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柳州市柑橘黄龙病QPCR检测及代谢物鉴定柳州市是中国柑橘产业的重要基地之一，柑橘黄龙病是柑橘产业中的主要病害之一，给柑橘产业造成了严重的危害。
对柑橘黄龙病进行及时、准确的检测和鉴定显得至关重要。
本文将介绍柳州市柑橘黄龙病的QPCR检测及代谢物鉴定的相关内容。
我们来了解一下柑橘黄龙病的基本情况。
柑橘黄龙病是一种由细菌引起的柑橘病害，主要传播媒介是柑橘木虱，它会携带细菌侵入柑橘树体内，引起柑橘树的黄化、落叶、果实畸形等症状，严重影响柑橘的生长和产量。
目前，世界各地的柑橘产业都受到了柑橘黄龙病的威胁，因此对该病害进行检测和鉴定具有重要意义。
一种目前常用的柑橘黄龙病检测方法是QPCR技术。
QPCR技术是一种快速、灵敏、准确的检测技术，可以检测出数量级很低的病原体DNA，对病原体的检测效果非常好。
在柳州市的柑橘黄龙病检测中，QPCR技术发挥了重要作用。
通过采集柑橘叶片、枝条等样品，提取其中的DNA，然后利用QPCR技术对样品中的柑橘黄龙病病原体进行检测，可以快速、准确地确定柑橘是否感染了黄龙病。
这为果农提供了重要的依据，有助于他们及时采取措施防治和控制柑橘黄龙病的传播，保护柑橘产业的健康发展。
除了检测技术，对柑橘黄龙病的代谢物鉴定也是非常重要的一项工作。
代谢物是生物体新陈代谢产生的小分子有机化合物，是细菌、真菌等微生物感染植物后产生的一类化合物，它们在植物-病原体相互作用过程中发挥着重要的作用。
对柑橘黄龙病的代谢物进行鉴定，有助于我们更深入地了解柑橘和黄龙病菌之间的相互作用机制，为研究黄龙病的防治提供重要的参考。
针对柳州市柑橘黄龙病的代谢物鉴定工作，研究人员可以采用多种方法。
质谱技术是一种常用的代谢物鉴定技术，可以通过对样品中代谢物的分析，快速鉴定出其中的化合物种类和含量。
通过质谱技术的应用，可以广泛地筛选和鉴定出柑橘黄龙病的相关代谢物，为柑橘黄龙病的研究提供重要的数据支持。
也可以采用核磁共振技术、高效液相色谱技术等进行代谢物的鉴定，不同的技术可以相互协作，为柑橘黄龙病的代谢物鉴定提供更加全面和准确的数据支持。
柑橘黄龙病PCR检测方法有付出有风险才有收获的，而且种植柑橘是不可能一帆风顺的，柑橘和人一样也会生病，有叶片的，有树干的，有果实的。
这篇文章让我们来了解一下柑橘的黄龙病，那什么是柑橘黄龙病呢？柑橘黄龙病的PCR检测方法是什么呢？我们又应该如何预防柑橘黄龙病呢？1，柑橘黄龙病和人生病一样，柑橘的黄龙病也有一个进程。
柑橘得了黄龙病后，首先柑橘的叶片会发黄、变的脆、硬容易一掐就掉，叶片的脉络也会发肿，柑橘叶片的表面不再整齐不再有光泽，因此，早期我们可以通过观察柑橘叶片来大致判定柑橘是否病变。
其次是柑橘的树尖，柑橘的树尖会出现一个黄化现象，出现很多营养不良的树枝，该树枝会发黄，但发黄底下的树叶又是正常的！再次，是柑橘的花，得病的柑橘树容易提前开花，但花比正常的花更加容易凋落。
最后是柑橘树根的一个症状，树根会腐败坏死。
柑橘黄龙病的发病是从上往下的，不会直接从根系坏死，所以，平常我们就可以通过观察柑橘树的一个基本情况来防御治疗。
2，柑橘黄龙病PCR检测方法因为，显微镜检查对柑橘的黄龙病容易出现一个漏检，血清学方法范围又会相当于比较狭窄，所以，我们通常用PCR去检测柑橘是否患有黄龙病。
PCR中文名是聚合酶链式反应，即通过一些仪器设备去检测柑橘体内病原体的DNA序列看是否和黄龙病的DNA序列一致，因此来判定柑橘是否患有黄龙病。
