大麦秸秆抑藻物质的分离及其抑藻作用研究_邓继选
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用 N2 吹干甲醇抽提液 , 加入 0.5 mL 的 N , O-双(三甲基硅 基)三氟乙酰胺(BSTFA)反 应 30 min 后待 测 。 色谱检 测条件 : 炉温 50 ℃保持 2 min, 程序 升温速率 6 ℃/ min, 270 ℃保持 10 min ;传输线 温度 250 ℃;PTV 进样口初始温度 44 ℃, 程序升温 速率 14.5 ℃/ min , 到 280 ℃保持 1 min。 载 气为氦气 , 载 气速 率为 1.0 mL/ s。 色谱柱 DB-5 内径 0.25 mm, 高度 30 m, 涂层厚 度 0.25 μm。 质谱检测条件 :电子能量 70 eV , 离子源温
of different organic solvents
2 结果与讨论
2.1 不同溶剂的大麦提取液对铜绿微囊藻的抑制作用 分别取 有机溶剂(石油醚 、三氯 甲烷 、乙酸乙 酯 、正丁醇)
提取液 500 μL , 加入 100 mL 铜绿微 囊藻液中 培养 , 通过 测定 藻密度的变化 , 得 到铜 绿微囊 藻生 长抑 制率 曲线 , 见图 2。 4 种提取液对 铜绿微囊藻 均有 抑制作 用 , 第 1 d 的 抑制率 为石 油醚提取液 23.39%、三氯甲 烷提取 液 1.49%、乙 酸乙酯 提取 液 4.98%、正丁醇提取液 19.82%;从 第 2 d 开始 , 石 油醚 、乙 酸乙酯提取 液的抑制效果 随着时间 的延续 而增强 , 说 明铜绿 微囊藻的生长受到强烈抑制 ;随着时间的延长 , 各溶剂提取液 的抑制效果出现了差异 , 从第 4 d 开 始 , 三氯甲 烷和正丁醇的 提取液不再 抑制 。石 油醚的 提取液 表现了 较强的 抑制效 果 , 至第 6 d 抑 制 率 已 达 74.6%, 乙 酸 乙 酯 抑 制 率 也 达 到 了 59.2%。 对铜绿微囊藻 的抑制 作用 从高 到低依 次为 石油 醚 、 乙酸乙酯 、正丁醇 、三 氯甲烷 的提取 液 , 说 明大麦 秸秆对 藻有 抑制作用的 化感物质可能 主要存在 于石油 醚 、乙酸乙 酯的提 取物中 。 2.2 秸秆有机溶剂粗提物化感物质的检测 2.2.1 石油醚粗提物的 GC-MS 鉴定结果与分析
度 200 ℃, 采用 全扫描方式 , 扫 描范 围为 20～ 50 amu, 溶 剂延 迟 4.80 min 。 检测结果用 NIST2.0/ EPA/ NIH 质 谱标准 谱库进
行检索 , 根据正 反检 索值 的高 低及 相似 性 , 确定 化合 物 的结
构 , 用面积归一化法计算化合物的相对含量 。
本文用石油醚 、三氯甲 烷 、乙 酸乙酯 、正丁 醇等 提取麦 秆 浸泡液中的抑 藻物质 , 采 用气 质联用(GC-MS)法 对提 取液 进 行分析 , 并进一步对可能的抑藻物质进行试验验证 。
1 材料与方法
1.1 试验材料 大麦秸秆取自无锡市梅村 。 将收割后 的大麦秸秆除根剪
成 2 cm 的 小段 , 在 蒸馏水 中浸 泡 15 d(50 g/ L), 然后 用 0.45 μm 的微孔滤膜过 滤 , 灭菌 , 4 ℃冰 箱保 存备 用 。 铜绿 微囊 藻 (Microcystis aeruginosa)购自中科院武汉水生 生物研究 所 , 编号 为 FACHB-912 。 1.2 大麦秆浸提液抑藻活性成分的提取
光暗时间比 12 h∶12 h 的 GPJ 光照 培养箱 中培 养 。 藻细 胞膜 透性参照谢田等[ 11] 的紫外 吸收 法测定 藻细 胞中 非电解 质的
