HIV-1慢病毒载体的发展及其生物安全性

慢病毒包装．慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，它需要相对较长的孵育时间，所以称之为“慢”病毒，Lenti在拉丁文中就是慢的意思。

它包括人免疫缺陷病毒（HIV）、猫免疫缺陷病毒（FIV）、猿免疫缺陷病毒（SIV）、牛免疫缺陷病毒等。

其中研究最多的是HIV-1慢病毒。

慢病毒载体（Lentivirus vector）是以慢病毒基因组为基础，由所需的目的基因取代部分基因构建而成。

目前使用的慢病毒载体多采用HIV-1基因组改造而来。

与一般的逆转录病毒载体相比，慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力而具有更广的宿主范围。

慢病毒载体还可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而实现持久表达。

在感染能力方面可以有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，又很少引发机体免疫反应，能达到良好的基因治疗效果，具有广阔的应用前景。

随着人们对慢病毒载体的深入研究，为了提高慢病毒在临床上使用的安全性，慢病毒载体的优化也在不断的探讨中。

慢病毒载体的发展经历了三个阶段，第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表，在构建时把HIV-1基因组中进行包装、逆转录和整合所需的顺式作用原件与编码反式作用蛋白的序列分离，分别构建在三个质粒表达系统上，即包装质粒、包膜质粒和载体质粒。

包装质粒在巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）启动子的作用下，控制除env以外所有病毒结构基因的表达；包膜质粒编码水泡口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）G 糖蛋白；载体质粒中含有目的基因。

用这三种质粒共转染包装细胞如人胚胎肾293T细胞，在细胞上清中即可收获只有一次感染能力、而无复制能力的慢病毒颗粒。

第一代慢病毒载体系统的特点是在构建三种包装质粒时，为了降低产生有复制能力的病毒的可能性，尽可能减少三种质粒之间的同源序列，但包装质粒中仍然保留HIV的附属基因。

什么是慢病毒载体？
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类**缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因**载体。

特点：
1．区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，常用于感染难转染的细胞，如原代细胞、神经元细胞、干细胞、不分化细胞、心肌细胞、肝细胞、内皮细胞、肿瘤细胞，且效率近
2．可装载DNA片段容量高达8kb
3．目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，形成稳定遗传物质，使得目的基因在细胞中可稳定长期表达。

4．病毒载体颗粒通过包装元件和含病毒基因组质粒共转染包装细胞系。

利用逆转录机制构建自我失活(SIV)的HIV-1来源的载体,一旦转移到靶细胞后,它就丧失了病毒长末端重复的转录能力,减少了产生重组病毒的机会,并避免了与启动子干扰的问题。

综上特点决定了其应用、意义：
1．用慢病毒载体携带目的基因比用质粒瞬时转染更适于稳转株构建。

2．载体带有可进行高效率的包装、转染并稳定整合进靶细胞的基因组中的序列元件，其产生滴度更高，为活体动物模型实验提供高性价比的包含目的基因的病毒液。

3．其高转导效率及整合到基因组的特点为RNAi,cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。

HIF-1α基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定【摘要】目的构建HIF-1α基因RNA干扰慢病毒载体。

方法选定HIF-1α基因RNAi靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经XhoⅠ和HpaⅠ双酶切后的慢病毒载体pLentilox3.7(pLL3.7)连接,产生pLL3.7 HIF-1α慢病毒载体,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽取质粒后,用限制性内切酶XbaⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定,将阳性克隆送金斯特公司进行测序鉴定;用PHR、pVSVG和pLL3.7慢病毒载体共转染包装细胞293T细胞(磷酸钙转染法),包装产生慢病毒, 将收集的病毒上清经高速离心浓缩后,按一定比例稀释,然后感染293T细胞,用流式细胞仪检测293T细胞GFP蛋白的表达水平,从而测定病毒滴度。