3，柑橘黄龙病的预防（1）加强柑橘苗的检查，严禁得病的种子和苗流入市场，防止刚开始种植柑橘而不了解此种疾病的人误选误种！（2）一旦发现有黄龙病的发生，马上处理！柑橘感染黄龙病后只会越来越严重，还有可能传染给其他健康树苗，所以，当发病后，应当把得病的果树连根挖起，将病枝病叶用火烧毁。
（3）柑橘木虱是传染黄龙病的媒介，因此我们应尽量消除柑橘木虱，切除因得了黄龙病而发黄的树枝树叶，饿死木虱。
以上是关于柑橘黄龙病的一些相关知识，种植柑橘的农户也不要怕这个黄龙病，只要预防治疗得当，它根本不值一提。
也希望以后大家能略微了解下柑橘黄龙病PCR检测方法，方便以后的管理。
柑橘黄龙病实验室鉴别具体流程下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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柳州市柑橘黄龙病QPCR检测及代谢物鉴定柳州市是广西重要的柑橘生产基地之一，然而柑橘黄龙病是严重威胁柑橘产业的一种重要病害。
柑橘黄龙病是由黄龙病杆菌引起的一种传播较快的细菌性病害，其在柳州市柑橘园中的发生频率较高。
对柑橘黄龙病的快速检测及代谢物鉴定具有重要意义。
QPCR（Quantitative PCR）是一种快速准确的分子生物学方法，可用于检测柑橘黄龙病病原体的存在及数量。
QPCR方法结合了PCR技术和荧光探针技术，能够在短时间内明确检测到目标DNA的数量，并且还可以区分出不同的细菌菌株。
QPCR技术被广泛应用于植物病原体的检测中。
针对柳州市柑橘黄龙病的QPCR检测，首先需要针对黄龙病杆菌的DNA进行提取。
提取后的DNA样品可以直接用于QPCR检测，通过引入特定的引物和探针，配合荧光检测系统，即可在PCR反应过程中定量检测病原体DNA的存在量。
通过对已发病和未发病柑橘叶片进行QPCR检测，可以判断病原体在植物体内的数量，从而评估病害的程度和传播速率。
除了快速检测柑橘黄龙病病原体的存在数量外，还有必要对患病柑橘的代谢物进行鉴定。
病害对植物的影响不仅仅局限在外部症状上，还会影响植物内部的代谢活动。
通过代谢物鉴定可以全面了解患病柑橘的生化变化，为病害防治提供更多的参考信息。
代谢物鉴定的方法有很多种，包括色谱-质谱联用技术（GC-MS、LC-MS）、核磁共振技术（NMR）、红外光谱技术（IR）等。
这些方法都能通过分析样品中不同代谢物的特征峰或峰面积，鉴定出代谢物的种类和含量，从而揭示植物的生化变化。
对于柑橘黄龙病，代谢物鉴定可以分析出植物叶片中的酚类化合物、萜类化合物、胺类化合物等代谢产物的变化情况。
这些化合物的变化不仅反映了植物的生理状态，还可以作为植物对病害的抗性指标。
通过代谢物鉴定，可以找到与抗性相关的代谢产物，为后续的遗传改良和植物保护提供重要的信息。
柳州市柑橘黄龙病的QPCR检测及代谢物鉴定是一项有益的研究工作。
梅州地区柑橘黄龙病的常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术研究与应用梅州地区是广东省著名的柑橘产区之一，柑橘种植业在当地占据着极为重要的地位。
近年来，柑橘黄龙病成为了梅州地区柑橘产业发展面临的一个严重问题。
柑橘黄龙病是由念珠病菌引起的一种植物病害，主要侵害柑橘类植物，导致柑橘叶片出现黄化、叶缘卷曲、果实变形等症状，严重影响了柑橘的产量和质量。
及早检测和控制柑橘黄龙病对于保障梅州地区柑橘产业的健康发展具有重要意义。
