肺癌细胞系

日本临床癌研究组肺癌内科小组于1995年开始了由日本全国多家医院设施参加的ＥＰ方案与ＩＰ方案治疗进展型肺小细胞癌的临床比较实验。本实验预定3年完成230例,在完成了144例时进行分析就得到了ＩＰ疗法比ＥＰ疗法疗效更明显的结果,故提前结束了实验,此后的追踪结果也显示ＩＰ方案明显优于ＥＰ方案,二者的中间生存期分别为13个月、9个月,2年生存率分别为18. 9%、6. 5%。
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国内患者一般难以耐受同步放化疗,因此多采用“夹心”法治疗局限期ＳＣＬＣ,通常是几个周期化疗结束后给予局部放疗,然后再给予几个周期的化疗。
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总之,对于ＳＣＬＣ患者,目前一般认为4～6个周期的化疗已较为合适,过多的周期并不增加疗效。
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ＳＣＬＣ的最佳化疗疗程
一组ＳＣＬＣ患者采用标准剂量的ＥＰ方案化疗,另一组剂量增加,结果两组缓解率、中位生存期和1年生存率均无显著性差异,但大剂量组的骨髓毒性明显高于标准剂量组 。
2
局限型病例的治疗
90年代,胸部放疗的最佳方案, 是应用每日2次增加每次照射量的加速分割照射(ＡＨ)方法。
ＪＣＯＧ肺癌内科组对ＥＰ疗法的放化疗同时进行和序贯进行作了比较实验,结果显示放化疗同时进行有能提高生存期的倾向,其中位生存期27个月,3年生存率30%,为当时世界上疗效最好的方案。
同时,在美国还进行了ＥＰ方案加传统的每日1次胸部照射与ＥＰ方案加ＡＨ法胸部照射两种方案的比较实验,结果ＡＨ法的5年生存率及生存期均有明显提高。从此,这一疗法成为了治疗局限型小细胞肺癌不变的标准治疗方案。
ＳＣＬＣ治疗后复发的患者再次化疗是否有效主要取决于两个因素:①初次化疗是否有效,尤其是达到过完全缓解的患者再次化疗的有效率较高;②复发时间距初次化疗结束的时间越短,再次化疗效果越差。对于初次化疗结束后3个月内复发的患者,以往的研究表明再次化疗效果不好,有效率很低。

紫杉醇-顺铂联合药物控释系统对肺腺癌细胞系 A549细胞生长的抑制作用崔永;柳明亮;吴炳群;段新春;龚民【期刊名称】《首都医科大学学报》【年(卷),期】2014(000)006【摘要】Objective To observe paclitaxel and/ or cisplatin loaded microfiber by electrospinning technique, deliver this system to lung cancer cell A549 in vitro and observe the inhibition of cancer cell and to research effectiveness of controlled drugs delivered by electrospinning technique in antitumor field. Methods Lung cancer cell A549 was cultivated in vitro and incubated on 96-well plates with density of 1×104 p er well. The plates were incubated at 37 ℃ and saturated humidity for 24 hours. The plates were taken out and drugs were delivered at different concentrations in each group. There were controlled groups. Plates were incubated for 48 hours. Add in MTT(20 μL/ well) and incubated for 4 hours. The medium containing MTT was discarded thoroughly and 150 μL DMSO was added, gently shaken to get a clear solution 10 ~ 15 min later. OD 490 was determined. Inhibition rate of drugs was calculated. Results Poly propylene carbonate loading paclitaxel and cisplatin controlled delivery system by electrospinning technique could inhibit cancer cell in vitro, stronger than naked paclitaxel and cisplatin and their single drug-loaded microfiber. Poly propylene carbonate loading paclitaxel or cisplatin has stronger inhibitionto A549 lung cancer cells than naked paclitaxel or cisplatin. Blank poly propylene carbonate showed no inhibitory effect on the cancer cells. Conclusion Poly propylene carbonate loading paclitaxel and/ or cisplatinby electrospinning technique could inhibit lung cancer cells in vitro significantly. Controlled drug-delivery system by electrospinning technique could implant antitumor drugs locally, reduce toxicity and side effect of chemotherapeutics and have a great application potential.%目的：观察以聚碳酸亚丙酯乳液作为纺丝液，采用静电纺丝技术，负载紫杉醇和顺铂制备的载药纤维控释系统对体外培养的肺腺癌细胞系 A549的抑制率，为进一步的动物实验奠定基础，并探讨用于肺癌治疗的可行性。

仙鹤草水提液对肺癌A549细胞增殖的抑制作用温雅,毕蕾,张义彪,陈卫平3(南京中医药大学,江苏　南京　210046)摘　要:目的:探讨不同浓度的仙鹤草水提液对体外培养的人肺癌细胞系A549细胞增殖及凋亡的影响。

方法:采用不同浓度的仙鹤草水提液分别作用于体外培养的人肺癌细胞A549细胞株24、48、72h 后,MTT 法观察药物对肺癌A549细胞生长的抑制效应;作用于细胞48h 后倒置显微镜观察细胞形态学的改变;应用AO /EB 荧光染色法,观察不同浓度仙鹤草水提液对细胞凋亡的影响;Annexin V /P I 双染流式细胞仪检测经药物作用后A549细胞凋亡情况。

结果:仙鹤草水提液可剂量依赖性地抑制A549细胞的增殖,以48h 的增殖抑制作用最好;通过倒置显微镜可明显观察到细胞的形态学改变;细胞荧光染色出现了明显的凋亡细胞,表现为细胞皱缩、核染色质浓缩、核碎裂等凋亡特征性的形态学改变;流式细胞仪检测结果显示,仙鹤草水提液可明显诱导细胞凋亡。

结论:仙鹤草水提液可对人肺癌细胞系A549细胞具有显著的体外增殖抑制作用,其主要作用可能与诱导细胞凋亡有关。

关键词:仙鹤草水提液;A549细胞;细胞凋亡中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1002-2406(2009)05-0033-03基金项目:国家十一五支撑计划(2006BA I 11B08)作者简介:温雅(1983-),女,硕士研究生,主要研究方向:临床中药学。

通讯作者:3陈卫平(1959-),女,教授,博士研究生导师,主要研究方向:中药配伍效应与临床应用研究。

收稿日期:2009-06-01修回日期:2009-06-25 中药治疗肿瘤是我国在肿瘤治疗上的一大特色,由于中药的毒副作用小,对人体损害少甚至无害,使得中药抗肿瘤研究备受关注。

根据多年临床用药经验,笔者选取了八味临床常用抗肿瘤中药:莪术、三棱、丹参、川芎、羊乳、仙鹤草、附子、半夏,经过预实验发现仙鹤草具有较好的体外肿瘤增殖抑制作用。

暴露于空气污染，例如汽车尾 气和工业排放，会增加患肺癌 的风险。
职业暴露
在某些工作场所，例如采矿、 建筑和石棉行业，暴露于有害 物质会增加患肺癌的风险。
家族史
有肺癌家族史的人患肺癌的风 险更高，这表明遗传因素在肺 癌发生中发挥作用。
肺癌分类的历史与现状
肺癌分类不断发展，最早基于临床表现和X线影像，后来随着显微镜技术进步，开始基于病理形态学进行分类。 1981年世界卫生组织（WHO）首次发布肺癌病理分类，并持续更新，目前已进入第五版。
2021年WHO第五版
1
分子病理学和免疫ห้องสมุดไป่ตู้化
2015年WHO第四版 2
形态学特征
1981年WHO第一版 3
临床表现
2024年WHO肺癌病理分类最新版将进一步细化，并结合分子生物学和免疫组化检测结果，实现更精准的诊断和治疗。
2024 WHO肺癌病理分类的意义
精准诊断
新分类有助于提高肺癌诊断的 精准性，为患者提供更有效的 治疗方案。更详细的病理分类 可以更准确地评估肿瘤的生物 学特性，例如肿瘤的侵袭性和 转移潜能。
1 1. 诊断标准不统一
不同实验室和医生之间可能存 在诊断标准不一致的问题。
2 2. 缺乏客观指标
某些分类依赖主观判断，缺乏 客观可量化的指标。
3 3. 缺乏一致性
同一患者的肿瘤，不同时间或 不同部位的取样，可能得到不 同的分类结果。
4 4. 新型病理类型出现
近年来，随着研究的深入，一 些新的肺癌病理类型不断被发 现。
问答环节
观众有机会向专家提问，更深入了解2024 WHO肺癌病理分类。 提问可以围绕分类标准、诊断流程、临床意义等方面。
其他罕见肺癌类型
间皮瘤

