real-time实验报告
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实时信息物理系统的实时性分析与验证的开题报告一、选题背景实时信息物理系统(Real-time Cyberphysical Systems,简称RCPS)是由信息系统、控制系统和物理实体所组成的多交叉领域的系统。
它对实时性有着极高要求,而实时性分析与验证是RCPS开发中的一个重要环节。
RCPS包含了从高速通信、智能物联网、自主驾驶汽车到能源系统,健康医疗与教育等多种应用领域。
如何有效地分析和验证RCPS的实时性具有重要意义。
二、选题意义RCPS的实时性分析和验证是RCPS的重要研究领域。
其中可实时性、时序正确性和拓扑稳定性是RCPS实时性分析中的三个基本要素。
研究实时性分析和验证方法对RCPS的开发和使用具有重要意义。
三、选题目的和内容本论文旨在研究RCPS的实时性分析和验证方法,分析RCPS实时性问题的本质,提出有针对性的解决方案。
论文主要内容包括以下三个方面:1. RCPS实时性分析的基本理论框架在系统架构、通信协议、系统引擎、控制算法等方面深入探讨RCPS 实时性分析的理论框架,包括可实时性、时序正确性和拓扑稳定性分析的基本理论,为后续分析和验证提供理论基础。
2. RCPS实时性分析的方法和工具通过分析和对比现有的RCPS实时性分析工具,总结RCPS实时性分析的主要方法,包括模型检查、仿真、优化和测试等,介绍实时性分析的主要算法和技术,探究如何建立合适的实时性验证模型。
3. RCPS实时性分析的应用以智能家居系统为例,通过实际应用RCPS实时性分析的方法和工具,对实时性分析的结果进行验证,探究RCPS实时性分析方法的实际应用效果。
四、选题研究重点本论文研究的重点包括RCPS实时性分析的基本理论、实时性分析方法和工具,以及实时性分析在智能家居系统中的应用。
根据RCPS实时性分析的可行性、准确性和实用性,确定RCPS实时性分析的优化方向和未来发展趋势。
五、选题的研究思路及方法本论文研究方法主要由以下几个方面组成:1. 系统分析研究:对RCPS实时性分析的基本理论进行分析,探究RCPS实时性分析的本质和原理。
理论基础聚合酶链式反应作为一种革命性的方法在生物学研究的历史中占据了重要的地位。
以此为基础发展出包括real-time PCR在内的多项应用技术。
自诞生后real-time PCR技术持续发展,从简单的增扩到整个PCR过程,real-time PCR表现出比PCR更敏感、更明确的定量分析特性和对识别等位基因的能力。
不少人以为real-time就是意味着可以在显示器上看到每个循环增扩曲线的增长。
事实并非如此,早期的软件不能在运行期间提供可视化的增扩曲线。
主要是因为SDS软件采用整个平台最终的数据执行数据分析工作,而不是分析每个单独的反应循环。
对某些设备来说,必须向分析软件提供实时的最终的数据,有些设备则不需要。
前一种设备允许软件实时跟踪每个加样口的增扩曲线,同时显示在电脑屏幕上。
Real-time PCR其实是一种real-time设备。
RNA定量分析依靠逆转录酶制作cDNA (complementary DNA)O常见的逆转录酶有2种,AMV 和MMLVo AMV是一种鸟类myeloblastosis病毒的二聚体蛋白质,MMLV来自于鼠科leukemia 病毒的monomeric蛋白。
2种酶都有RNase把RNA变性为RNA-DNA杂交体的活性,比较而言AMV 有更高的RNase H活性。
RNase H活性和依赖于RNA的DNA聚合酶活性能被mutagenesis区分开来。
更重要的是每个AMV能把较多的分子聚拢在一起,推动增扩反应的进行。
原生的AMV 有高于MMLV的适用温度,42°C对37°C。
修改后的变种可以有更高的温度极限,分别是AMV58 °C, MMLV55C按照以上的描述,大家可能认为改造后的AMV是适宜从RNA制作cDNA的酶。
然而,在实际使用中经改造的MMLV工作的较好。
其中的原因目前仍不明,猜测高温破坏了2种酶的聚合酶活性,但残留的DNA绑定活性对Taq polymerase形成物理障碍。
一、实验背景随着物联网、移动互联网等技术的快速发展,数据量呈爆炸式增长,传统的数据中心架构已无法满足实时性和低延迟的需求。
边缘计算作为一种新兴的计算模式,通过在数据产生源头进行计算处理,有效降低数据传输延迟,提高系统响应速度。
实时边缘缓存作为边缘计算的重要技术之一,旨在将数据缓存至边缘节点,提高数据访问速度,降低网络负载。
二、实验目的1. 了解实时边缘缓存的基本原理和关键技术;2. 掌握实时边缘缓存系统的设计与实现方法;3. 评估实时边缘缓存系统的性能和适用场景。
三、实验内容1. 实验环境实验环境包括一台服务器、一台边缘节点和一台客户端。
服务器用于模拟数据源,边缘节点用于缓存数据,客户端用于访问数据。
2. 实验步骤(1)搭建实时边缘缓存系统根据实验需求,设计实时边缘缓存系统架构,包括数据源、边缘节点、缓存策略和缓存节点等模块。
(2)数据预处理对服务器端产生的数据进行预处理,包括数据压缩、加密等操作,以提高数据传输效率。
(3)缓存策略设计根据数据访问模式和缓存节点资源,设计合适的缓存策略,如最近最少使用(LRU)、最少访问(LFU)等。
(4)边缘节点实现在边缘节点上实现缓存功能,包括数据存储、缓存管理和缓存失效等。
(5)客户端访问客户端通过边缘节点访问所需数据,并记录访问时间。
3. 实验结果与分析(1)实验结果通过实验,我们得到以下结果:1)数据传输时间:在实时边缘缓存系统下,数据传输时间明显缩短,平均延迟降低50%;2)缓存命中率:在边缘节点缓存策略优化后,缓存命中率提高至90%;3)系统负载:边缘节点负载明显降低,有效缓解了数据中心压力。
(2)实验分析1)实时边缘缓存系统通过将数据缓存至边缘节点,降低了数据传输距离,提高了数据访问速度;2)缓存策略优化后,提高了缓存命中率,进一步降低了数据传输时间;3)边缘节点负载降低,有助于提高整个系统的稳定性和可靠性。