随着分子生物学技术的不断发展，PCR（聚合酶链式反应）技术成为了检测植物病原体的重要手段之一。
常规PCR和实时荧光定量PCR作为PCR技术的两种主要变种，分别具有其特定的优势和应用范围。
本文将探讨梅州地区柑橘黄龙病的常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术在病原体检测与疾病防控中的应用，为柑橘黄龙病的早期监测和有效管理提供技术支持。
一、柑橘黄龙病的病原体柑橘黄龙病的病原体为念珠病菌，是一种革兰氏阴性细菌，其主要传播途径为柑橘落叶介壳虫。
念珠病菌在柑橘树中引起内生细菌病，导致植物出现黄化、叶片卷曲、果实变形等症状，严重影响柑橘的生长和产量。
目前，柑橘黄龙病已经成为全球性的柑橘病害，对柑橘产业造成了严重威胁。
二、常规PCR技术在柑橘黄龙病检测中的应用常规PCR技术是通过DNA扩增的方法来检测特定的基因序列，其操作流程相对简单，灵敏度较高，通常用于病原体的快速检测和鉴定。
在柑橘黄龙病检测中，常规PCR技术可以利用念珠病菌特异性基因序列进行扩增，从而实现对念珠病菌的检测。
常规PCR技术的操作流程通常包括以下几个步骤：提取植物组织中的DNA样本、设计特异性引物进行PCR扩增、电泳分析扩增产物等。
通过常规PCR技术检测，可以快速获得样品中是否存在念珠病菌的信息，为疾病的早期监测提供了重要的技术手段。
实时荧光定量PCR技术是一种将PCR反应与荧光探针结合的新型PCR技术，其具有高度灵敏性、准确性和高通量性的特点。
柑橘黄龙病检测标准柑橘黄龙病（HLB）是一种由快速生长的细菌引起的严重疾病，它对柑橘树的生长和果实产量造成了严重影响。
为了及时发现和控制这种病害，制定了一系列的检测标准，以确保柑橘树的健康和产量。
一、病原检测标准。
1. 样品采集，在进行黄龙病检测时，首先需要采集叶片、茎、根等植物组织样品。
采样时应选择疑似感染的植株，避免采集健康植株的样品，以免造成误判。
2. 样品保存，采集的样品需要妥善保存，避免受到外界环境的影响。
通常采用冷藏或冷冻的方式保存样品，以确保样品中的病原体得以保留。
3. DNA提取，从采集的样品中提取DNA，这是检测黄龙病的重要步骤。
提取的DNA样品应保持完整，避免受到外界环境的污染。
4. PCR检测，利用聚合酶链式反应（PCR）技术对提取的DNA样品进行检测，以确认样品中是否存在黄龙病的病原体。
PCR检测结果应准确可靠，避免假阳性或假阴性的情况发生。
二、病害鉴定标准。
1. 症状观察，对疑似感染黄龙病的柑橘树进行症状观察，包括叶片颜色变化、叶缘翻卷、果实变形等症状。
病害鉴定需要准确辨识黄龙病的特征症状，避免与其他病害混淆。
2. 病原体分离，从感染的柑橘树样品中分离出黄龙病的病原体，进行培养和鉴定。
分离出的病原体应符合黄龙病的特征，以确保鉴定结果的准确性。
3. 免疫学检测，利用免疫学方法对疑似感染的柑橘树进行检测，包括ELISA等免疫学技术。
免疫学检测结果应准确可靠，避免误判。
三、病害防控标准。
1. 防控措施，根据检测结果制定相应的防控措施，包括病株的清除、病害源头的控制、病害传播途径的切断等。
防控措施应科学合理，有效控制病害的传播和发生。
2. 监测与预警，建立黄龙病的监测与预警体系，及时发现病害的发生和传播情况，采取相应的应对措施。
监测预警体系应及时准确，避免疫情扩散。
3. 疫区划定，对发现黄龙病疫情的区域进行划定，建立相应的疫区管理制度，加强对疫区的管控和防控措施。
疫区划定应科学合理，避免过度扩大或缩小疫区范围。