小细胞肺癌的的分子发病机制
小细胞肺癌是一种高度侵袭性的肺癌，主要由神经内分泌细胞组成，其分子发病机制尚不完全清楚，但已经有一些研究发现了一些可能的机制。

1. TP53突变：TP53是一种抑制肿瘤形成的关键基因，其突变
会导致细胞失去抑制肿瘤生长和扩散的能力，从而促进小细胞肺癌的发展。

2. RB1突变：RB1是另一个抑制肿瘤发生的基因，其突变也
与小细胞肺癌的发展相关。

RB1突变会导致失去其正常的抑
制作用，使肿瘤细胞能够不受控制地增殖和扩散。

3. MYC基因激活：MYC是一个重要的细胞生长和增殖调控因子，其过度表达或激活与小细胞肺癌的发展密切相关。

高表达的MYC可以促进细胞的增殖，阻止细胞死亡，并推动肿瘤的
进展。

4. PI3K/AKT/mTOR信号通路异常：PI3K/AKT/mTOR信号通
路参与细胞的生长、分化和存活调控，其异常激活与小细胞肺癌的发展相关。

该通路的异常激活可以促进细胞的增殖、抵抗细胞凋亡，并增加肿瘤血管生成。

小细胞肺癌的发病机制是一个复杂的过程，涉及多个分子信号通路的异常，包括TP53、RB1、MYC、PI3K/AKT/mTOR等。

更深入的研究可以揭示更多关于小细胞肺癌发病机制的细节，并为开发更有效的治疗策略提供新的思路。

邓俊亮等LncRNA TMPO-AS1通过调节miR-204-3p影响肺癌细胞的增殖、凋亡和侵袭第3期•319•doi：10.3969/j.issn.l000484X.2021.03.011LncRNA TMPO-AS1通过调节miR-204-3p影响肺癌细胞的增殖、凋亡和侵袭邓俊亮华美香①陈键腾（南方医科大学附属新会医院呼吸内科，江门529100）中图分类号R734.2文献标志码A文章编号1000-484X(2021)03-0319-07[摘要]目的:探究长链非编码RNA(lncRNA)TMPO-ASl通过调节miR-204-3p的表达对肺癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。

方法:实时荧光定量PCR(qPCR)检测人肺癌细胞系A549、H1975、H1299和H1650和人正常支气管上皮细胞系HBE 中TMPO-AS1的表达水平。

采用脂质体转染技术沉默A549细胞中TMPO-AS1,qPCR检测TMPO-AS1和miR-204-3p的表达情况，荧光素酶报告实验检测TMPO-AS1和miR-204-3p的靶向关系，噻唑蓝比色法(MTT)、流式细胞术和Transwell实验分别检测沉默TMPO-AS1对A549细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响,Western blot检测A549细胞中PCNA、Ki鄄67、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9.MMP-2和MMP-9的表达。

结果:人肺癌细胞系中TMPO-AS1的表达水平明显高于人正常支气管上皮细胞系(P<0.05)，且肺癌A549细胞中TMPO-AS1的基础表达量最高，选择A549细胞用于后续实验。

沉默TMPO-AS1可明显促进miR-204-3p的表达(P<0.05)，荧光素酶报告实验显示,TMPO-AS1能够降低miR-204-3p野生型细胞的相对荧光素酶活性(P< 0.05)o沉默TMPO-AS1能够明显抑制A549细胞增殖和侵袭能力(P<0.05),降低增殖相关蛋白PCNA.Ki-67及侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9的表达(P<0.05)；此外，沉默TMPO-AS1可促进A549细胞凋亡及Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表达(P<0.05)o结论:沉默TMPO-AS1能够通过靶向促进miR-204-3p的表达抑制肺癌细胞增殖和侵袭，并诱导细胞凋亡。

丁酸对人肺癌细胞的生长、细胞周期和形态的影响余立清;仇玉福【期刊名称】《第三军医大学学报》【年(卷),期】1991(13)1【摘要】运用鉴别细胞群体生物学特性的常规方法和流式细胞光度术(FCM),我们研究了正了酸对人肺癌细胞(PLA-801D)的某些生物学作用。

当培养液中含2或3mmol/L丁酸时,细胞分裂和增生受到明显抑制,群体倍增时间几乎延长1倍,细胞周期行进受阻,大多数细胞阻断在G1期,平皿集落形成率从23.9％降为1.9％,饱和密度从237.4万/ml降至48.8万/ml,细胞群体提前3d进入饱和状态。

与此同时,细胞变扁平,几乎丧失叠堆生长能力,表面膜活动减弱,核形趋于规则,染色质颗粒分散变稀疏,细胞间粘着连接明显增多。

以上发现提示丁酸可使PLA-801D肺癌细胞获得一些相对正常的生长特性和表型,显示丁酸对该细胞有一定程度的分化诱导作用和潜在的抗癌作用。

【总页数】6页(P5-10)【关键词】丁酸;肺肿瘤;细胞;生长;周期;形态【作者】余立清;仇玉福【作者单位】第三军医大学训练部病理教研室【正文语种】中文【中图分类】R969.4【相关文献】1.Aurora A反义寡核苷酸对人肺癌细胞系A549细胞生长与细胞周期的影响 [J], 伍钢;孟睿;答邦明;李贵玲;刘莉2.丁酸钠对Hep-2细胞生长、凋亡及细胞周期的影响 [J], 高岭;董明敏;程秀莲3.丁酸钠对结肠癌细胞生长曲线及细胞周期的影响 [J], 黄丽华;刘成霞;张孝卫;王兵;李铁军;张静;张尚忠4.丁酸钠联合X射线照射对肺癌A549细胞增殖的抑制作用及其对细胞周期的影响[J], 李官虎;郎庆旭;刘纯岩;刘沁;耿梦柔;李晓倩;王珍琦5.TNF-α对人肺癌细胞系的生长抑制作用和对细胞周期的影响 [J], 张海燕;马鸿儒;潘李珍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

耐顺铂人肺腺癌细胞系A549DDP的建立及耐药机制
蔡鹏;刘叙仪
【期刊名称】《中国肿瘤临床》
【年(卷),期】1995(022)008
【摘要】采用递增顺铂（ＤＤＰ）浓度的方法，体外连续培养建成一株耐ＤＤＰ
的人肺腺癌细胞系Ａ５４９ＤＤＰ，耐ＤＤＰ为亲代Ａ５４９的２４．４倍。

