd water至100ml），70%乙醇（-20C储存），TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0）；10mg /mL RNase A（RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中）；摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121C 30min）。

6．操作步骤

（1） 在超净工作台中取5ml LB（Amp+），加入灭菌的摇菌管中。

（2） 从超低温冰箱中取出储存pMD-18T-F的菌种（操作完后迅速把菌种放回超低温冰柜中，切不可将菌融化！），在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于无菌LB培养液（含100ug/ml氨苄青霉素）中搅拌一下，37C摇床中摇20h。

（3） 取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，15000rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。 （4） 在沉淀中加入100l 溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（等待的同时，取一个塑料盒，装上适量的冰块备用。）

（5） 加入200l 溶液II，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。

（6）加入150l 溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。

（7） 15000rpm离心5min，小心吸取400l 上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！），加入800l 95% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。

（8） 15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，加入500l 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净

（9）再加入500l 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净

（10） 离心管倒置于37C培养箱中（或者室温）空气干燥。（管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎看不见！）。

（11） pMD18-T-F 加入30l 无菌蒸馏水或者TE缓冲液，用记号笔标记后放入冰箱中备用。

（12） 在剩余的菌液中倒入少许84消毒液，待溶液变清亮后随废液与剩余的冰块一起倒入下水池。清理桌面，清洗仪器，撰写实验报告

7．思考

（1） 影响本实验结果的因素有什么？

实验二、 质粒DNA的酶切

1．目的

学会用限制性内切酶切割质粒DNA。

2．原理

II型限制性内切酶能识别双链DNA内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或者齐平末端，通过电用酶切后的DNA混合物能够确认与分离酶切片段。

3．器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，水漂，恒温水浴。

4．试剂

pMD18-T-F质粒，EcoR I，BamH I，内切酶缓冲液（10×），10×电泳加样缓冲液

5．实验准备

配制TAE电泳缓冲液（50储存液），1000溴化乙锭储存液（0.5mg/ml），10加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）

6．操作步骤

（1）混合下列溶液于一个无菌的1.5ml微量离心管中：

pMD18-T-F DNA (或者pUCm-T-F ) 6 μL

10×酶切缓冲液（用EcoRI的缓冲液） 2 μL

dd water 30 μL

EcoRI 1μL

BamHI 1μL

总体积 40μL

（2）先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。从-20℃冰柜中取出限制性内切酶，立即插入冰块中。

（3）用一只手的手指捏在盛放酶的微量离心管的上部（以免手指的给酶液加温），另一只手持微量移液器，小心翼翼地吸取1 μL限制性内切酶。

（4）在酶切样品混合液中加入限制性内切酶后（立即把内切酶原液送回冰柜！），轻轻震动微量离心管使管中的溶液混匀。再在离心机中1000rpm离心10秒。取出后插到水漂的孔中，在推荐的最适酶切温度水浴中温育1-3 h（通常是 37℃）。

（5）酶切后取少量酶切产物与合适的已知分子量的DNA（如先前的PCR产物）对比电泳，以确认切下的片断是否为自己想要的片断。 （6）酶切后的质粒能够回收备用。

（7）清理桌面垃圾，清洗实验仪器。撰写实验报告。

7．思考

（1）酶切反应混合物的体积是否对酶切效果有影响？为什么？

（2）如何估计DNA用量与酶的用量？

（3）在吸取内切酶的时候如何操作才能别免浪费？

实验三、 质粒DNA的PCR扩增

1．目的

学会PCR操作的基本技术。

2．原理

是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后通过耐热的DNA聚合酶延伸。再进入下一轮变性—复性—延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增（1+X）n倍。其中<25nt的引物退火温度Tm=2（A+T）+4（G+C）。

3．器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微量管，双面微量离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴。

4．试剂

3U/μl Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液（10×，MgCl2 free），25mM MgCl2，dNTP，引物，模板质粒pMD18-T-F，无菌dd water。

5．实验准备

dNTP混合液（每种25mM），TAE电泳缓冲液，1000溴化乙锭储存液（0.5mg/ml），10加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。

合成的引物：

Sense primer 5'-GGATCCGCGCAATCTGTTCCTTATGGC-3'

Antisense primer 5'-GAATTCTTGTGCAGCTGCTTGTACGTTG-3'

目的基因模板质粒：已经克隆在pMD18-T-F载体上的781bp NDV-F基因。

待扩增的F片段长度：837bp。

6．操作步骤

（1） 在0.2ml PCR 微量离心管中配制50μl反应体系。

dd water 32μl

10×PCR buffer（不含MgCl2） 5μl

25mM MgCl2 3μl

2.5mmol/L dNTP 4μl（每种dNTP终浓度0.2mM）

10μmol/L Primer1 2μl（12.5—25pmoles）

10μmol/L primer2 2μl（12.5—25pmoles）

模板质粒 1μl（1×10-3pmoles）

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分子生物学实验指导_图文(精)