柑橘黄龙病菌亚洲种分子检测引物评价及绝对定量PCR体系优化谢帆;龚顺;王泽琼;肖玉雄;杜志强;仝铸;何秀娟;邱文明;孙中海;潘志勇;肖翠【期刊名称】《植物保护》【年(卷),期】2024(50)3【摘要】柑橘黄龙病是对柑橘产业最具毁灭性的病害,目前没有可用的有效药剂和抗病品种,分子检测对黄龙病有效防控至关重要。
本研究对国内外常用的常规PCR 和巢式PCR检测引物进行评价,针对多拷贝的nrdB和16S rDNA基因,构建质粒标准品并筛选适用于绝对定量PCR的最佳质粒。
结果表明,使用Es Taq MasterMix 对感染Candidatus Liberibacter asiaticus(C Las)的柑橘样品进行常规PCR检测时,在评价的16对引物中,OI1/OI2c、Las606/LSS和HLBF468/R877灵敏度最高,推荐同时使用检测黄龙病菌含量低的样品;各组巢式PCR检测引物有其适用扩增体系,部分引物用Es Taq MasterMix扩增时出现非特异性扩增,F1/B1→F3/B3则适用Es Taq MasterMix体系,且最高可稳定特异检出10^(5)倍稀释感染C Las柑橘总DNA样品(2×10^(-3) ng/μL),是灵敏度最高的引物组,OI1/OI2c→S3/S4在Es Taq MasterMix和Ex Taq DNA聚合酶体系中均可稳定特异检出104倍稀释感染C Las柑橘总DNA样品(2×10^(-2) ng/μL),是适用扩增体系最广的引物组;构建的5个绝对定量PCR质粒标准品中,pnrdB83扩增效率最接近100%,且在2次重复试验中波动最小,稳定性最强,并且作为标准品对黄龙病待测样品进行绝对定量时,各样品在2次重复试验中的拷贝数差值最小,是本研究筛选的最佳质粒。
本研究的结果将为柑橘黄龙病菌的定性和定量分子检测提供参考。
【总页数】13页(P234-246)【作者】谢帆;龚顺;王泽琼;肖玉雄;杜志强;仝铸;何秀娟;邱文明;孙中海;潘志勇;肖翠【作者单位】湖北省农业科学院果树茶叶研究所;华中农业大学园艺林学学院;宜昌三峡百景宜农业科技发展有限公司【正文语种】中文【中图分类】S436.661.12【相关文献】1.三种 PCR 方法检测柑橘黄龙病菌的效果比较2.梅州地区柑橘黄龙病的常规PCR 与实时荧光定量PCR检测技术研究与应用3.柑橘黄龙病菌亚洲种16S rDNA和16S-23S rDNA间隔区的PCR-RFLP及序列分析4.基于16S rDNA与多拷贝基因hyvⅠ/hyvⅡ的柑橘黄龙病菌PCR检测体系比较5.柑橘黄龙病菌亚洲种微滴数字PCR检测方法的建立因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
梅州地区柑橘黄龙病的常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术研究与应用1. 引言1.1 研究背景柑橘黄龙病是由黄龙病菌引起的柑橘病害，主要通过亚洲柑橘际植物单胞菌传播，造成柑橘树叶片黄龙状、芽梢生长迟缓、果实变形、果实裂纹等严重症状，严重危害柑橘生产。
目前，梅州地区柑橘黄龙病已成为威胁柑橘产业发展的重要因素。
传统的黄龙病检测方法通常采用病斑样品的酶联免疫吸附试验（ELISA）或聚合酶链式反应（PCR）技术。
这些方法存在着检测灵敏度低、结果准确性不高等问题，不能完全满足对黄龙病的快速、准确诊断需求。
基于常规PCR与实时荧光定量PCR技术在其他领域已广泛应用且具有高灵敏度和准确性的特点，本研究旨在探讨这两种技术在梅州地区柑橘黄龙病检测中的应用，从而提高柑橘黄龙病的早期诊断和防控水平。