在无ＤＤＰ的培养基中培养５月余，其耐药性仍稳定。

Ａ５４９ＤＤＰ细胞内谷胱甘肽（ＧＳＨ）水平显著高于亲代细胞（Ｐ〈０．０１）。

ＢＳＯ耗竭细胞内ＧＳＨ后，Ａ５４９ＤＤＰ细胞对ＤＤＰ敏感性增加５倍，ＢＳＯ对亲代Ａ５４９细胞无增敏作用，Ａ５４９ＤＤＰ细胞ＧＳＴ酶同功酶ＧＳＴ－π
【总页数】6页(P582-587)
【作者】蔡鹏;刘叙仪
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】R730.21
【相关文献】
1.耐顺铂人肺腺癌细胞系A549DDP耐药机理进一步探讨 [J], 詹茂程;刘叙仪
2.5—氟脲嘧啶对耐顺铂人肺腺癌细胞A549DDP的程序依赖性逆转作用 [J], 詹
茂程;刘叙仪
3.5-氮杂-2'-脱氧胞苷联合SAHA对耐顺铂人肺腺癌细胞系A549/DDP的逆转作
用及其机制 [J], 李辉;段凤英
4.反应停对人肺腺癌亲代及耐顺铂细胞系碱性成纤维细胞生长因子表达影响 [J], 李西平;刘叙仪;王洁;王曾礼;蒋薇;张毅;刘元林
5.人参皂甙Rg3对耐顺铂人肺腺癌细胞系A_(549)^(DDP)逆转作用及其机理的研究 [J], 张伟;刘叙仪;王洁;蒋微;张毅;刘元林;王曾礼
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１９～１６ ７ ２ ４ 、１ １～１９ ２ ４～ ６ 、７ ２ ７氨基 酸 。 突变体 ７ 、３ ２ ０ ２ ０～ ８ ， 失去特异位点 的结合能力 和 Ｐ ３的球形构 象 ， ５ 导致一些 突变
体 与 热 体 克 蛋 白结 合 ； 些 突 变 引 起 ２３～２ ７肽 段 的暴 露 ； 一 １ １ 另 外 一 些 引 起 酸 性 激 活 结 构 域 的 改 变 ， 起 远 离 突 变 位 点 区 引 段 甚 至 整 个 蛋 白构 象 的 改 变 ， 而 引起 细胞 恶 性病 变 。 从 目前 认 为 ，５ Ｐ ３蛋 白 可 通 过 调 控 Ｃｐ 基 因表 达 而 调 控 细 ｉｔ 胞 生 长 ， Ｐ ３蛋 白 可 刺 激 Ｃｐ 基 因 产 生 分 子 量 为 ２ Ｋ 的 即 ５ ｉｔ １Ｄ 蛋 白 ， 而有 效 抑 制 细 胞 生 长 ， 外 ，５ 从 此 Ｐ ３的 抑 制 作 用 还 伴 随
相 似 的 ， ２ ｂ长 ， １ 约 ０Ｋ 由 １个外 显 子 和 １ ０个 内 含 子 组 成 。 除 １个 外 显 子 外 ， ４、、 、 别 编 码 ５个 高 度 保 守 的结 构 域 。 ２、 ５ ７ ８分 Ｐ ３基 因编 码 ３３个 氨 基 酸 蛋 白 ， 子 量 为 ５ Ｋ ５ ９ 分 ３ Ｄ。 Ｐ３蛋 白 ５ Ｎ端 为 １一 ０位 氨 基 酸 残 基 的酸 性 区 ， 一 ８ Ｃ端 为 ３ ９～３ ３位 氨 １ ９
度 （ Ｖ 在非小 细胞 肺癌 （ Ｓ Ｌ ） 用 时 ， Ｍ Ｄ） Ｎ ＣＣ 作 发现 Ｎ Ｃ Ｃ组 ＳＬ
织 中 Ｃ Ｘ２表 达 阳性 率 ６ ． ％ ， Ｏ 一 １５ 与年 龄 、 别 无 显 著 性 差 异 ， 性 但 与 吸烟 史 有 密切 关 系 。Ｐ Ｎ 的 阳性 表 达 与 Ｎ Ｃ Ｃ的预 后 ＣＡ ＳＬ 密 切 相 关 ， 究 结 果 表 明 ， Ｓ Ｌ 中 Ｃ Ｘ ２阳 性 表 达 强 度 与 研 ＮＣＣ Ｏ一 Ｐ Ｎ 表 达 强度 之 间 存 在 显 著 差 异 ， 示 了 Ｃ Ｘ ２通 过 刺 激 ＣＡ 提 Ｏ 一 肿 瘤 细胞 增 殖 促 进 Ｎ Ｃ Ｃ的发 生 和发 展 。Ｖ Ｇ ＳＬ Ｅ Ｆ是 血 管 生 成 过程 中重 要 的 调 控 因 子 ， 肿 瘤 的 生 长 、 移 和 预 后 有 关 ， 与 转

FTY720对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响的开题报告【摘要】非小细胞肺癌(NCSLC)是最常见的肺癌类型之一，对于其治疗一直存在挑战。

FTY720是一种免疫抑制剂，目前已经被广泛研究其在多种肿瘤细胞中的抗肿瘤作用。

本文研究了FTY720对NCSLC细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。

实验结果表明：FTY720可以抑制NCSLC细胞的增殖，增加NCSLC细胞的凋亡，同时诱导NCSLC细胞进入G0/G1期和G2/M期，并抑制细胞进入S期，从而减少其DNA的合成。

该研究的结果表明FTY720是一种有前途的治疗NCSLC的药物。

【关键词】FTY720；非小细胞肺癌；增殖；凋亡；细胞周期【正文】一、研究背景非小细胞肺癌是恶性肿瘤的一种，是最常见的肺癌类型之一，治疗一直存在难点。

当前，针对非小细胞肺癌的治疗方式主要包括手术切除、放疗和化疗等。

但是，这些治疗方法的效果、预后均较不理想。

因此，更有细胞学定位、更有效、副作用较小的新型治疗法成为当前研究的热点。

FTY720是一种新型免疫抑制剂，目前被广泛研究其在多种肿瘤中的抗肿瘤作用，包括乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等。

研究表明，FTY720能够通过多种途径发挥抗肿瘤作用，如抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡等。

二、研究目的本文旨在研究FTY720对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响，以期为探索治疗非小细胞肺癌的新方法提供实验依据。

三、材料和方法1. 细胞培养：使用H460非小细胞肺癌细胞系，培养于含有10% FBS的DMEM培养基中。

2. 细胞毒性实验：采用CCK8法检测FTY720对H460细胞增殖的影响3. 细胞凋亡实验：通过流式细胞术检测FTY720对H460细胞凋亡的影响4. 细胞周期实验：使用PI染色法检测FTY720对H460细胞周期的影响3. 数据分析：使用GraphPad Prism软件处理实验数据进行统计学分析。

四、预期结果预期结果是FTY720可以抑制H460非小细胞肺癌细胞的生长，并促进其进入细胞凋亡过程。

《中国癌症杂志》2019年第29卷第11期 CHINA ONCOLOGY 2019 Vol.29 No.11855欢迎关注本刊公众号·论　著·基金项目：国家自然科学基金（8177100416）。

通信作者：郑翠侠 E-mail: zcx9566@利用CRISPR/Cas9系统对人A549肺癌细胞NRF 2基因的稳定敲除及其功能研究龚美玲，张琳琳，郑翠侠同济大学附属杨浦医院呼吸内科，上海200090［摘要］ 背景与目的：CNC-bZIP 是核转录因子E2相关因子2［nuclear factor （erythroid-derived 2）-like 2，NRF2］近羧基端一个亮氨酸拉链结构，该区域是DNA 结合以及NRF2与小分子肌腱纤维肉瘤（small masculoaponeurotic fibrosarcoma ，sMaf ）蛋白结合形成二聚体所必需的区域，随后该区域与抗氧化反应元件（antioxidant response element ，ARE ）结合，激活NRF2下游靶基因的转录表达，从而增加细胞抗氧化应激能力。