渗出率 , 以 OD264/ (g·h)(FW)表示 。 1.5 数据处理方法
根据藻细胞数目计算秸秆化感物质对铜绿微囊藻的相对
抑制率[ 11] , 计算公式为
石油醚提物液的 GC-MS 分析 结果见 图 3 和表 1。 从 表 1 可以看出 , 石油醚提取的有机成分比较多 , 含量较大的成分有 N , N-亚甲基-10-十一 碳烯 酰胺 、邻 苯 二甲 酸二 丁酯 和 1, 3-苯 二甲酸-二乙酯 , 相对含量占 27.67%, 可能 为主要的 抑藻活性 物质 ;此外 , 还含有少量的醇 、脂肪酸衍生物等 。 2.2.2 乙酸乙酯粗提物的 GC-MS 鉴定结果与分析
1.4 试验方法 取一定量处于对数期的藻液 , 加入一定量的抑制物 , 对照
组加入等量溶剂 , 用 BG11 培 养基培 养液(121 ℃灭菌 30 min) 定容 100 mL(1 ×105 mL-1)。 每份设 3 个平行样 。 将上述样品
置于 25 ℃、 相对 湿度 75 %、 光照强 度 40 ～ 80 μmol/ (m2·s)、
图 3 石油醚粗提物的 GC-MS 总离子流谱图 Fig .3 TIC chromatograph of petroleum ether extracts by
GC-MS analysis
表 1 石油醚粗提物的化学成分的 GC-MS 分析结果 Table 1 Identified components of petroleum ether extract
(Alexandrium tamarense)的 生长 具 有明 显 的抑 制作 用 。 Murray 等[ 8] 研究表明 , 大麦秸秆降解过程中产生的邻苯基苯酚 、对甲 苯酚等酚酸类化合物可以有效抑 制铜绿微囊藻 。 孔垂华等[ 9] 研究了秸秆中非酚酸类物质的化 感作用 , 其中羟基肟酸 、环己 烯酮 、黄酮具有一定的抑制活性 。 目前 , 研 究者对秸秆抑藻物 质的产生及抑藻机理 尚无一 致看法 , 有必 要对此 进行深 入研 究。
取一定量大麦秸秆 浸泡过 滤液 , 按照溶 剂的极 性递减 依 次用等量的石油醚 、三氯 甲烷 、乙酸乙 酯 、正 丁醇与 分液漏 斗 进行萃取[ 10] , 重复 3 次 。 有机相 经 CaCl2 脱水 、 过滤 , 于 旋转 蒸发仪(上海亚荣生化 仪器厂 , RE-52)上 在 39 ℃条 件下进 行 浓缩 , 并用甲醇溶液复溶至 2 mL 。 大麦 秸秆叶中 抑藻成 分的 提取分离流程见图 1 。 1.3 化感物质的 GC-MS 鉴定
0 引 言
随着工业化 、城市化 的发展 及化肥的 大量 使用 , 氮 、磷等 营养物质大量进入水体 , 湖泊等富营养化日益严重 , 导致有害 藻华频发 。 从高等植 物中提 取的化 感物质 作用于 水华藻 类 , 不但可以抑制藻类的生长 , 治理富营养化 , 而且不易造成二次 污染 , 对于维持生态 系统平衡 有较高 的安全 性[ 1] 。 秸秆 抑藻 作为一种行之有效的方法 , 具有经济 、高效 、安全的特点 , 得到 了广泛认同 。但秸秆 抑藻机 理尚不 明确 , 目前最 被认可 的是 化学机理 , 即大麦秆在浸泡 、降解过程中产生酚类 、酯类 、蒽醌 类等 化 感 物 质 , 它 们 能 够 很 好 地 抑 制 藻 类 生 长[ 2] 。 Gibson 等[ 3] 通过研究大麦秆对小球 藻(Chlorella vulgaris)等的 抑制试 验发现 , 大 麦秆 浸 出 液 中 的 某 些 化 合 物 抑 制 了 藻 类 生 长 。 Pillnger 等[ 4] 提出 , 大麦 秆 的 抑藻 作 用 主 要是 酚 类 物 质产 生 的 , 很可能是丹宁酸的作用 。 Evearll 等[ 5-6] 用大麦秆 浸出液处 理弱细颤(Oscillatoria tenuis)和 浮 游绿 藻 , 藻类 生长 被显 著抑 制 , 其中 2, 6-二甲 氧 基-4-酚 抑 藻 作用 最 强 。 杨 维 东 等[ 7] 指 出 , 酚酸类物质香草醛 、儿茶素和没食子酸对塔玛亚历山大藻