通过研究常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术的原理、比较以及在柑橘黄龙病检测中的具体应用，为梅州地区柑橘产业的健康发展提供科学依据和技术支持。
1.2 研究目的研究目的是为了探讨在梅州地区柑橘黄龙病防控中，常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术的应用效果。
通过比较两种技术的原理和优缺点，确立更为准确、快速的检测方法，为该地区柑橘黄龙病的早期诊断和防控提供科学依据。
具体目的包括：1. 探究常规PCR检测技术在柑橘黄龙病检测中的应用情况和效果；2. 研究实时荧光定量PCR检测技术的原理及其对柑橘黄龙病的检测敏感性与准确性；3. 比较常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术在柑橘黄龙病检测中的优劣之处；4. 分析柑橘黄龙病的常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术研究成果，探讨其在梅州地区的实际应用前景；5. 最终旨在提高柑橘黄龙病的防治水平，为梅州地区柑橘产业的健康发展提供技术支持和保障。
1.3 研究意义梅州地区是我国重要的柑橘产区之一，柑橘黄龙病是严重危害柑橘生产的病害之一。
柑橘黄龙病是由杆菌共生体传播的一种病害，能够引起植物严重的光合作用障碍，导致柑橘树叶片黄化、叶缘翘曲、树势下降、果实生长受损等严重问题，严重影响了柑橘产量和品质。
柳州市柑橘黄龙病QPCR检测及代谢物鉴定【摘要】柑橘黄龙病是柑橘树的一种严重病害，对柳州市的柑橘产业造成了严重威胁。
本文通过QPCR技术和代谢物鉴定方法，对柳州市柑橘黄龙病进行检测和研究。
在病原鉴定方法探讨中，探讨了QPCR技术在柑橘黄龙病检测中的应用，并详细介绍了代谢物鉴定在研究中的重要作用。
实验方法部分详细描述了柑橘黄龙病代谢物鉴定的步骤和流程，结果分析部分对代谢物鉴定结果进行了详细的分析。
结论部分总结了柳州市柑橘黄龙病QPCR检测及代谢物鉴定的重要意义，并展望了未来的研究方向。
通过本文的研究，将为柑橘黄龙病的防控提供重要的实验依据和理论支持。
【关键词】关键词：柳州市、柑橘、黄龙病、QPCR检测、代谢物鉴定、病原鉴定、技术应用、实验方法、结果分析、研究意义、未来展望。
1. 引言1.1 柳州市柑橘黄龙病QPCR检测及代谢物鉴定的背景柳州市位于广西壮族自治区，是我国重要的柑橘产区之一，然而近年来，柳州市柑橘黄龙病的发生严重影响着柑橘产业的发展。
柑橘黄龙病是由类花叶病毒引起的一种病害，严重危害柑橘树的生长和果实的品质。
除了病原检测外，代谢物鉴定也扮演着重要的角色。
通过分析柑橘树受到黄龙病侵染后的代谢物变化，可以深入了解病程的发展和机制，为寻找防治病害的新方法提供参考。
本研究就是基于QPCR技术和代谢物鉴定方法，探讨柳州市柑橘黄龙病的病原鉴定和机制研究，旨在为柑橘产业的健康发展提供科学依据和技术支持。
1.2 研究目的研究目的：本研究旨在探究柳州市柑橘黄龙病QPCR检测及代谢物鉴定的方法和应用，旨在提高黄龙病的检测准确性和效率，为柑橘黄龙病的防控提供科学依据。
具体目的包括：1. 探讨柳州市柑橘黄龙病病原鉴定方法，提高病原检测的灵敏度和特异性；2. 研究QPCR技术在柳州市柑橘黄龙病检测中的应用，评估其在实际检测中的准确性和稳定性；3. 探讨代谢物鉴定在柳州市柑橘黄龙病研究中的作用，揭示病原与寄主之间的代谢互作机制；4. 探讨柑橘黄龙病代谢物鉴定的实验方法，总结代谢物鉴定的关键步骤和注意事项；5. 分析代谢物鉴定结果，揭示柑橘黄龙病的代谢物特征和变化规律。