构建CRISPR/Cas9慢病毒系统，获得了A549细胞中NRF 2基因稳定敲除株并进行了功能研究。

方法：针对该结构上下游设计一对sgRNA ，与pLenti CRISPR v2载体连接，通过包装慢病毒的方式构建A549稳定敲除细胞系。

根据测序图谱及蛋白质印迹法（Western blot ）验证敲除效果。

然后通过实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction ，RTFQ-PCR ）、Western blot 检测、克隆形成实验、细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）、划痕实验、Transwell 实验比较A549细胞株NRF 2敲除与不敲除的功能表达。

肺癌干细胞的分选
肺癌干细胞的分选主要采用两种方法：一种是应用细胞表面特异性标记进行 分选，另一种是根据SP表型进行肿瘤干细胞的分选。Kim等[9] [10]应用流式 细胞仪分选支气管肺泡干细胞，首先准备新鲜的肺单个细胞，然后用细胞裂 解液去除红细胞，CD45+ 细胞代表造血干细胞，Pecam+ 细胞代表内皮细胞， 去除这两类细胞，选Sca-1+ 细胞，去除CD34- 的细胞群，得到Sca1+/CD45- /Pecam- /CD34+的支气管干细胞群。细胞表面标志物是分选肺癌 肿瘤干细胞的关键，腺癌肿瘤干细胞亦存在与BASCs相似的表面标志物，如 CD34+ 等。如董强刚等即是采用FACS对A549和SPC-A肺腺癌细胞株进行了 TSC的研究[11]。结果在A549和SPC-A肺腺癌细胞株中发现一个新颖的癌细 胞亚群，其表型特征为CD24 IGF—IR ，具有高侵袭性和高致瘤性并具有自 CD24 主生长特性，能够在无血清条件下长期培养，认为其是肺腺癌干细胞。人们 发现造血干细胞具有将荧光染料泵出细胞外的特性，即SP特性[12]。目前利 用这一特性进行纯化成为一种常用的分离方法。Maria等[13]应用FACS和 DNA染料Hoechst33342，从肺癌细胞系(H460，H23，HTB-58，A549， H441，H2170)中分离出占细胞总数1/1000-1/5000的SP细胞，体外培养可形 成新的SP和non-SP细胞群，将H441、H460、A549的SP接种NOD /SCID小 鼠，可观察到其SP的成瘤能力分别是non-SP的10倍、15倍和50倍。研究结 果还表明：(1)所有6种肺癌细胞系中SP的ABCG2均明显增高;(2)SP比non-SP 具有更强的多药耐药性;(3)SP细胞均处于细胞周期的静止期(G0);(4)SP中端粒 末端转移酶水平显著高于non-SP。以上结果表明，SP细胞群中富含肿瘤干细 胞。但目前尚未明确分离出肿瘤干细胞，此方面还需进一步研究。

２０１　２年６月第１　９卷第６期　中国中医药信息杂志　・４　３　加味四君固本汤与Ｉ　ｒｅ　ｓ　ｓ　ａ联合　抑制肺癌细胞增殖的实验研究　肖烈钢，何本夫，朱成全　中国人民解放军第４２１医院中西医结合科，广东广州５１０３１８　摘要：目的探讨自拟加味四君固本汤含药血清与表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）靶向治疗药物Ｉｒｅｓ　ｓａ联用对人非小　细胞肺癌细胞系Ａ５４９及ＨＣＣ８２７增殖的抑制作用。方法　大鼠灌胃制备高、中、低剂量加味四君固本汤含药血清，　采用ＭＴＴ法检测加味四君固本汤含药血清单用以及联合Ｉｒｅｓｓａ使用对人非小细胞肺癌细胞系Ａ５４９和ＨＣＣ８２７增殖的影　响。结果Ｉｒｅｓ　ｓａ抑制Ａ５４９和ＨＣＣ８２７细胞增殖的半数抑制浓度（ＩＣｓｏ）分别为４６．１８　ｐｍｏ１／Ｌ和６１．９９　ｌａｍｏｌ／Ｌ（尸＜０．０５）；　加味四君固本汤含药血清作用于肺癌细胞后，随着舍药血清浓度的逐渐增加，抑制率逐渐增高（尸＜０．０５）；加味四君　固本汤含药血清与Ｉ１－ｅｓｓａ联用加强了对Ａ５４９和ＨＣＣ８２７细胞增殖抑制作用（尸＜０．０５）。结论加味四君固本汤含药　血清具有一定的抗肺癌作用，并存在一定的量效关系，联合Ｉ　ｒｅｓｓａ使用可协同抑制Ａ５４９和ＨＣＣ８２７细胞增殖　关键词：加味四君固本汤；Ｉｒｅｓ　ｓａ；人非小细胞肺癌；增殖；大鼠　Ｄ０Ｉ：１　０．３９６９／ｊ．ｉ　Ｓ　ｓｎ．１　００５—５　３０４．２０１２．Ｏ６．０１６　中图分类号：Ｒ２８５．５　文献标识码：Ａ　文章编号：１００５—５３０４（２０１２）０６　００４３—０３　