＊ 收稿日期 :2012-11-09 作者简介 :邓继选 , 硕士研究生 , 从事水污染控制研究 ;邹华(通信 作者), 副教授 , 博士 , 从事环境生物技术与 水体富营养 化治理技术研究 , zouhua @jiangnan .edu .cn 。 基金项目 :十二 五水 体污 染与治 理科 技 重大 专项(2012ZX07503002);江苏省自然科学基金项目(BK 2011161)
mol/ L的磷酸缓冲液(pH =7.2)清洗 2 次 , 每次 10 min。 移入小
离心管中 , 用 4%戊二 醛及 %锇 酸溶液 双重 固定 , 经各 级乙
醇(10%、30 %、50%、70%、90 %)脱水 , 干燥 、喷镀金属处 理 , 切
片后在 Quanta-200 扫描电镜下观察 。
IR=(1-N/ N 0)×100 %
(1)
式中 IR 为相对 抑制 率 ;N 为 加入 浸出液 试验 组的 藻密 度 , mL -1 ;N 0 为对照组藻密度 , mL-1 。
1.6 藻细胞超微结构的观察 取一定 量 藻 液 , 4 000 r/ min 离 心 15 min, 沉 淀 物 用 0.1
乙酸乙酯粗提物的 GC-MS 分析结果 见图 4 和表 2 。 从表 2 可以看出 , 含量最大 的物质为 十六烷 基三 甲基溴 化铵 和 1, 3-二苯二甲酸-二 乙酯 , 可能为主要的抑藻活性物质 ;另外 ,
图 2 不同有机溶剂粗提物的铜绿微囊藻抑制率曲线 Fig .2 Inhibition curves of Microcystis aeruginosa by crude extract
图 1 大麦秸秆叶中抑藻成分的提取分离流程 Fig.1 Isolation process of antialgal chemicals in barley straw
39
Vol.13 No .6 安 全 与 环 境 学 报 第 13 卷第 6 期
邓继选1 , 邹 华1 , 庄 严2
(1 江南大学环境与土木工程学院 , 江苏无锡 214122; 2 无锡市环境监测中心站 , 江苏无锡 214025)
摘 要 :大麦秸秆具有较好的 抑藻效能 。 为 了揭示化 感物质抑 制藻 类的机理 , 用极性由小到大的 4 种有机溶剂 ——— 石油醚 、乙酸乙酯 、三 氯甲烷 、正丁醇对大麦秸秆水浸液依次进 行提取 , 分 离获得其 中的抑 藻物质 , 研究抑藻物质对铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)的抑制率 , 及藻细胞的膜透性和亚显微结构的变化 。 结果表明 , 大麦秸秆粗提物 对铜绿微囊藻生长的抑制强度从高到低 依次为石 油醚 、乙酸 乙酯 、正 丁醇 、三氯甲烷的提取物 , 其中石油醚 、乙酸乙酯的提取物具有更好的 抑制作用 。 通过 GC-MS(气相-质 谱联用)分析各 种化感 物质含 量 , 共 检测出 20 多种化学物质 , 其中胺类和酯类含量较大 , 可能为大麦秸秆 中主要的化感物质 。 十六烷基三甲基溴化铵(HTA B)和邻 苯二甲酸二 丁酯(DBP)对铜绿 微藻 具有 较好 的抑 制效 果 , 抑制 第 6 d 的半 效应 EC50分别达到 1.3 mg/L 和 2.1 mg/ mL 。 扫描电镜和藻细胞膜透性研究 表明 , 两种抑藻物质使铜绿微囊藻细胞的 膜结构遭 到破坏 , 细 胞膜透 性增加 , 细胞内溶物流出 , 使藻细胞蛋白等含量减少 , 并导致细胞内缺 少 合成生理 成分的物 质 , 这可能 是秸秆对 铜绿微囊 藻抑制的 机理之 一。 关键词 :环境工程学 ;大麦秸秆 ;化感物质 ;铜绿微囊藻 ;抑制作用 中图分类号 :X524 文献标识码 :A DOI :10.3969/ j .issn .1009-6094.2013.06.009