分子生物学实验指导_图文(精)

分 子 生 物 学 实 验 指 导

主编:于冰 马春泉 高传军 杨峰山 主审:李海英

黑龙江大学生命科学学院

2006 年 3月

目 录

绪论 分子生物学实验安全注意事项及分子生物学实验室所需 要的仪器设备 …………………………………………… 1 实验一 植物基因组 DNA 的分离 ……………………………… 6 实验二 RNA 的分离 …………………………………………… 11 实验三 DNA/RNA的琼脂糖凝胶检测………………………… 15 实验四 DNA/RNA浓度、纯度的测定及浓度的调整………… 21 实验五 聚合酶链式反应(PCR ……………………………… 24 实验六

随机扩增多态性 DNA 反应(RAPD ………………… 28实验七 甜菜 M14品系 AFLP

分析……………………………… 32 实验八 生物信息学……………………………………………… 49

前 言

黑龙江大学生命科学学院自成立以来,相继成立了生物工程专 业,生物技术专业,生物制药专业和食品科学与工程专业。分子生 物学是一门二十一世纪的前沿学科,而实验操作是分子生物学的一 个重要组成部分。我们结合了我院现有的仪器设备及材料情况,为 本科生设立了八个分子生物学实验项目(包括一个综合性实验项 目 ,以使学生掌握分子生物学领域中最基本的实验技能。本书编 写充分考虑了实验的系列操作性,比如从基因组 DNA 、总 RNA 的 提取到琼脂糖凝胶检测,从 DNA 浓度的调整到 PCR 技术,从分子 标记技术到生物信息学分析等,完全贯穿了分子生物学的基本实验 技术。对生命科学学院的本科生来说是一本很好的实验教材。

绪论 分子生物学实验安全注意事项及分子生物学

实验室所需要的仪器设备

一、安全事项

在实验室中安全是最重要的,分子生物学实验经常与毒性强,甚至致癌的试剂接触, 所以进入分子生物学实验室的人员,必须了解所有的安全措施,并将实验室的操作置于最 安全的条件下。下面提到的几点须特别注意:

分子生物学实验指导

分子生物学实验指导

分子生物学实验指导(总45页)

-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1

-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除 分子生物学实验指导

分子生物学实验课程的内容是从亚克隆一个基因直到最终表达出该基因产物的一个完整的科研项目。以表达纳豆激酶为例，从已经克隆在pMD-18-T载体上的纳豆激酶酶原基因上用PCR扩增出837bp的纳豆激酶成熟肽基因片段，与T载体连接后转入DH5菌中筛选鉴定，然后用双酶切下纳豆激酶成熟肽基因片段，插入带有6个组氨酸标签的原核表达载体pET-Trx，在表达菌BL(21)DE3中诱导表达出纳豆激酶蛋白质并用SDS-PAGE鉴定。

整套实验围绕纳豆激酶基因的亚克隆、重组、转化、筛选直到表达这一研究顺序进行操作。其间共涉及学习约11种基因操作的基本技术，我们按这些操作技术出现的先后顺序分别编为实验一至实验十一。各个实验之间具有很强的逻辑性和连贯性，前一个实验的结果就是下一个实验的原料。整套实验设计实际上是一个基因操作实验平台，随时能根据需要更改外源基因和表达载体或进一步扩充实验内容。我们在每年的教学实践中会不断增加目的基因和表达载体的种类，以便于学生实验小组能够从事不同的项目，减少雷同，增加兴趣。

分子生物学实验的宗旨是让学生在独立实践操作中学习分子生物学的基本研究方法和体会分子生物学研究的严密逻辑和科研理念。实验教学的组织方式是科研项目式管理，即在教师的总体指导下，在给定的实验材料和实验条件的基础上，让学生独立思考、自行规划实验流程、制定实验计划、准备实验材料、动手操作、整理和分析实验结果，最后完成实验项目，写出实验论文。 因此学生在实验前要认真预习实验内容，结合学过的分子生物学原理，弄懂每一步实验的目的和原理，了解实验的内容和总体实验方案，写出分子生物学大实验《开题报告》，交教师审阅和讨论修改后才能进入实验室操作。