结果酶切和测序证实,构建出HIF-1αshRNA的慢病毒载体pLL3.7 HIF-1α;包装慢病毒,测得离心的浓缩病毒悬液的滴度为2×108 TU/ml。

结论成功构建HIF-1α基因RNAi慢病毒载体。

【Abstract】Objective To construct a lentiviral vector of RNA interfered(RNAi)HIF-1αgene. Methods To confirm the targeting sequence of HIF-1α gene that can be effectively silenced by RNA inference. The cDNA containing both sense and antisense Oligo DNA fragments of the targeting sequence was designed, and cloned into the pLentilox3.7(pLL3.7) vector which was digested by XhoI and HpaI. The obtained lentiviral基金项目:厦门市卫生局资助项目(项目编号:3502Z20077055);厦门市科技局资助项目(项目编号:3502Z20089001)vector containing HIF-1α shRNA was confirmed by digestion and sequencing. Using lentiviral vector PHR、pVSVG and pLL3.7 HIF-1α to cotransfect 293T cells, then the collected lentivirus. The titer of virus was tested according to the expression level of GFP. Results Digestion and DNA sequencing demonstrated that the constructed lentivirus vector pLL3.7 HIF-1α which can produce HIF-1α shRNA. The titer of concentrated virus was 2×108 TU/ml. Conclusion The lentivirus RNAi vector targeting HIF-1α is constructed successfully.【Key words】HIF-1α;RNAi;Lentivirus缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是目前所发现的正常细胞以及肿瘤细胞适应缺氧的最关键的转录因子[1],其基因的功能研究具有非常重要的意义。

2 生物安全2.1 安全性◆删除了全部HIV-1的编码基因，在介导目的基因的表达时，没有任何HIV-1蛋白的表达；◆对5’和3’ LTR分别进行了删除改造，5’LTR缺失U3，换上RSV enhancer/promoter，使载体的复制不再依赖Tat；3’LTR 删除U3，使其不再具有启动/增强活性，成为自灭活（self inactivating, SIN）载体；◆病毒包装必需的3个蛋白Gag/Pol、Rev、VSV-G（代替HIV-1 的Env）分别独立放置在3个质粒上（pGag/Pol、pRev、pVSV-G），且互相之间没有任何同源序列，大大降低了复制型慢病毒（RCL）的产生几率；◆与MuLV等逆转录病毒载体相比，慢病毒载体的整合更偏向于宿主细胞基因组的基因表达活跃区，激活沉默的原癌基因的几率可能比逆转录病毒载体低；◆慢病毒载体未发现有致肿瘤活性，全世界有4千万人感染了HIV-1，发生的整合事件不计其数，但未出现一起致瘤事件，而MuLV等逆转录病毒载体有致瘤活性；◆慢病毒的LTR的转录激活能力低于逆转录病毒，激活原癌基因能力也较低。

2.2 实验室安全措施慢病毒载体已经被全世界许多实验室应用，没有出现过任何意外，但仍具有潜在的产生复制型慢病毒（RCL）和致癌的风险，操作者在实验中仍需要保持高度警惕！所有操作均应尽量在BSL2级生物安全柜中进行，并佩戴一次性口罩和手套，尤其要避免病毒接触口、眼、鼻、耳、伤口等身体开放性区域，避免产生气溶胶，tip 头一定要选择带有滤芯的。

必须高度注意被污染的尖锐物品，包括针头、注射器、载玻片、移液管、毛细玻璃吸管和解剖刀。

每次实验后，立即清理所有接触过病毒的器具，均应高压消毒再进行下一步处理。

显微镜台、生物安全柜台面等使用后，用70% 乙醇擦拭。

意外洒落的含病毒的液体，用卫生纸吸干后，用0.6% 次氯酸钠溶液浸泡被污染处1h。

装盛慢病毒载体的实验用品，要单独放置，标示清楚，并标注“危险品”字样。

慢病毒载体的构建及其应用于转基因动物的研究进展孙克宁;朱化彬;林峰;王栋;郝海生;杜卫华;赵学明【摘要】为提高慢病毒载体构建水平,提高转基因整体效率,作者综述了慢病毒载体结构及围绕改善生物安全性、提高目标基因装载量、扩大宿主范围而进行的慢病毒载体改造研究发展历程,指出新型慢病毒载体去除了病毒所有辅助基因,引入了外源调控序列,替换了包膜蛋白,大大提高了慢病毒载体的安全性、基因转移效率和表达效率,使宿主细胞类型更广范,而下游表达载体转染方法的研究又为转基因方法的集成与优化奠定了基础.慢病毒载体制备与多种转基因技术的优化集成,将有助于发展简便、高效、经济的转基因新技术,提高转基因技术的整体水平.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(037)008【总页数】5页(P116-120)【关键词】转基因;慢病毒载体;载体构建策略【作者】孙克宁;朱化彬;林峰;王栋;郝海生;杜卫华;赵学明【作者单位】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;河南农业大学牧医工程学院,郑州,450002;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;河南农业大学牧医工程学院,郑州,450002;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193【正文语种】中文【中图分类】S813.3转基因技术使人类根据主观意愿定向改变生物体的性状表型成为可能,而载体种类和质量直接关系到后续转基因的效率,所以表达载体构建成为转基因研究的关键环节之一。