of different organic solvents
2 结果与讨论
2.1 不同溶剂的大麦提取液对铜绿微囊藻的抑制作用 分别取 有机溶剂(石油醚 、三氯 甲烷 、乙酸乙 酯 、正丁醇)
提取液 500 μL , 加入 100 mL 铜绿微 囊藻液中 培养 , 通过 测定 藻密度的变化 , 得 到铜 绿微囊 藻生 长抑 制率 曲线 , 见图 2。 4 种提取液对 铜绿微囊藻 均有 抑制作 用 , 第 1 d 的 抑制率 为石 油醚提取液 23.39%、三氯甲 烷提取 液 1.49%、乙 酸乙酯 提取 液 4.98%、正丁醇提取液 19.82%;从 第 2 d 开始 , 石 油醚 、乙 酸乙酯提取 液的抑制效果 随着时间 的延续 而增强 , 说 明铜绿 微囊藻的生长受到强烈抑制 ;随着时间的延长 , 各溶剂提取液 的抑制效果出现了差异 , 从第 4 d 开 始 , 三氯甲 烷和正丁醇的 提取液不再 抑制 。石 油醚的 提取液 表现了 较强的 抑制效 果 , 至第 6 d 抑 制 率 已 达 74.6%, 乙 酸 乙 酯 抑 制 率 也 达 到 了 59.2%。 对铜绿微囊藻 的抑制 作用 从高 到低依 次为 石油 醚 、 乙酸乙酯 、正丁醇 、三 氯甲烷 的提取 液 , 说 明大麦 秸秆对 藻有 抑制作用的 化感物质可能 主要存在 于石油 醚 、乙酸乙 酯的提 取物中 。 2.2 秸秆有机溶剂粗提物化感物质的检测 2.2.1 石油醚粗提物的 GC-MS 鉴定结果与分析
度 200 ℃, 采用 全扫描方式 , 扫 描范 围为 20～ 50 amu, 溶 剂延 迟 4.80 min 。 检测结果用 NIST2.0/ EPA/ NIH 质 谱标准 谱库进
行检索 , 根据正 反检 索值 的高 低及 相似 性 , 确定 化合 物 的结
构 , 用面积归一化法计算化合物的相对含量 。
本文用石油醚 、三氯甲 烷 、乙 酸乙酯 、正丁 醇等 提取麦 秆 浸泡液中的抑 藻物质 , 采 用气 质联用(GC-MS)法 对提 取液 进 行分析 , 并进一步对可能的抑藻物质进行试验验证 。
1 材料与方法
1.1 试验材料 大麦秸秆取自无锡市梅村 。 将收割后 的大麦秸秆除根剪
成 2 cm 的 小段 , 在 蒸馏水 中浸 泡 15 d(50 g/ L), 然后 用 0.45 μm 的微孔滤膜过 滤 , 灭菌 , 4 ℃冰 箱保 存备 用 。 铜绿 微囊 藻 (Microcystis aeruginosa)购自中科院武汉水生 生物研究 所 , 编号 为 FACHB-912 。 1.2 大麦秆浸提液抑藻活性成分的提取
光暗时间比 12 h∶12 h 的 GPJ 光照 培养箱 中培 养 。 藻细 胞膜 透性参照谢田等[ 11] 的紫外 吸收 法测定 藻细 胞中 非电解 质的
渗出率 , 以 OD264/ (g·h)(FW)表示 。 1.5 数据处理方法
根据藻细胞数目计算秸秆化感物质对铜绿微囊藻的相对
抑制率[ 11] , 计算公式为
石油醚提物液的 GC-MS 分析 结果见 图 3 和表 1。 从 表 1 可以看出 , 石油醚提取的有机成分比较多 , 含量较大的成分有 N , N-亚甲基-10-十一 碳烯 酰胺 、邻 苯 二甲 酸二 丁酯 和 1, 3-苯 二甲酸-二乙酯 , 相对含量占 27.67%, 可能 为主要的 抑藻活性 物质 ;此外 , 还含有少量的醇 、脂肪酸衍生物等 。 2.2.2 乙酸乙酯粗提物的 GC-MS 鉴定结果与分析