四、实验结论1. 实时边缘缓存技术能够有效降低数据传输延迟,提高系统响应速度;2. 缓存策略优化对实时边缘缓存系统性能有显著影响;3. 实时边缘缓存技术适用于数据量较大、实时性要求较高的场景。
操作系统实时性能测试与分析实验研究引言:在当今信息技术高速发展的时代,操作系统的实时性能对于实现高效、稳定的计算机系统至关重要。
因此,通过实验研究操作系统的实时性能测试与分析,可以帮助我们了解操作系统在实时环境下的表现,从而改进现有的操作系统或设计出更为高效的新系统。
本文将围绕操作系统实时性能测试与分析展开研究,并提出一种有效的实验方法。
实验设计:1. 实验背景操作系统的实时性能是指在严格的时间限制要求下,操作系统是否能够响应和处理任务。
实时任务的特点是对任务完成时间有严格要求,比如航空控制、医疗设备等。
为了验证操作系统的实时性能,我们需要设计一系列实验。
2. 实验目标本次实验的目标是测量和分析操作系统在实时环境下的性能表现,包括任务调度、响应时间、资源利用率等指标。
3. 实验环境搭建选取适当的实验平台和实验工具,例如使用虚拟机搭建机器内的操作系统,通过性能测试工具进行性能监测和分析。
实验步骤:1. 任务设置首先,我们需要设计一组实时任务,包括不同优先级和不同执行时间的任务。
这些任务可以模拟真实应用场景下的实时任务。
2. 实时任务调度测试通过调度算法,将实时任务按照优先级进行调度,并且在实时环境下进行任务调度测试。
记录每个任务被调度执行的时间和频率。
3. 响应时间测试在实时环境下,模拟多任务同时到达处理器并进行执行。
通过记录任务从到达处理器到开始执行的时间差,来评估操作系统的响应时间。
4. 资源利用率测试测量操作系统在实时环境下对处理器、内存等资源的利用情况。
通过监测资源的占用情况,可以得出资源的利用率。
实验结果分析:1. 调度算法评估根据任务调度测试的结果,对不同调度算法的性能进行评估。
例如,比较先来先服务(FCFS)和最短作业优先(SJF)调度算法在不同优先级任务下的表现差异。
2. 响应时间分析根据响应时间测试的结果,评估操作系统在实时环境下对任务响应的能力。
通过分析任务的执行时间、到达时间和优先级,来确定系统是否满足实时性能要求。
arp协议实验报告心得实验名称实验三--分析ARP及IP协议日期2019年04月15日一、实验目的:1.学会使用PacketTracer进行包跟踪及数据包协议格式分析。
2.理解ARP工作机制,熟悉ARP协议格式。
3.熟悉典型的IP协议格式。
4.理解IP分段机制。
二、实验环境:CiscoPacketTracer三、实验内容:1、用PacketTracer(5.3或以上版本)打开文件31_ARP&IP_Testing.pkt.pkt。
注意:Router1的Eth1/0的MTU=1420Byte,其余均为1500Byte。
2、分析ARP的工作原理。
(1)在Realtime模式下,尽量清除所有设备(PC机及路由器)中的ARP缓存信息,对于不能清除(有些路由器中的ARP缓存信息不能清除)的记录下相关缓存信息。
注:PC机中查看ARP缓存的命令为arp–a,清除ARP缓存的命令为arp–d。
路由器中查看ARP缓存的命令为Router#showarp,清除的命令为Router#cleararp-cache。
R1:R2:(2)在simulation模式下,由PC(1.10)向PC(1.20)发送一个Ping包,观察包(ICMP及ARP)的传递过程,同时注意相关PC 机、路由器的ARP缓存变化情况,记录下相关信息,并对其中的ARP包进行协议格式分析。
注意:在Filter中同时选中ICMP及ARP。
答:a、首先,选择在simulation模式下,选择ICMP和ARP:]B、查看pc机的ARPPC1.10:PC1.20:路由器:注:路由器的第一条ARP地址格式,是PC1.10的默认网关的地址。
C、发送数据包后,路由器ARP变换如图:数据包传送的路径:数据包先到达交换机,再到达pc1.20;数据包也会传送到路由器,但发送了错误。
数据包传送的路径:数据包返回时,只经过交换机,就直接到达pc1.10,并不会再传送到路由器。
实时监控功能分析实验报告实时监控功能是指对系统的状态、进程、网络等进行实时监控,以便于及时发现问题并采取相应的措施。
本实验旨在探究实现实时监控功能的实现原理,并通过测试性能来评估其可行性与可靠性。
一、实现原理本实验使用的实时监控工具为Zabbix。
Zabbix是一款开源的网络监控、管理和分析软件。
其主要功能包括:实时监控、历史数据记录、告警通知、自动发现、可视化监控等。
其实现原理如下:1、Zabbix Agent:在要监控的主机上运行Zabbix Agent,用来收集主机上各项数据,并将其传递给Zabbix Server。
3、Zabbix Frontend:提供给用户界面,用来管理和监控整个系统的状态。
二、测试性能在测试性能前,需要先搭建好一个环境。
我们搭建了一个由一个Zabbix Server和两个Zabbix Agent组成的网络环境,其中Zabbix Server用来收集和处理来自两个不同主机的数据,两个Zabbix Agent在不同主机中运行,并收集其它主机的数据。
测试方法如下:1、CPU监控:通过Zabbix监控CPU使用率,记录CPU占用率的变化情况。
测试结果显示,当CPU使用率达到90%以上时,Zabbix系统能够及时发现。
该测试说明,Zabbix系统能够实现对CPU使用率的实时监控。
三、分析与总结通过测试发现,Zabbix系统能够实现对CPU使用率、内存使用率、网络占用率等的实时监控,其性能表现较为稳定和可靠。
但需要注意的是,Zabbix系统在大数据处理上的性能尚有待提升。
总的来说,实时监控功能在网络管理和应用运维中扮演着重要的角色。
本次实验的研究结果表明,实时监控功能的实现原理相对简单,且其性能表现也比较良好,因此可以成为网络管理和应用运维中的有力工具。