Ｊｉａｗｅｉ　Ｓｉｊｕｎ　Ｇｕｂｅｎ　Ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｉｒｅｓｓａ　ｏｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｏｎ—ｓｍａｌｌ—ｃｅｌｌ　Ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ＸＩＡＯ　Ｌｉｅ—ｇａｎｇ，ＨＥ　Ｂｅｎ—ｆｕ，ＺＨＵ　Ｃｈｅｎｇ—ｑｕａｎ　ｒＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．ＰＬＡ　４２１　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０３１８　Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｓｅｌｆ－ｍａｄｅ　Ｊｉａｗｅｉ　ｓｉｊｔｍ　Ｇｕｂｅｎ　Ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｉｒｅｓｓａ　ｏｎ　ｎｏｎ—ｓｍａｌｌ—ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｆｉｎｅｓ　Ａ５４９　ａｎｄ　ＨＣＣ８２７．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｇｉｖｅｎ　ｈｉｇｈ，ｍｅｄｉｕｍ　ａｎｄ　ｌｏｗ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｊｉａｗｅｉ　Ｓｉｊｕｎ　Ｇｕｂｅｎ　Ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ　ｂＹ　ｇａｖａｇｅ　ｔｏ　ｐｒｅｐａｒｅ　ｄｒｕｇ—ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｓｅｒｕｍ．ＭＴＴ　ａｓｓａｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｏｎ—ｓｍａｌｌ—ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｆｉｎｅｓ　（Ａ５４９　ａｎｄ　ＨＣＣ８２７１　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｒｕｇ—ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｓｅｒｕｌＴｌ　ｉｎ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｉｒｅｓｓａ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ＩＣｓｏ　ｏｆ　Ｉｒｅｓｓａ　ｏｎ　Ａ５４９　ａｎｄ　ＨＣＣ８２７　ｃｅｌｌ　ｆｉｎｅｓ　ｗａｓ　４６．１８　ｐｍｏｌ／Ｌ　ａｎｄ　６　１．９９￣ｍｏｌ／Ｌ．Ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　Ａ５４９　ａｎｄ　ＨＣＣ８２７　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｏｆ　ｄｒｕｇ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｓｅｒｕｍ　ｆＰ＜０．０５）．　Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ　ａｐｐｅａｒｅｄ　ｗｈｅｎ　ｄｒｕｇ—ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｓｅｒｕｍ　ｉｎ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｉｒｅｓｓａ（Ｐ＜Ｏ．０５）．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｊｉａｗｅｉ　Ｓｉｊｕｎ　Ｇｕｂｅｎ　Ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ　ｄｒｕｇ—ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｓｅｒｕｌＴｌ　ｃａｒｌ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｏｎ—ｓｍａｌｌ—ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｌｉｎｅｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｍａｎｎｅｒ　ｏｆ　ｄｏｓｅ—ｅｆｆｅｃｔ．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｗｅｒｅ　ｆｏｕｎｄ　ｗｈｅｎ　ｄｒｕｇ—ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｓｅｒｕｍ　ｉｎ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｉｒｅｓｓａ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｊｉａｗｅｉ　ｓｉｉｕｎ　Ｇｕｂｅｎ　Ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ：Ｉｒｅｓｓａ；ｎｏｎ—ｓｍａｌｌ—ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ｒａｔｓ　我们在前期研究中发现，加味四君固本汤配合化疗在治疗　中晚期肺癌和乳腺癌中表现出较好的疗效　。因此，本实验在　细胞水平上研究加味四君固本汤以及联合针对表皮生长因子　受体（ＥＧＦＲ）的靶向治疗药物Ｉｒｅｓｓａ对非小细胞肺癌细胞系增　殖的抑制作用，为加味四君固本汤在临床应用提供实验依据。　１　实验材料　１．１细胞株及动物　人非小细胞肺癌细胞株Ａ５４９和ＨＣＣ８２７分别购于中国科学　院上海生命科学研究院细胞资源中心，广州朗日生物技术有限　公司提供；健康ｓＤ大鼠４０只，雄性，体质量约２５０　ｇ，购于南　方医科大学实验动物中心，许可证号：ＳＣＸＫ（粤）２００６—００１５。　基金项目：全军医学科学技术研究“十一五”计划课题　（０６ＭＡ１２４）　通讯作者：朱成全，Ｅ－ｍａｉ１：ｚｃｑｄｊｐ国ｓｉｎａ．ｃｏｍ　１．２主要试剂及仪器　ＦＢＳ、ＲＰＭＩ１６４０培养基均为ＧＩＢＣＯ产品；Ｉｒｅｓｓａ为　ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ公司产品；胰蛋白酶、二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）、噻唑　蓝（ＭＴＴ）购于ＳＩＧＭＡ公司；超净工作台（Ａｉｒ　Ｔｅｃｈ）；ＣＯ　恒温培　养箱（Ｔｈｅｒｍｏ）；　酶标仪（ＢＩＯ—ＲＡＤ）；加味四君固本汤药物购于　南方医科大学南方医院。　２实验方法　２．１细胞培养　Ａ５４９和ＨＣＣ８２７均培养于含ＩＯ％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ１６４０培养基中，　置于３７℃、饱和湿度、含体积分数５％Ｃ０　的培养箱中。定期　换液，倒置相差显微镜下观察，待细胞接近长满培养瓶底时，用　０．２５％胰蛋白酶消化传代。　２．２药物制备　自拟加味四君固本汤由人参、白术、茯苓、炙甘草、黄苠、　仙鹤草、白花蛇舌草、薏苡仁、山药、鸡血藤、三七粉、补骨　４４・　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｎ　ＴＣＭ　Ｊｕｎ．２０１２　ＶＯ１．１９　Ｎｏ．６　脂组成，将上述中药饮片置砂锅内，加冷水浸泡ｌ　ｈ，煎煮榨渣取　汁，过滤浓缩，用蒸馏水稀释成含原药材０．３０、０．１０、０．０３　ｇ／ｍＬ　的药液。根据“动物与人体的每公斤体质量剂量折算系数表”　，　大鼠与人每公斤体质量剂量折算系数为０．１６，本实验具体剂量：　人鼠用药量［ｇ／（ｋｇ・ｄ）］＝人日用剂量［ｇ／（ｋｇ・ｄ）］Ｘ０．１６。加　味四君固本汤剂量标准为０．４　ｇ／（ｋｇ・ｄ），中剂量：为上述标准　剂量，高剂量为标准剂量的３倍，低剂量为标准剂量的１／３倍。　２．３加味四君固本汤含药血清的制备　ｓＤ大鼠随机分为空白对照组及加味四君固本汤高、中、　低剂量组，每组１Ｏ只。给药前禁食１２　ｈ。各组大鼠于每日早、　晚各灌胃给药１次，每次４　ｍＬ／ｋｇ，连续灌胃３　ｄ，末次给药２　ｈ　后按通法制备含药血清　。５６℃水浴中灭活３０　ｍｉｎ，用０．２２　ｐｍ　滤膜过滤除菌，一２Ｏ℃保存备用。　２．４　Ｉ　ｒｅｓ　ｓａ和加味四君固本汤含药血清处理细胞　消化收集对数生长期细胞以２×１０。／孔种于９６孑Ｌ板中。置　ｃ０　恒温培养箱继续培养２４　ｈ后，去掉孔内旧培养基，分别加入　含小同剂量的加味四君固本汤含药血清以及含不同浓度　１ｒｅｓｓａ（０、５、ｌ０、２０、４Ｏ、８Ｏ　ｌａｍｏｌ／Ｌ）的ＲＰＭＩ１６４０条件培　养基，每孔体积２００　ｐＬ，每一浓度设３个复孑Ｌ，以单纯培养基为　卒白孔调零，加入药物后继续培养４８　ｈ。　２．５　ＭＴＴ比色试验　药物刺激细胞４８　ｈ后每孔加入浓度为５　ｍｇ／ｍＬ的ＭＴＴ溶　液２０　Ｌ，３７℃继续孵育４　ｈ后吸净孔内液体，每孔加入１５０　Ｌ　ＤＭＳＯ，至微量振荡器上震荡１０　ｍｉｎ，使结晶充分溶解。置酶标　仪上检测４９０　Ｆ！ｍ处吸光度值（Ａ值）。根据公式计算细胞生长　抑制率：细胞生长抑制率（％）＝（Ａ　Ｊｌｌｉ　－－Ａ　验组）／Ａ　偶组×１００％。　３统计学方法　实验数值采用ＳＰＳＳ１０．０统计软件分析，数据用　ｓ表示，两　样本均数比较采用ｔ检验。以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。　４结果　４．１　Ｉ　ｒｅＳ　Ｓａ对Ａ５４９和ＨＣＣ８２７细胞增殖的影响　ＭＴＴ检测数据显示，Ｉｒｅｓｓａ单药对人ｔＨ，细胞肺癌细胞系　Ａ５４９和ＨＣＣ８２７均有明显的增殖抑制作用（Ｐ＜０．００５），这种作　＿｝｝ｊ呈剂量依赖性（见图１）。Ｉｒｅｓｓａ抑制Ａ５４９和ＨＣＣ８２７细胞增　殖的Ｉｃ　。值分别为４６．１８　ｐｍｏｌ／Ｌ和６１．９９￣ｍｏｌ／Ｌ。　７Ｏ　６０　５０　《　墼　。　藁：３０　２０　１０　Ｏ　Ｉｒｅｓｓａ／ｐｍｏｌ　Ｉ　‘　图１　Ｉ　ｒｅｓｓａ对Ａ５４９及ＨＣＣ８２７细胞增殖抑制作用比较　４．２　加味四君固本汤含药血清对Ａ５４９和ＨＣＣ８２７的影响　加味四君固本汤作用于Ａ５４９和ＨＣＣ８２７后，随着含药血清　浓度的逐渐增加，抑制率逐渐增高（见图２），上述结果提示，加　味四君固本汤含药血清对Ａ５４９和ＨＣＣ８２７细胞的增殖均具有明　显的抑制作用（Ｐ＜０．００５），并有随着含药浓度增加而作用更　明显的趋势，呈现出一定的量效关系。　

