生物化学实验指导
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生物化学实验指导
目 录
1． 氨基酸的纸层析
1 2． 蛋白质的沉淀反应与盐析作用
3 3． 凝胶过滤法使蛋白质脱盐 5
4． Folin酚法测定蛋白质含量 7
5． 紫外分光光度法测定蛋白质含量 9
6． 酵母RNA的提取及其组分的鉴定 11
7． 酶的基本性质实验 13
8． 脲酶Km值的测定 16
9． 鱼细胞ATP酶活性的测定 10． 还原糖和总糖含量的测定(3,5―二硝基水杨酸法) 20 11． 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质 12． SDS―PAGE法测定蛋白质的分子量
13． 油料种子油脂含量的快速测定 27
14． 血清胆固醇的测定（磷硫铁法） 29
15． 粘多糖肝素纳效价的测定 31
16． 维生素C含量的测定(2,6－二氯酚靛酚滴定法) 33
17． E.coli感受态细胞的制备及转化 35
18． 质粒DNA的提取,酶切和电泳鉴定 36
19． 紫外分光光度法测定核酸含量 39
20． DNA片段的PCR扩增 41
21． 发酵过程中无机磷的利用 42
附录1 生化实验室学生实验守则
44 附录2 生化实验室操作安全注意事项
45 附录3 实验室意外事故的紧急处理措施
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18 22 25 实验一、 氨基酸的纸层析
一、实验目的和要求
通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、实验原理
纸层析法(paper chromatography)是最简单的液―液相分配层折，它以滤纸作惰性支持物，其原理主要是分配作用，辅以吸附和离子交换作用,即主要是利用物质在两种不相混合溶剂中的分配系数不同,而达到分离目的。通常用?表示分配系数.在一定条件下,某种物质在特定溶剂系统中的分配系数是一个常数.
?=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度
滤纸纤维上的羟基具有亲水性，当支持物被水饱和时,通过氢键被纤维素分子表面的羟基吸附的水分子扩散性大大降低,不具流动性,故滤纸及被吸附的水可作为层析的固定相，而与固定相不相混溶的有机相则为层析的流动相。如果有多种物质存在于固定相和流动相之间，将随着流动相的移动进行连续和动态的不断分配。由于各物质分配系数的差异，移动速度就不一样，按照相似相溶的规律，分配系数大的溶质在固定相中分配的数量多,在纸上移动速度慢，反之则快。最后不同的组分可以彼此分开。
物质分离后在图谱上的位置可用比移值Rf表示：
Rf=
展层后斑点中心与原点之间的距离
溶剂前沿与原点之间的距离特定化合物在特定的展层系统和特定的温度下，Rf是个常数，Rf值与分配系数α有如下关系；
A α = rAs?1???1? ?R??f?式中Ar和As分别表示流动相和固定相体积，Rf取决于被分离物质在两相间的分配系数
和两相间的体积比。由于两相体积比在同一实验条件下是一常数，所以Rf主要取决于分配系数。不同的物质分配系数不同，也就有不同的Rf值 。物质的分配系数受下列因素的影响:
1. 物质极性的大小. 水的极性很强,根据相似相溶规律,一般极性强的物质就容易进入水相,而非极性的物质易于进入有机溶剂中.故碱性氨基酸因-OH和-NH2基团较多而易分配在水相中,具有较小的Rf值.而非极性氨基酸则因含-CH较多而不易分配在水相中,故具有较大的Rf值.
2. 滤纸的质地以及被水分饱和的程度. 滤纸的质地应均一,纯净和厚薄适当,具有一定的机械强度,层析前应用所选溶剂系统的蒸汽饱和.
3. 溶剂的纯度,pH值和含水量. pH值和含水量的改变将改变氨基酸和溶剂系统的的极性,导致Rf值出现相应改变.
4. 层析的温度和时间. 温度改变将导致溶剂系统中有机相的含水量改变,从而引起Rf
值改变.当其它条件相同时,层析时间短,则Rf值小.