MIQE指南范文MIQE指南是科研实验中遵循的一项质量标准,全称为“Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments”,直译为“发表定量实时聚合酶链反应实验证据的最低信息要求”。
它是为了提高定量实时聚合酶链反应(qPCR)实验的质量与可重复性而制定的指南。
MIQE指南包含了一系列涵盖所有与qPCR实验相关的信息要求,以确保实验与结果的准确性和可重复性。
它提供了一个标准化的实验报告模板,研究人员可以按照这个模板来组织和记录他们的实验过程和结果。
MIQE指南也为实验室提供了一些推荐的实验操作规范和技术流程,以确保实验过程的一致性和标准化。
2.试剂和材料:需要提供准确的实验试剂和材料的详细信息,包括生产商、批号和纯度等。
3.实验设计和数据分析:需要提供实验的设计和数据分析方法,包括实验方案、控制组设置、技术重复次数等。
4.仪器和反应条件:需要提供所使用的qPCR仪器的详细信息,包括型号和硬件配置,还需要提供反应条件等信息。
5.正确性和灵敏度:需要提供实验中用于验证方法准确性和灵敏度的相关信息,例如限制性酶切、序列分析等。
6.结果和讨论:需要提供实验结果的详细信息,以及对结果的客观分析和讨论,包括重复性和统计学分析等。
MIQE指南的目标是确保qPCR实验在不同实验室之间的结果是可比较和复制的,有助于科学研究的可靠性和可重复性。
同时,MIQE指南也使得科学家能够更好地了解实验操作的细节,以便更好地理解和解释结果,并且可以帮助实验设计和分析方法的改进。
总之,MIQE指南是为了提高定量实时聚合酶链反应实验的质量和可重复性而制定的一项质量标准指南。
它要求研究人员提供详细的实验描述和结果分析,以确保实验和结果的准确性和可比较性。
MIQE指南对于qPCR实验的标准化和科学研究的可靠性和可重复性具有重要意义。
Category: SemiconductorPXI-Based Embedded System Controls Semiconductor Metrology ToolJim Kring and Dave Houser, James Kring, Inc.Craig Moore, EUV TechnologyNI Products Used:LabVIEW, LabVIEW Real-Time Module, NI-DAQmx, NI-VISA, PXI-1042, PXI-8145 RT, PXI-7344, PXI-6070E, PXI-6527, and PXI-8420/16Pull QuoteJames Kring, Inc., and EUV Technology produced an affordable system in less time by using PXI and LabVIEW Real-Time.The ChallengeDeveloping a networked embedded control and measurement system for a semiconductor metrology tool to measure extreme ultraviolet lithography (EUVL) mask blanks.The SolutionUsing National Instruments LabVIEW Real-Time and PXI for embedded hardware control and LabVIEW for Linux to host the networked operator and supervisory graphical user interfaces on multiple touch-screen displays.The Latest in Semiconductor Manufacturing TechnologyThe semiconductor manufacturing industry is actively evaluating new technologies to further reduce chip size and increase circuit density. Extreme ultraviolet (EUV) lithography is a new technology utilizing a shorter wavelength of light than traditional optical lithography to achieve the goal of smaller circuit traces. One critical component of the EUVL process is a mirror called a “mask blank,” which is coated with a nonreflective image (a “mask”) of the circuit to be projected and burned onto the chip. For the image to be projected evenly, the mask blanks must have a uniform and high reflectivity of EUV light across their entire surface. Because high-energy EUV light does not travel through air, this process must be performed, and any measurements taken, inside a high-vacuum chamber.A reflectometer measures the reflectivity, and, thus, the quality, of the blanks by reflecting monochromatic EUV light off the blank and measuring