人肺癌相关成纤维细胞永生化
人肺癌相关成纤维细胞的永生化是指在体外培养条件下，肺癌组织来源的成纤维细胞经过一系列基因改造或处理，使其具有无限增殖能力和长寿命的特性。

在正常的细胞生长中，细胞有一定的增殖次数，当达到执行信号时，细胞会进入细胞凋亡或细胞老化的过程。

然而，肺癌细胞常常失去了自我调控的能力，使得其能够无限增殖并逃脱凋亡的过程。

这种现象被称为细胞永生化。

为了实现肺癌相关成纤维细胞的永生化，研究人员通常采用以下方法：
1. 过表达促进细胞增殖的基因：研究人员可能会将促进细胞增殖的基因如TERT等转染至成纤维细胞中，来增加其增殖的能力。

2. 抑制细胞凋亡相关的基因：研究人员可能会通过抑制细胞凋亡相关的基因，如p53、BAX等，来阻止细胞凋亡的发生，从而延长细胞寿命。

3. 体外培养条件的优化：研究人员可能会优化细胞培养基的配方，例如添加适当的生长因子和细胞因子，以提供细胞增殖所需的营养和信号。

使用这些方法能够永生化肺癌相关的成纤维细胞，有助于深入研究肺癌的发生机制、细胞增殖和凋亡的调控机制，以及新的
治疗策略的开发。

然而，需要注意的是，这些方法在实际应用中存在伦理和安全性的问题，需要严格的监管和控制。

Ｈ ａ ｒ ｂ ｉ ｎ １ ５ ０ ０ ８ １ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｓ ｃ ａ ｎ ｔ ｈ ｅ ｇ ｅ ｎ ｏ ｍ ｅ ｓ ｏ ｆ Ａ ｎ ｉ ｐ ９ ７ ３ ａ ｎ ｄ Ａ Ｇ Ｚ Ｙ ８ ３ 一 ａ ｔ ｗ ｏ ｃ ｅ ｌ ｌ ｌ ｉ ｎ ｅ ｓ ｉ ｎ ｏ ｒ ｄ ｅ ｒ
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Ｔｈ ｅ ｇ ｅ ｎｏ ｍｉ ｃ ＣＮＶ ｐ ｒ ｏ ｉｌ ｆ ｅ ｓ ｉ ｎ ｔ ｗｏ ａ ｃ ｅ ｌ ｌ ｌ ｉ ｎｅ ｓ ｗｉ ｔ ｈ
ｓ ａ ｍｅ ｐａ ｒ ｅ ｎ ｔ ａ ｌ ｏ ｒ ｉ ｇ ｉ ｎ ｂ ｕｔ ｄ ｉ ｆｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ｍｅ ｔ ａ ｓ ｔ ａ ｓ ｉ ｓ ｐｏ ｔ ｅ ｎ ｔ ｉ ａ ｌ ｓ
制相关。
细胞 系中的这些 纯合子缺 失基 因可能与肿 瘤形成机
［ 关键词 ］ 微 阵列 对照基 因组杂交 ； 拷贝数变异 ； 肺癌 ； Ａ ｎ ｉ ｐ ９ ７ ３ ； Ａ Ｇ Ｚ Ｙ ８ ３ － ａ ［ 中图分类号 ］ Ｒ ７ ３ ４ ． ２ ； Ｑ ７ ５ ５ ［ 文献标识码 ］ Ａ ［ 文章编号 ］ １ ０ ０ ０—１ ９ ０ ５ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ｌ一 ０ ０ １ ０一 ｏ ４