在实验过程中，教师不干涉学生的实验安排和操作程序，仅以导师的身份对学生的实验操作进行现场巡回指导、回答学生的疑问、为学生示范一些高档实验仪器和软件的使用，提供公用的试剂（如酶）等，并对学生的每一步实验结果进行评价和把关。因局部实验失败而没有取得预期的结果，无法进入下一步实验的小组，先要与教师讨论分析失败的原因，然后向其他成功组的同学或教师索取实验材料继续进行。

分子生物学实验

分子生物学实验

引物的设计在PCR反应中极为重要，应遵循几条原则：①碱基组成，G﹢C含量应在40～60%②长度，18～25个核苷酸，上下游引物的长度差别不能大于3bp；③不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列的存在，这种序列可能成发夹结构④一个引物的3′末端都不能和其他任何引物互补，否则会形成引物二聚体⑤解链温度（Tm）：计算出两个引物的Tm值相差不能大于5℃，扩增产物的Tm值与引物的Tm值相差不能大于10℃，这些特性保证了扩增产物在每个PCR循环可有效地变性；⑥3′末端，每个因为的3′末端碱基应尽可能为G或C，但又不推荐使用3′末端有……NNCG或……NNGC序列的引物，因为末端GC碱基高的自由能可以村级发夹结构的形成，还可能产生二聚体；⑦向引物5′末端添加限制性酶切位点，噬菌体启动子等序列，因为位于DNA分子5′末端的限制性酶切位点的切割效率比较低，所以，引物应当超出限制性内切酶识别位点2－3个核苷酸，即至少包含有2－3个保护碱基；⑧从cDNA或基因文库中PCR扩增目的基因时，应注意引导位点的设置和简并PCR引物的设计。

【实验原理】：

在原核生物中，转化是一种普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处在一种感受状态有很大的关系。所谓感受态是指细胞处于容易吸收外源DNA的状态，它是由受体菌的遗传性所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子等影响。

制备感受态大肠杆菌的方法还有Hanahan方法（用于高效转化）和Inoue方法（用于制实验中通常使用氯化钙制备感受态大肠杆菌细胞。因为钙离子能够诱导大肠杆菌形成感受态细胞。对于钙离子诱导的完整细胞转化而言，菌龄、CaCl2处理时间、感受态细胞的保存期以及热脉冲时间都是很重要的因素，其中感受态细胞通常在12～24小时内转化率最高，之后转化率急剧下降。因此在制备感受态细胞时，将细胞培养至OD600为0.4～0.6后放入冰浴中使之停止生长，然后进行细胞处理。外界环境因子环腺苷酸（cAMP）及钙离子（Ca2+）能够提高受体细胞的感受态水平。另外，细胞的感受态一般出现在生长对数期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。

实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项

实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项

实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项

实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项

一、酶与载体的分装

酶类与载体：T载体(50 ng/μl)用灭菌水稀释4倍（12.5 ng/μl）后分装成10 μl或20 μl；

连接酶（solutionΙ）按5 μl分装；

dNTP（10 mM） 分装成50 μl；

无菌水分装成1 ml；

注意：（1）所有分装都必须用已灭菌的管。

（2）所有工具酶和载体的使用过程均在冰浴中进行。

（3）工具酶、载体以及试剂盒等实验室共用物品，用完后必须及时放回原处，以免耽误他人使用。

（4）当你发现你使用的是最后一管（盒）公用物品时，请马上告知负责人购买，以免耽误使用。

（5）感受态，氨苄青霉素和IPTG由研究生轮流负责制备。每人负责六个月。其他试剂则由第一位使用新包装的同学分装。由于分子实验工具酶比较容易失活，必须在冰上进行分装。

二、常见抗生素及IPTG的配置

以氨苄青霉素为例：

1．准备足够量的1.5 ml的EP管、两个100 ml的离心管、0.22 μm水系滤器、注射器、蒸馏水，以上用品均要进行高压灭菌。

2. 洁净工作台紫外灭菌，然后进行以下操作。

3．称取2 g的氨苄青霉素粉末于离心管中，加入灭菌水至总体积为20 ml，轻摇离心管，至氨苄青霉素粉末完全溶解，以免过滤时堵塞滤膜。

4．用注射器吸取配制好的溶液，然后把滤器安在注射器上，缓缓推动注射器活塞，把溶液经滤膜推至100 ml的离心管中。

注意：动作要缓和，使滤出液出口正对着离心管，还要防止染菌。

5．把100 ml离心管中已除菌的氨苄青霉素溶液分装到1.5 ml的EP管中，每管0.5 ml。在EP管上做好标记，包括名称、浓度、日期等。

6．把做好标记的盛有氨苄青霉素的EP管于-20℃保存。

注意：当你发现你使用的是最后一管抗生素时，请马上告知有关人员及时配制，以免耽误使用。