相比较而言,质粒载体、噬菌体DNA载体和人工染色体载体需要借助于昂贵的显微操作仪,并因极低的整合率影响了转基因的效率。

转座子载体虽有较好的应用前景并大量应用于低等动物转基因,但由于受构建哺乳动物高效转座子技术瓶颈的限制,近期内很难在高等动物中取得进展。

慢病毒载体的研究进展及应用张蕊;龚道清【摘要】慢病毒载体是近年来受到广泛关注的一种逆转录病毒载体,具有更安全、转移效率高、可将目的基因整合入宿主基因组和可感染非分裂期细胞等优点,因此有望成为理想的基因转移载体,并在临床和生产实践中广泛应用.作者主要以HIV-1为代表对慢病毒载体的构建及其在基因治疗和转基因动物生产中的应用作一综述.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(037)006【总页数】5页(P227-231)【关键词】慢病毒;慢病毒载体;基因治疗;转基因动物【作者】张蕊;龚道清【作者单位】扬州大学动物科学与技术学院,扬州,225009;扬州大学动物科学与技术学院,扬州,225009【正文语种】中文【中图分类】S852.65慢病毒(Lentivirus)属于逆转录病毒科(Retroviridae),为RNA病毒,由于这类病毒的一个重要特点是病毒粒子中含有依赖RNA的多聚酶即逆转录酶,故现名为逆转录病毒。

慢病毒已经从绵羊(绵羊脱髓鞘性脑白质炎/慢性进行性肺炎病毒)、山羊(羊关节炎脑炎病毒)、牛(牛免疫缺损病毒)、马(马传染性贫血病病毒)、猫(猫免疫缺损病毒)、猴(猴免疫缺陷病毒)和人(人免疫缺陷病毒)中分离得到(Robl等,2007)。

慢病毒在宿主细胞内,能以病毒RNA为模板在自身反转录酶的作用下合成cDNA,再以此cDNA为模板合成双链DNA,经环化后通过病毒整合酶作用整合在宿主细胞的染色体上并长期表达(李跃萍等,2006)。

慢病毒以其基因组为基础去除部分基因代之以所需的目的基因和标记物,构建而成的慢病毒载体(Lentiviral vector)具有转移效率高、可整合入宿主细胞基因组、包装后更安全并可转染非分裂期细胞等优点,在基因治疗和转基因动物生产中得以广泛的使用。

1 慢病毒载体1.1 慢病毒的基本结构慢病毒载体种类很多,其中对HIV-1的结构和生物学特征的研究较多,而HIV-1型已成为目前较为常用的慢病毒载体系统。

慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用摘要：慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。

经改造的慢病毒作为外源基因载体，具有其独特的特点和优势。

基因治疗成功的关键是选择合适的载体系统，慢病毒载体作为一种特殊的逆转录病毒载体，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗载体研究的热点。

近年来对其基础生物学特性、载体改造及其应用等研究均取得了较大进展，笔者对慢病毒载体的构建以及其在人类疾病基因治疗方面的应用做简单的介绍。

关键词：慢病毒载体；载体构建；基因治疗基因治疗是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。

其关键问题之一是如何将目的基因导入靶细胞，得到稳定、高效表达。

理想的基因载体应具备：靶向特异性；高度稳定、易制备、可浓缩和纯化；无毒性；有利于基因高效转移和长期表达；容量大，易人工合成，缺乏自动复制载体自身的能力［１］。

由于病毒基因组结构简单、分子背景比较清楚、易于改造和操作、感染效率高、有较高靶细胞特异性，这些都是其他载体系统无法比拟的，而慢病毒载体由于其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力且转染效率高、靶向性好和持久性表达等特点，病毒载体系统就显得格外引人注目。

1 慢病毒及其载体的简介慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。

慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag、pol和env3个基本结构基因外，还包含4个辅助基因vif、vpr、nef、vpu 和2个调节基因tat和rev［２］。

慢病毒载体（Lentiviral vector，LV）作为外源基因载体，其产生均包括一个遗传割裂基因表达的设计。

病毒元件要符合以下条件：①慢病毒组装辅助蛋白至少含有gag-pol基因；②慢病毒转基因载体RNA 包括转基因表达盒；③异质糖蛋白。

目前使用不同种属来源的慢病毒载体，包括来源于人类（HIV-1和HIV-2）以及猿猴（SIV）、猫（FIV）等其它物种［３］。