㊃论著㊃D O I :10.3760/c m a .j.i s s n .1673-436X.2014.16.003作者单位:316000舟山医院定海院区内科T r o p -2在肺腺癌组织和细胞系中的表达及临床病理分析贝金币ʌ摘要ɔ 目的 研究滋养层细胞表面抗原-2(T r o p -2)在肺腺癌组织和细胞系中的表达及其临床病理意义㊂方法 R T -P C R 检测9例肺腺癌组织和20例癌旁组织中T r o p -2m R N A 的表达,免疫荧光检测人肺腺癌细胞系中T r o p -2蛋白表达㊂分析T r o p -2的表达同临床病理特征之间的相关性㊂结果 在不同人肺腺癌细胞系中T r o p -2表达的阳性率不同,于正常人支气管上皮细胞系中无表达㊂T r o p -2m R N A 在肺腺癌细胞系中有表达,T r o p -2蛋白表达主要在肺腺癌细胞膜上;T r o p -2在人肺腺癌组织中的阳性率显著高于癌旁组织;阳性表达程度随癌组织分化程度的降低而增高(P <0.05);T r o p -2的表达同患者年龄㊁性别不相关(P >0.05)㊂结论 T r o p -2在肺癌组织和肺癌细胞系中高表达,可作为检测人肺腺癌恶性程度的标记物㊂ʌ关键词ɔ 肺腺癌;滋养层细胞表面抗原-2;细胞株;细胞系;恶性肿瘤C l i n i c a l p a t h o l o g i c a l a n a l y s i s a n d e x p r e s s i o no f T r o p -2i nh u m a n p u l m o n a r y a d e n o c a r c i n o m a a n d c e l l l i n e s B e i J i n b i .D e p a r t m e n t o f I n t e r n a lM e d i c i n e ,D i n g h a i B r a n c ho f Z h o u s h a n H o s pi t a l ,Z h o u s h a n 316000,C h i n aʌA b s t r a c t ɔ O b je c t i v e T o s t u d y t h ee x p r e s s i o n a n d c l i n i c o p a t h o l o g i c a ls i g n if i c a n c e o fh u m a n t r o p h o b l a s t c e l l -s u r f a c e a n t ig e n -2(T r o p -2)i nh u m a n l u n g a d e n o c a r c i n o m a t i s s u e a n d c e l l l i n e .M e t h o d s T h e e x p r e s s i o no fT r o p -2m R N Ai nn i n ec a s e so f l u n g a d e n o c a r c i n o m at i s s u e sa n dt i s s u e sa d j a c e n t t o c a r c i n o m aw a sd e t e c t e db y R T -P C R.T h e p r o t e i ne x p r e s s i o no fT r o p -2i nh u m a nl u n g a d e n o c a r c i n o m a c e l l sw a s d e t e c t e d t h r o u g h i mm u n o f l u o r e s c e n c e .T h e c o r r e l a t i o nb e t w e e n t h e e x p r e s s i o n o fT r o p -2a n d t h e c l i n i c a l p a t h o l o g i c a l f e a t u r e sw a s a n a l y z e d .R e s u l t s T h e p o s i t i v e r a t eo fT r o p -2e x p r e s s i o nw a sd i f f e r e n t i nd i f f e r e n th u m a nl u n g a d e n o c a r c i n o m ac e l l s ,t h e r e w a s n o e x p r e s s i o ni n n o r m a lh u m a n b r o n c h i a l e p i t h e l i a l c e l l l i n e .T r o p -2m R N A w a s e x p r e s s e d i n l u n g a d e n o c a r c i n o m a c e l l s a n d t h e p r o t e i ne x p r e s s i o n o fT r o p -2w a sm a i n l y l o c a t e d i n t h em e m b r a n e o f l u n g a d e n o c a r c i n o m a c e l l s .T h e p o s i t i v e r a t e o f T r o p -2i n t h et i s s u e o f h u m a nl u n g a d e n o c a r c i n o m a w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a n t h a ti n t i s s u e a d ja c e n tt o c a r c i n o m a .T h e p o s i t i v e e x p r e s s i o n l e v e li n c r e a s e d a l o n g w i t h t h e r e d u c i n g of c a r c i n o m a t i s s u e d i f f e r e n t i a t i o nd eg r e e (P <0.05).Th ee x p r e s si o no fT r o p -2w a sn o ta s s o c i a t e d w i t ha g ea n ds e xo f p a t i e n t s (P >0.05).C o n c l u s i o n s T r o p -2i sh i g h l y e x p r e s s e di nl u n g a d e n o c a r c i n o m at i s s u ea n dc e l l l i n e s ,w h i c hc a nb eu s e da s am a r k e r f o r d e t e c t i o no fm a l i g n a n t d e g r e e o f h u m a n l u n g ad e n o c a r c i n o m a .ʌK e y w o r d s ɔ L u n g a d e n o c a r c i n o m a ;T r o p -2;C e l l s t r a i n ;C e l l l i n e s ;M a l i g n a n t t u m o r 肺腺癌是人类高发恶性肿瘤,发病机制复杂㊂近年来发现人滋养层细胞表面抗原-2(t r o ph o b l a s t c e l l -s u r f a c e a n t i g e n s 2,T r o p -2)广泛存在于各类肿瘤细胞中,认为其是肿瘤相关抗原㊂T r o p 也称为T A C S T D 2㊁G A 733-1㊁E G P -1,它是G A 733中的一类,来自于孕期滋养层上皮㊂它是一种单层跨膜表面糖蛋白,是细胞膜钙离子通道蛋白,对钙离子浓度起调控作用,另外T r o p -2同细胞周期蛋白及磷酸激酶有关,可调节肿瘤细胞生长,具有促进肿瘤转移的作用㊂国内有关于T r o p -2同胰腺癌关系的类似文献,但同肺腺癌关系的文献罕见,我们采用R T -P C R ㊁免疫组化㊁免疫荧光技术通过检测T r o p -2在人肺腺癌细胞㊁组织及正常细胞中的表达,探讨其病理特征和预后的关系㊂1 资料与方法1.1 材料 人肺腺癌细胞系S P C A -1㊁P C -9㊁H 1975购自中国科学院㊂正常支气管上皮细胞株H B E 购自A T C C ㊂R T -P C R 试剂盒购自日本T a k a R a 公司,免疫组化S P 试剂盒购自福州迈新生物科技有限公司㊂化学核D A P I 购自日本D o j i n d o 公司㊂羊抗人T r o p -2多克隆抗体购自德国R&D ,驴抗羊抗体购自美国S i g m a 公司,T r i z i o l 试剂购自美国I n v i t r o ge n 公司㊂流式细胞仪为美国B e c k m a n c o u l t e r 公司的E P I C S A L T R A ㊂人肺腺癌组织来自我院2012年5月至2013年11月普外科手术的9例肺腺癌患者,肺腺癌癌旁组织来源于我院同期手术切除的20例病例㊂所有标本的病理资料完整,术前未行放疗化疗㊂注:A :H B E ;B :H 1975;C :S P C A -1;D :P C -9图1 流式细胞仪检测人肺腺癌细胞中T r o p -2的表达1.2 人肺腺癌组织中T r o p -2的R T -P C R 检测 引物设计按照G e n B a n k 提供的序列号NM -002353的T r o p -2m R N A 序列编号,用P r i m e r p r e m i e r 5.0软件设计,O l i g o 6.0筛选评价,引物合成由I n v i t r o g e n 公司完成㊂T r i z o l 法提取9例肺腺癌组织中R N A ,溶解于D E P C 处理后的无R N A 酶水中保存,进行逆转录P C R 扩增,按照试剂盒操作进行㊂1.3 人肺腺癌细胞表面T r o p -2表达 间接免疫荧光流式细胞术检测,单细胞悬浮液中加入一抗,完毕后洗掉未结合抗体,再加入荧光标记的二抗㊂同时设置阴性对照,另设同型对照㊂流式细胞仪检测正常人体支气管上皮细胞株H B E 及3类肺腺癌细胞系中T r o p -2表达㊂1.4 免疫荧光检测 将肺腺癌细胞培养于细胞培养室,固定后封闭保存于室温㊂加入羊抗人抗体一抗,孵育1h ,加入标记后的羊I g G 抗体二抗,孵育1h ,D A P I 复染,P B S 代替一抗作为阴性对照㊂荧光显微镜镜检㊂1.5 免疫组化分析 免疫组化染色采用S P ,以自身对照作为阳性对照,以P B S 代替一抗作为阴性对照㊂1.6 肿瘤细胞表达判定方法 显微镜下观察染色阳性肿瘤细胞数和染色强度㊂肿瘤细胞数占所有细胞数目的百分比:阴性0分,阳性细胞数1%~10%1分,>10%且ɤ50%2分,>50%3分㊂染色强度:无着色0分,黄色1分,浅棕色2分,棕褐色3分㊂两项合计分数为表达程度㊂1分阴性,2~3分(+),4~6分(++),4分以上高表达㊂1.7 