the corresponding loss of intensity. The reflectometer varies the wavelength of light, sweeps through an entire target spectrum, and produces a reflectivity versus wavelength curve.EUV Technology, a short-wavelength electromagnetic radiation utilization and analysis instrumentation manufacturer, asked James Kring, Inc. to partner in designing an embedded control and measurement system for an EUV reflectometer metrology tool used on a semiconductor factory floor. Touch-screen user interfaces would enable common tasks such as editing and running measurement recipes, viewing results, monitoring status, and servicing.The tool control system manages the robotics responsible for transferring the mask blank from a standard mechanical interface (SMIF) pod into a high-vacuum measurement chamber, and the environmental control system of pumps, valves, and pressure gauges responsible for maintaining the high-vacuum environment. The reflectometer’s measurement system encompasses a laser, a laser-powered meter, EUV optical sensors, and a custom four-axis servo motor driver system that generates and monochromates the EUV light. The hardware system consists of approximately 10 RS232 serial devices, 40 digital I/O lines, two analog input signals, and four servo motion control axes.Integrated PXI and LabVIEW Real-Time Provide a Powerful and Cost-Effective SolutionWe chose the PXI-8145 RT embedded controller as the LabVIEW Real-Time control and measurement application execution target. It provided ample processing capabilities and integrated easily with a wide array of plug-in PXI modules. We selected the PXI-6527 digital I/O module for its isolated input/output capabilities and its ability to switch and monitor non-TTL level signals found inside the tool. We chose the PXI-8420 16-port asynchronousRS232 interface module for its LabVIEW Real-Time compatibility and ease of programming via NI-VISA driver software.Each measurement iteration required synchronizing the EUV light source generation with the corresponding EUV detector measurement. With the PXI platform Real-Time System Integration (RTSI) bus, we tightly synchronized the laser firing with the analog input acquisition by sharing high-speed digital trigger signals directly on the PXI backplane. We used the PXI-6070E multifunction data acquisition module for its aforementioned digital triggering capability, its ability to easily meet the customer’s 1 MHz sampling rate requirement, and the ease of programming via NI-DAQmx driver software.We chose the PXI-7344 motion control module to control the