1.4 试验方法 取一定量处于对数期的藻液 , 加入一定量的抑制物 , 对照
组加入等量溶剂 , 用 BG11 培 养基培 养液(121 ℃灭菌 30 min) 定容 100 mL(1 ×105 mL-1)。 每份设 3 个平行样 。 将上述样品
置于 25 ℃、 相对 湿度 75 %、 光照强 度 40 ～ 80 μmol/ (m2·s)、
图 3 石油醚粗提物的 GC-MS 总离子流谱图 Fig .3 TIC chromatograph of petroleum ether extracts by
GC-MS analysis
表 1 石油醚粗提物的化学成分的 GC-MS 分析结果 Table 1 Identified components of petroleum ether extract
(Alexandrium tamarense)的 生长 具 有明 显 的抑 制作 用 。 Murray 等[ 8] 研究表明 , 大麦秸秆降解过程中产生的邻苯基苯酚 、对甲 苯酚等酚酸类化合物可以有效抑 制铜绿微囊藻 。 孔垂华等[ 9] 研究了秸秆中非酚酸类物质的化 感作用 , 其中羟基肟酸 、环己 烯酮 、黄酮具有一定的抑制活性 。 目前 , 研 究者对秸秆抑藻物 质的产生及抑藻机理 尚无一 致看法 , 有必 要对此 进行深 入研 究。
取一定量大麦秸秆 浸泡过 滤液 , 按照溶 剂的极 性递减 依 次用等量的石油醚 、三氯 甲烷 、乙酸乙 酯 、正 丁醇与 分液漏 斗 进行萃取[ 10] , 重复 3 次 。 有机相 经 CaCl2 脱水 、 过滤 , 于 旋转 蒸发仪(上海亚荣生化 仪器厂 , RE-52)上 在 39 ℃条 件下进 行 浓缩 , 并用甲醇溶液复溶至 2 mL 。 大麦 秸秆叶中 抑藻成 分的 提取分离流程见图 1 。 1.3 化感物质的 GC-MS 鉴定
0 引 言
随着工业化 、城市化 的发展 及化肥的 大量 使用 , 氮 、磷等 营养物质大量进入水体 , 湖泊等富营养化日益严重 , 导致有害 藻华频发 。 从高等植 物中提 取的化 感物质 作用于 水华藻 类 , 不但可以抑制藻类的生长 , 治理富营养化 , 而且不易造成二次 污染 , 对于维持生态 系统平衡 有较高 的安全 性[ 1] 。 秸秆 抑藻 作为一种行之有效的方法 , 具有经济 、高效 、安全的特点 , 得到 了广泛认同 。但秸秆 抑藻机 理尚不 明确 , 目前最 被认可 的是 化学机理 , 即大麦秆在浸泡 、降解过程中产生酚类 、酯类 、蒽醌 类等 化 感 物 质 , 它 们 能 够 很 好 地 抑 制 藻 类 生 长[ 2] 。 Gibson 等[ 3] 通过研究大麦秆对小球 藻(Chlorella vulgaris)等的 抑制试 验发现 , 大 麦秆 浸 出 液 中 的 某 些 化 合 物 抑 制 了 藻 类 生 长 。 Pillnger 等[ 4] 提出 , 大麦 秆 的 抑藻 作 用 主 要是 酚 类 物 质产 生 的 , 很可能是丹宁酸的作用 。 Evearll 等[ 5-6] 用大麦秆 浸出液处 理弱细颤(Oscillatoria tenuis)和 浮 游绿 藻 , 藻类 生长 被显 著抑 制 , 其中 2, 6-二甲 氧 基-4-酚 抑 藻 作用 最 强 。 杨 维 东 等[ 7] 指 出 , 酚酸类物质香草醛 、儿茶素和没食子酸对塔玛亚历山大藻