统计学方法 采用S P S S15.0统计学软件进行数据分析,计量资料以x -ʃs 表示,计数资料以百分数表示,组间比较使用χ2检验,P <0.05为差异有统计学意义㊂2 结果2.1 流式细胞仪检测人肺腺癌细胞中T r o p -2的表达 人肺腺癌细胞株中T r o p -2的表达不同,H 1975阳性率为43.2%ʃ3.4%,S P C A -1阳性率为92.5%ʃ4.3%,P C -9阳性率为95.3%ʃ2.4%,在正常人支气管上皮细胞系中无表达㊂具体见图1㊂2.2 R T -P C R 检测人肺腺癌组织中T r o p -2的表达 9例肺腺癌组织中检测到T r o p -2m R N A ,8例出现预期大小的T r o p -2c D N A 片段,片段长度764b p(图2),1例未见条带,阳性率为88.9%㊂癌旁5c m 肺组织未见条带,2c m 见弱条带㊂注:M :D N A 标准提取物;1:阴性对照;2~9:肺腺癌组织图2 人肺腺癌组织中T r o p -2的R T -P C R 扩增2.3 T r o p -2蛋白的表达定位 T r o p -2在正常肺组织细胞中基本无表达,T r o p -2阳性表达主要位于人肺腺癌细胞膜上,表达率达83.2%(图3)㊂2.4 肺腺癌中T r o p -2的表达同临床病理特征的关系 根据免疫组化分析结果显示,在肺腺癌组织中注:A :正常支气管上皮细胞 S P ˑ100;B :肺腺癌癌旁组织T r o p -2阳性表达 S P ˑ400;C :肺腺癌组织T r o p -2阳性表达 免疫荧光 ˑ400图3 肺腺癌组织T r o p -2蛋白表达T r o p -2表达同年龄㊁性别不相关,但同癌症分化程度呈明显负相关(r =-3.120,P <0.01)㊂3 讨论自1981年,L i p i n s k i 等使用单克隆抗体研究人体癌变的滋养层细胞时便开始对T r o p 家族进行了认识[1],他们在滋养层细胞上发现了4种癌症表面抗原,便将其分别命名为T r o p -1㊁2㊁3㊁4㊂T r o p -1㊁2均在人体细胞合体滋养层及复层上皮细胞特异表达,正常人体细胞T r o p -1㊁2表达少或不表达㊂T r o p -2是单体跨膜蛋白,相对分子质量为35000,由323个氨基酸构成㊂有学者[2]在40多种人体肿瘤中测定T r o p -2抗原发现含有T r o p -2的肿瘤达到89%㊂T r e r o t o l a 等[3]将直径<2c m 的肺腺癌进行T r o p -2的检测,发现它是预测肺腺癌预后的独立相关因子,同时进一步研究发现T r o p -2在正常肺组织中不表达,肿瘤分化程度越低,表达越高,同本文研究结论一致㊂瞿彩兴等[4]研究发现T r o p -2在肺腺癌细胞中呈现高表达者容易转移复发,生存期短,预后差㊂本文研究结果发现T r o p -2在肺癌中心高表达,显著高于癌旁组织中的表达,同肿瘤的分化程度呈明显负相关,和年龄㊁性别无关㊂故可以使用T r o p -2表达的高低来协助诊断预后㊂阅读2013年前关于T r o p -2的相关文献,均有T r o p -2在多种消化系统㊁生殖系统的恶性肿瘤发生发展及预后的报道,表明T r o p -2与之具有较高的相关性[5]㊂M a i r e 等[6]的研究中发现,通过使用小干扰R N A 下调T r o p -2基因表达,可降低胃癌细胞黏附㊁迁移和瘤体侵袭能力㊂V a r u gh e s e 等[7]使用了K a p l a n -m e t e r 生存分析发现非替代性生长型T r o p -2阳性患者的生存率显著高于T r o p -2阴性患者㊂但在另一组[8]关于T r o p -2的研究中发现T r o p -2的表达提示肺腺癌患者具有更好的预后,这种差异的原因并不清楚,可能同纳入不同肿瘤分期患者有关,或者同术后治疗方式有关㊂本研究结果表明不同人肺腺癌细胞系中T r o p -2表达的阳性率不同,于正常人支气管上皮细胞系中无表达㊂T r o p -2m R N A 在肺腺癌细胞系中有表达,T r o p -2蛋白表达主要在肺腺癌细胞膜上;T r o p -2在人肺腺癌组织中的阳性率显著高于癌旁正常组织和良性病变;进一步研究表明阳性表达程度随癌组织分化程度的减低而增高,说明了T r o p -2在肺腺癌发生发展中的重要作用且可以作为评估肿瘤侵袭的标志,同时T r o p -2可能成为今后基因治疗肺腺癌的靶点㊂参 考 文 献[1] 詹洪峰,周永静,张焱,等.R N A 干扰下调肿瘤相关钙信号传导蛋白-2基因表达对胃癌细胞黏附㊁迁移和侵袭的影响[J ].中华实验外科杂志,2010,27:1272-1274.[2] B i g n o t t i E ,R a v a g g i A ,R o m a n i C ,e t a l .T r o p -2o v e r e x pr e s s i o n i n p o o r l yd i f fe r e n t i a t e de n d o m e t r i a le n d o m e t r i o i d c a r c i n o m a :i m p l i c a t i o n sf o r i mm u n o t h e r a p y w i t hh R S 7,a h u m a n i z e d a n t i -t r o p -2m o n o c l o n a l a n t i b o d y [J ].I n t JG yn e c o l C a n c e r ,2011,21:1613-1621.[3] T r e r o t o l aM ,C a n t a n e l l iP ,G u e r r aE ,e ta l .U p r e gu l a t i o no f T r o p -2q u a n t i t a t i v e l y s t i m u l a t e sh u m a nc a n c e r g r o w t h [J ].O n c o ge n e ,2013,32:222-233.[4] 瞿彩兴,马圭,范钰.s i R N A 下调T R O P -2基因表达对人胰腺癌细胞迁移和侵袭的影响[J ].中国肿瘤外科杂志,2011,3:201-203,223.[5] V a r u gh e s eJ ,C o c c o E ,B e l l o n e S ,e t a l .U t e r i n e s e r o u s p a p i l l a r y c a r c i n o m a s o v e r e x p r e s s h u m a n t r o p h o b l a s t -c e l l -s u r f a c e m a r k e r (T r o p -2)a n d a r e h i g h l y s e n s i t i v e t o i mm u n o t h e r a p y w i t h h R S 7,a h u m a n i z e d a n t i -T r o p -2m o n o c l o n a l a n t i b o d y[J ].C a n c e r ,2011,117:3163-3172.[6] M a i r eP ,B r e h e rF ,S c h o n b e r g H ,e ta l .C h i r a lR h o d i u m (I )a n d I r i d i u m (I )a m i n o -o l ef i nc o m p l e x e s :P k (a ),N -H b o n d d i s s o c i a t i o ne n e rg y ,a n dc a t a l y t i c t r a n s f e rh y d r o ge n a t i o n [J ].O r ga n o m e t a l l i c s ,2005,24:3207-3218.[7] V a r u g h e s e J,C o c c o E,B e l l o n e S,e t a l.H i g h-g r a d e,c h e m o t h e r a p y-r e s i s t a n t p r i m a r y o v a r i a nc a r c i n o m ac e l l l i n e so v e r e x p r e s sh u m a n t r o p h o b l a s t c e l l-s u r f a c em a r k e r(T r o p-2)a n da r e h i g h l y s e n s i t i v et oi mm u n o t h e r a p y w i t h h R S7,ah u m a n i z e d m o n o c l o n a la n t i-T r o p-2a n t i b o d y[J].G y n e c o lO n c o l,2011,122:171-177.[8]J i a n g A,G a o X,Z h a n g D,e ta l.E x p r e s s i o n a n d c l i n i c a ls i g n i f i c a n c eo ft h e T r o p-2g e n ei na d v a n c e dn o n-s m a l lc e l l l u n g c a r c i n o m a[J].O n c o l L e t t,2013,6:375-380.(收稿日期:2014-05-13﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏)㊃简讯㊃中国抗癌协会肿瘤介入专业委员会呼吸内镜分会顾问:杨仁杰北京大学肿瘤医院王广发北京大学第一医院李强上海长海医院李时悦广州呼吸疾病研究所金发光第四军医大学唐都医院王国本美国霍普金斯大学主任委员:王洪武煤炭总医院副主任委员:陈良安解放军总医院赖国祥南京军区福州总医院张杰北京天坛医院曾奕明福建医科大学附属第二医院学术委员(按姓氏字母排序):白冲上海长海医院蔡志刚河北医科大学第二附属医院陈成水温州医学院陈正贤广东省人民医院黄建安苏州大学附属第一医院李王平第四军医大学唐都医院李润浦河北保定第二中心医院林殿杰山东省立医院林科雄重庆市新桥医院吕莉萍安徽省胸科医院柯明耀厦门第二中心医院马壮沈阳军区总医院荣福广东顺德人民医院孙加源上海交通大学附属胸科医院田庆解放军总医院王昌惠同济大学附属第十人民医院王继旺江苏省人民医院王萍北京306医院王孟昭北京协和医院王晓平山东胸科医院王臻北京朝阳医院吴琦天津海河医院谢宝松福建省立医院徐兴祥江苏苏北人民医院赵军北京大学肿瘤医院张新上海复旦大学附属中山医院章巍北京大学第一医院张黎明北京朝阳医院西院周红梅甘肃省第二人民医院周云芝煤炭总医院秘书长:林殿杰(兼)山东省立医院秘书:张楠煤炭总医院梁素娟煤炭总医院地址:北京朝阳区西坝河南里29号煤炭总医院肿瘤内科联系电话:张楠010-********-2266,T e l:135********梁素娟010-********,T e l:151********。