custom servo motor drivers which generated and monochromatted the EUV light source. We took advantage of the PXI-7344 for its ability to embed custom motion control programs written using NI FlexMotion VIs and run them directly on its own onboard processor. This feature was instrumental in controlling the reflectometer’s reel-to-reel constant-tension tape drive, a critical componentin the EUV source-generation process.LabVIEW Real-Time Shortens Development Time with Remote Development and DebuggingTraditional embedded system development requires many tedious, manual steps. For example, after developing the source code, the user must be compile it and transfer it onto the embedded system. Then the user must test and debug the application, often requiring special debugger cables to be hooked up between the embedded system and the debugging PC. If software changes are required, the user must repeat the process until achieving the desired result.However, with LabVIEW Real-Time targeting our embedded PXI controller over the network, these steps were completely transparent, dramatically reducing testing anddebugging time. We used LabVIEW for Windows to rapidly develop our control and measurement application, and we used the LabVIEW Real-Time Module to upload, execute, and debug our application on the PXI-8145 controller real-time operating system. LabVIEW also provided a powerful suite of TCP/IP VIs for developing the communications portion of this distributed control and measurement system. The embedded PXI application managed low-level hardware and measurement control, while the LabVIEW for Linux applications running on the touch-screen terminals performed high-level operator control and measurement analysis. We customized existing NI TCP/IP client/server software to develop a truly distributed system with three networked subsystems messaging control, status, and response data via Ethernet.Cost-Effective Solution Affords Increase in ProductivityJames Kring, Inc., and EUV Technology produced an affordable system in less time by using PXI and LabVIEW Real-Time. We realized a significant increase in software productivity by utilizing the advanced embedded system debugging tools of LabVIEW Real-Time and the ready-to-use data acquisition, motion, networking, and analysis VIs that ship with the LabVIEW development environment. Using the PXI hardware platform meant we could focus on customer performance requirements and simply choose the appropriate plug-in modules to get the job done. Should the system evolve, we can easily add hardware and enhance the software using the flexible and scalable PXI and LabVIEW Real-Time platforms.EUV Technology837 Arnold Dr., Suite 400Martinez, CA 94553James Kring, Inc.<<<<<<COULD NOT GET CONTACT INFO ONLINE>>>>>>。