＊ 收稿日期 :2012-11-09 作者简介 :邓继选 , 硕士研究生 , 从事水污染控制研究 ;邹华(通信 作者), 副教授 , 博士 , 从事环境生物技术与 水体富营养 化治理技术研究 , zouhua @jiangnan .edu .cn 。 基金项目 :十二 五水 体污 染与治 理科 技 重大 专项(2012ZX07503002);江苏省自然科学基金项目(BK 2011161)
mol/ L的磷酸缓冲液(pH =7.2)清洗 2 次 , 每次 10 min。 移入小
离心管中 , 用 4%戊二 醛及 %锇 酸溶液 双重 固定 , 经各 级乙
醇(10%、30 %、50%、70%、90 %)脱水 , 干燥 、喷镀金属处 理 , 切
片后在 Quanta-200 扫描电镜下观察 。
IR=(1-N/ N 0)×100 %
(1)
式中 IR 为相对 抑制 率 ;N 为 加入 浸出液 试验 组的 藻密 度 , mL -1 ;N 0 为对照组藻密度 , mL-1 。
1.6 藻细胞超微结构的观察 取一定 量 藻 液 , 4 000 r/ min 离 心 15 min, 沉 淀 物 用 0.1
乙酸乙酯粗提物的 GC-MS 分析结果 见图 4 和表 2 。 从表 2 可以看出 , 含量最大 的物质为 十六烷 基三 甲基溴 化铵 和 1, 3-二苯二甲酸-二 乙酯 , 可能为主要的抑藻活性物质 ;另外 ,
图 2 不同有机溶剂粗提物的铜绿微囊藻抑制率曲线 Fig .2 Inhibition curves of Microcystis aeruginosa by crude extract
图 1 大麦秸秆叶中抑藻成分的提取分离流程 Fig.1 Isolation process of antialgal chemicals in barley straw
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Vol.13 No .6 安 全 与 环 境 学 报 第 13 卷第 6 期
邓继选1 , 邹 华1 , 庄 严2
(1 江南大学环境与土木工程学院 , 江苏无锡 214122; 2 无锡市环境监测中心站 , 江苏无锡 214025)
摘 要 :大麦秸秆具有较好的 抑藻效能 。 为 了揭示化 感物质抑 制藻 类的机理 , 用极性由小到大的 4 种有机溶剂 ——— 石油醚 、乙酸乙酯 、三 氯甲烷 、正丁醇对大麦秸秆水浸液依次进 行提取 , 分 离获得其 中的抑 藻物质 , 研究抑藻物质对铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)的抑制率 , 及藻细胞的膜透性和亚显微结构的变化 。 结果表明 , 大麦秸秆粗提物 对铜绿微囊藻生长的抑制强度从高到低 依次为石 油醚 、乙酸 乙酯 、正 丁醇 、三氯甲烷的提取物 , 其中石油醚 、乙酸乙酯的提取物具有更好的 抑制作用 。 通过 GC-MS(气相-质 谱联用)分析各 种化感 物质含 量 , 共 检测出 20 多种化学物质 , 其中胺类和酯类含量较大 , 可能为大麦秸秆 中主要的化感物质 。 十六烷基三甲基溴化铵(HTA B)和邻 苯二甲酸二 丁酯(DBP)对铜绿 微藻 具有 较好 的抑 制效 果 , 抑制 第 6 d 的半 效应 EC50分别达到 1.3 mg/L 和 2.1 mg/ mL 。 扫描电镜和藻细胞膜透性研究 表明 , 两种抑藻物质使铜绿微囊藻细胞的 膜结构遭 到破坏 , 细 胞膜透 性增加 , 细胞内溶物流出 , 使藻细胞蛋白等含量减少 , 并导致细胞内缺 少 合成生理 成分的物 质 , 这可能 是秸秆对 铜绿微囊 藻抑制的 机理之 一。 关键词 :环境工程学 ;大麦秸秆 ;化感物质 ;铜绿微囊藻 ;抑制作用 中图分类号 :X524 文献标识码 :A DOI :10.3969/ j .issn .1009-6094.2013.06.009