因此,在层析过程中必须严格控制上述影响Rf值的因素. 展层的方式根据溶剂在纸上扩展的方向可分为上行法、下行法和环形法。上行法是让溶剂自下而上渗透的展层方式，最常用。下行法是让溶剂由纸的上端向下渗透的展层方式，其渗透速度快，展开距离可很长，有利于分离Rf值相差较小的组分。环形法则稍复杂，它
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是在圆形滤纸上进行层析，从边缘至圆心剪下一条宽2―3mm的纸条，裁成合适长度使其浸入盛有溶剂的培养皿中，样品可点于圆心，溶剂从圆心向四周扩散，物质则在一定距离的半径上形成同心圆。同时展层的方式又有单向和双向之分。
展层形成的图谱对无色物质来说有以下几种显色方法：①化学法，常用喷雾方式将合适的显色剂均匀喷于纸上，使之与待分析组分起反应形成有色或荧光物质，如本实验的茚三酮显色法；②物理法．利用某些物质能吸收紫外线的性质，将其置于紫外灯下观察或产生暗斑，或产生荧光；③微生物法，利用有些化合物对某种微生物的生长抑制作用来鉴定其存在与否；④同位素及放射自显影方法。
三、试剂
1. 谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、γ―氨基丁酸和丙氨酸混合液，将各氨基酸分别配成
－
8×103 mol/L mol/L的浓度，然后混合之。
2. 8×10-3mol/L谷氨酸和8×10-3mol／L天冬氨酸混合液。 3. 0.5％的茚三酮丙酮溶液。
4. 正丁醇、95％乙醇、88％甲酸、12％氨水。
四、操作方法
1．点样：选用新华1号滤纸．剪成18×18cm的正方形，在距相邻两边各2.0cm处用铅笔轻轻划两条线，在线的交叉点处点样。已知氨基酸混合液用量以30一40μl为宜，斑点扩散直径不大于0.5cm，点样时操作应小心，不能把滤纸弄破。点样中若点一次后须点第二次，可用电吹风冷风吹干。
2．展层：将点好样的滤纸两侧边缘对齐，用线缝好，卷成筒形。注意缝线处的滤纸两边不能接触，以免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动太快而造成溶剂前沿不齐。将圆筒状滤纸放入已预先加入了展层溶剂系统(正丁醇?12％氨水?95％乙醇＝13?3?3)并已经平衡好了的层析缸中，注意滤纸勿与皿壁接触，盖好盖子进行展层。当溶剂展层至纸上沿约1cm时取出滤纸，作好前沿位置标记后晾干，将纸转90○，再次缝好后用第二相展层剂(正丁醇:80％甲酸:水＝15:3:2体积比.已在缸内平衡好了)展层。
展层剂易挥发，需新鲜配制，注意摇匀，每相用量18―20m1。
3．鉴定：将层析好的滤纸用吹风机吹干后再用0.5％茚三酮丙酮溶液在纸上均匀喷雾，待自然晾干后置65℃烘箱内烘30分钟，取出后用铅笔轻轻描出各显色斑点的形状。用直尺量出各斑点中心与原点的距离以及溶剂前沿与原点的距离，求出各氨基酸的Rf值。将各显色斑点的Rf值与标准氨基酸的Rf值比较，可得知该斑点的准确成分。
整个实验操作应带手套进行, 以免污染滤纸。
五、注意事项
1．选用合适、洁净的层析滤纸。滤纸应质地均匀厚薄一致，具一定的机械程度和一定的纯净度，若分离样品可用厚滤纸，What man No.1滤纸与国产新华一号滤纸相似。不洁净的滤纸可浸于0.4mol/L HCl中20小时，蒸馏水洗至中性，再依次用95％乙醇、无水乙醇和无水乙醚各浸洗一次，吹风机吹去乙醚，40℃烘干，但处理后的滤纸脆性增加。
2．茚三酮的重结晶。5g茚三酮溶于15ml热水，加入0.25g活性炭轻轻搅动，加热30分钟后趁热过滤(用热滤漏斗，茚三酮遇冷结晶)，滤液置冰箱中过夜，次日黄白色结晶出现，再过滤，用1ml冷水洗涤结晶，置干燥器中干燥后置棕色瓶内保存。
3．进行双相层析时，经第Ⅰ相展层后，上端未经溶剂走过的滤纸与已被溶剂走过的滤纸形成一分界线，在第Ⅱ相展层时在分界线上影响斑点形状，因此在进行Ⅱ相展层前，先将
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第Ⅰ相上端的2cm边剪去，注意记下第I相时的原点与溶剂前沿的距离。
4．纸层析的定量可用洗脱比色法。层析滤纸显色后按照同样大小的面积将各显色斑点剪下，在同一张滤纸上剪一块大小相仿的空白纸作比色对照用。各纸斑剪成细条梳状后装入干燥试管内，加5ml 0.1％CuSO4・5H2O : 75％乙醇＝2 :38 (V／V)的溶液洗脱。间歇振荡，洗脱液呈粉红色，10分钟后在520nm波长处进行比色测定，所得比色读数在标准曲线上查出其含量。
5．标准曲线的绘制：配制已知浓度的Glu和Asp混合液，用单相层析法，在滤纸底边2.5cm处分别点5，10，15和20μl氨基酸混合液，每点间隔2.5cm，留一空白点位置作对照。用正丁醇: 80％甲酸:水＝15:3:2(v／v／V)溶剂系统展层。同本实验中的步骤显色、洗脱和比色，以氨基酸含量为横坐标，光吸收值为纵坐标作图。结果应为一直线，不同氨基酸其斜率不同。