DNA甲基化检测实验一、重亚硫酸盐的测序法实验流程(BSP)(Bisulfite Genomic Sequence)原理:结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。
重亚硫酸盐处理后,用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链式反应(PCR)。
PCR产物中原先非甲基化的胞嘧啶位点被胸腺嘧啶所替代,而甲基化的胞嘧啶位点保持不变。
PCR产物克隆后进行测序。
通过这个方法能得到特定位点在各个基因组DNA 分子中的甲基化状态。
该方法特点是:•特异性高,它能够提供特异性很高的分析结果,这是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比拟的;•灵敏度高,可以用于分析少于100个细胞的检测样品。
用微量的基因组DNA进行分析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点分布图。
重亚硫酸盐测序法技术实验流程A.DNA制备用DNA抽提试剂盒(Promega, cat. no. A1125)抽提组织,细胞培养物,石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。
B.重亚硫酸盐处理C.DNA纯化用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。
D.PCR扩增E.PCR产物琼脂糖电泳后回收纯化F.PCR产物连接到pMD19-T (Takara) 载体中克隆及测序。
G.用分析软件对各样本测序结果进行甲基化程度分析二、甲基化特异性的PCR实验流程(methylation-specific PCR, MSP)原理:甲基化特异性的PCR是一种灵敏度高且操作相对简单的甲基化研究方法。
重亚硫酸盐处理DNA后,基因组DNA发生的由甲基化状态决定的序列改变。
随后进行引物特异性的PCR。
该方法引物设计是关键。
MSP中设计两对引物,即一对结合处理后的甲基化DNA链(引物对M),另一对结合处理后的非甲基化DNA链(引物对U)。
检测MSP扩增产物,如果用引物M能扩增出片段,则说明检测位点存在甲基化;若用引物U扩增出片段,则说明被检测的位点不存在甲基化(图3)。
real_time的指标Real-time metrics are crucial for businesses in today's fast-paced and competitive environment. These metrics provide real-time insights into various aspects of a business, allowing for quick decision-making and effective response to changing market conditions. From a business perspective, real-time metrics offer several advantages.Firstly, real-time metrics enable businesses to monitor and track their performance in real-time. This allows for immediate identification of any issues or deviations from the desired targets, enabling prompt corrective actions. For example, if a company notices a sudden drop in website traffic, it can quickly investigate the cause and take necessary steps to rectify the situation, such as optimizing the website or launching a targeted marketing campaign.Secondly, real-time metrics help businesses stay ahead of the competition. By constantly monitoring keyperformance indicators (KPIs) in real-time, companies can identify emerging trends, market shifts, and customer preferences faster than their competitors. This allows for agile decision-making and the ability to adapt strategies accordingly. For instance, an e-commerce company that tracks real-time sales data can quickly identify which products are performing well and adjust its inventory or marketing efforts to capitalize on the trend.Moreover, real-time metrics provide businesses with valuable insights into customer behavior and preferences. By analyzing real-time data from various sources such as social media, website analytics, and customer feedback, companies can gain a deeper understanding of their target audience. This helps in tailoring products, services, and marketing campaigns to better meet customer needs and expectations. For example, a retail store that monitors real-time customer feedback on social media can quickly address any negative experiences and improve overall customer satisfaction.Real-time metrics also play a crucial role in riskmanagement and fraud detection. By monitoring real-time data, businesses can detect anomalies or suspicious activities promptly. This is particularly important in industries such as finance and cybersecurity, where immediate action is required to prevent potential losses or breaches. For instance, a bank that tracks real-time transaction data can quickly identify any unusual patterns or fraudulent activities and take appropriate measures to mitigate the risks.Furthermore, real-time metrics facilitate effective resource allocation and optimization. By continuously monitoring resource utilization and performance metrics in real-time, businesses can identify areas of inefficiency or underutilization. This allows for timely adjustments in resource allocation, leading to cost savings and improved operational efficiency. For example, a manufacturing company that tracks real-time production data can identify bottlenecks or equipment failures and take immediate action to minimize downtime and maximize productivity.Lastly, real-time metrics enhance transparency andaccountability within an organization. By making real-time data accessible to relevant stakeholders, businesses foster a culture of data-driven decision-making and encourage individual and team accountability. This promotes a proactive approach to problem-solving and empowers employees to take ownership of their performance. For instance, a sales team that has access to real-time sales data can track their progress, identify areas for improvement, and take necessary actions to achieve their targets.In conclusion, real-time metrics offer numerousbenefits to businesses. They enable organizations to monitor performance, stay ahead of the competition, understand customer behavior, manage risks, optimize resources, and foster transparency and accountability. By leveraging real-time data, businesses can make informed decisions, respond promptly to market changes, and drive growth and success in today's dynamic business landscape.。
Real-time PCR
(RT-PCR)
实验报告
贰零零九年十月二十七日
实验报告内容包括:
1 材料和方法
1.1 主要试剂
1.2 主要仪器
1.3主要试剂的配制
2.总RNA的提取和鉴定
2.1总RNA的提取
2.2总RNA纯度和浓度的测定
3. cDNA第一链合成:
4.引物设计及PCR反应
5. 结果分析
1 材料和方法
1.1 主要试剂
Trizol ® Reagent Invitrogen公司
Reverse Ttanscription System Promega公司
DEPC Sigma公司
Taq polymerase Promega公司
dNTP Mix(10mM) Promega公司
DNA Marker(DL2000) TIANGEN公司
琼脂糖 Sigma公司
氯仿上海试一化学试剂有限公司
异丙醇上海试一化学试剂有限公司
引物合成上海生工
溴化乙锭 Amresco公司
1.2 主要仪器
PCR仪 BIO-RAD 公司
RNA/DNA calculator Pharmacia公司
凝胶成像系统上海四星生物技术有限公司
电热恒温水槽上海精宏实验设备有限公司
高速冷冻离心机 BECKMAN公司
DNA水平电泳仪 BIO-RAD公司
电子天平上海精科天平厂
1.3主要试剂的配制
1.3.1 Tris-硼酸 (TBE)电泳缓冲液配方:
5X : 54g Tris碱
27.5g 硼酸
20ml 0.5mol/L EDTA (ph 8.0)
加水稀释至1L。
使用时稀释成0.5X TBE
1.3.2 6 x DNA上样缓冲液配方:
0.25%(w/v) 溴酚蓝
0.25% (w/v) 二甲苯青FF
30% (w/v) 甘油水溶液
1.3.3用于配制试剂的DEPC-H2O
双蒸水1000ml加DEPC 1ml,于磁力搅拌器上搅拌2hr,然后高温高压湿热灭菌,备用。
1.3.4 75%酒精
125ml DEPC-H2O加375ml无水乙醇,混匀。
2.总RNA的提取和鉴定
2.1总RNA的提取
抽提RNA时,首先应确保室内清洁无污染,空气处于静止状态,并用75%的酒精对实验台
及所需试剂、实验器材及实验者本身进行消毒处理。准备完毕方可按照Trizol® Reagant试剂
制造商提供的步骤进行总RNA提取实验。实验步骤简述如下:
(1) 50mg组织中加入1ml TRIZOL Reagent,充分匀浆。
(2)将匀浆液室温静置5min,加入200μl氯仿,来回颠倒混匀15sec,室温静置2-3min,
4℃ 12000r/min离心15min;
(3)小心转移上层水相于一新的1.5ml灭菌除酶的离心管中,加入0.5ml的异丙醇室温静
置10min,4℃ 12000 r/min离心10min,小心弃上清。白色沉淀为RNA;
(4)RNA洗涤:加入1ml 75%的酒精,充分振荡以洗净其它杂质,4℃ 7500r/min离心5min,
小心弃上清;
(5)RNA再溶解:将离心管小心倒置放于高温灭菌的抽提纸上自然干燥10-15min,加入DEPC
水30μl溶解。
2.2总RNA纯度和浓度的测定
采用紫外分光光度法,测定RNA样品在波长260nm和280nm的紫外吸收值。根据OD260
为1时相当于RNA 40μg/ml确定RNA的量,通过下述公式计算RNA的浓度:
RNA( μg /μl )=OD260×40×100/1000
同时,计算OD260和OD280的比值(OD260/OD280),当两者比值在1.8-2.0时,说明提取
的RNA纯度高,无蛋白质和DNA的残余。
通过测定,检测出各样品A260 /A280的值如下:
OD260/280: 1.81 1.82 1.88 1.91 1.77 1.80 1.95 1.81 1.82 1.88 1.91 1.77 1.83
1.93 1.81 1.88 1.96 1.77 1.83 1.92 1.81 1.80 1.85 1.91 1.75 1.83 1.95 1.94 1.87
1.94 1.79 1.79 1.96 1.81 1.82 1.88 1.91 1.77 1.83 1.95 1.86 1.86 1.81 1.77 174 1.88
1.98 1.82 1.86 1.86 1.95 1.77 1.83 1.95 1.82 1.88 1.91 1.77 1.83 1.87 1.81 1.84
1.88 1.89 1.84 1.83 1.95
顺序按Realtime 名字.
3. cDNA第一链合成:
(1)首先在0.2ml PCR管内加入以下试剂:
总RNA 2μl
Oligo(dT)18 Primer(0.1ug/ul) 1μl
0.1%DEPC水 8μl
将上述样品混匀离心数秒后,于70℃反应5min;然后立即转至冰上2-3 min;
(2)在以上混合液中再加入以下试剂:
M-MLV 5×Buffer 4μl
d NTP Mix(10mM) 4μl
RNase inhibitor 0.5μl
M-MLV-RT 1 μl
Total volume 20μl
将反应液置37℃ 60 min, 70℃加热10min灭活, 冰上冷却。所得cDNA第一链产物置-20℃保
存,待作PCR.
4.引物设计及PCR反应
首先在genebank中找到所研究基因的cDNA序列,然后于开放阅读框(ORF)保守区域,运
用Primer Premier 5结合 Dnastar分析软件及网上BLAST分析,设计并合成以下引物,引物
序列如下:
Real-time PCR反应体系: 10ul---
subgreen mix: 5ul,
primer F(5uM):1ul,
primer R (5uM):1ul,
cDNA :3ul.
2.Real-time PCR 程序:
Step1:50℃2min
Step2:95℃10min
Step3:95℃ 15second
Step4:60℃ 1min
转至step3