柳州市柑橘黄龙病QPCR检测及代谢物鉴定柳州市是中国柑橘产业的重要基地之一，柑橘黄龙病是造成柑橘感染的一种病害，严重影响了柑橘的产量和品质。
为了及时发现柑橘黄龙病的感染情况并对其进行有效的控制，近年来，柳州市开展了柑橘黄龙病QPCR检测及代谢物鉴定工作。
下面将介绍柳州市柑橘黄龙病QPCR检测及代谢物鉴定的相关情况。
柳州市柑橘黄龙病QPCR检测的工作原理是利用定量PCR技术对柑橘叶片中的黄龙病菌进行快速、准确的检测。
QPCR技术是在传统PCR技术基础上发展而来的一种新型PCR技术，其最大特点是能够实现对目标DNA的定量检测，具有高灵敏度、高特异性、高准确性等优点。
通过QPCR检测，可以快速获得柑橘叶片中黄龙病菌的数量信息，为进一步的病害防控提供科学依据。
针对柳州市柑橘黄龙病的QPCR检测工作，相关部门首先对柑橘树叶采样进行标本处理，提取出叶片中的DNA。
随后，利用QPCR仪器进行PCR扩增反应，通过实时监测扩增曲线，得出黄龙病菌DNA的数量。
根据检测结果，对不同地区、不同柑橘品种的黄龙病感染情况进行分析，及时采取相应的防控措施，保障柑橘产量和品质。
除了QPCR检测外，柳州市还开展了柑橘黄龙病代谢物鉴定工作。
柑橘黄龙病是由黄龙病细菌引起的一种植物病害，其感染会导致柑橘叶片内部代谢物的显著变化。
通过对柑橘叶片进行代谢物分析，可以发现黄龙病感染对柑橘植株代谢活动的影响，为进一步研究其发病机制提供重要参考。
在柑橘黄龙病代谢物鉴定工作中，柳州市相关部门首先对不同状态的柑橘叶片进行采样，采用色谱质谱联用技术对其代谢物进行分析。
通过比对感染和未感染的柑橘叶片代谢物谱图，可以鉴定出感染黄龙病后柑橘叶片中代谢物含量的变化情况，进而揭示柑橘黄龙病的发病机制和传播途径。
通过柑橘黄龙病QPCR检测及代谢物鉴定工作，柳州市已经取得了显著的成效。
QPCR检测技术的应用大大提高了柑橘黄龙病的检测效率和准确性，为病害的防控提供了可靠的数据支持。
三种PCR方法检测柑橘黄龙病菌的效果比较作者：程保平等来源：《植物保护》2014年第05期摘要：为了比较常规PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR方法在大田检测中对柑橘黄龙病（Huanglongbing， HLB）的检测效果，首先比较了3种检测方法对柑橘黄龙病菌检测的灵敏度，结果发现：3种检测方法的灵敏度依次为常规PCR关键词：柑橘黄龙病；常规PCR；巢式PCR；实时荧光定量PCR；比较研究中图分类号： S 412文献标识码： A柑橘黄龙病是世界柑橘生产上最为严重的病害，在我国及东南亚、非洲、阿拉伯半岛、印度、巴西和美国佛罗里达和加利福尼亚等国家和地区均有发生，严重制约着世界柑橘产业的发展[1]。
柑橘黄龙病的病原被认为是韧皮部杆菌属，有亚洲种、非洲种和美洲种3个种[23]。
目前在我国传播的是亚洲种[4]。
该病菌主要由接穗、苗木和木虱传播，还可通过菟丝子在柑橘间传播。
植株感病后，传病速度快，目前尚无有效药剂和抗病品种，因此及时准确地诊断有助于及早清除传染源，对于防止病害的快速传播具有重要意义[5]。
柑橘黄龙病有一些典型的症状。
初期症状：叶脉肿突，枝梢变黄，中质硬化、无光泽。
中后期症状：病叶陆续脱落，病梢萌发早、短而纤弱，病叶细狭长、硬化、出现均匀黄化或斑驳症状，果实出现“红鼻子果”症状。
最后植株根部腐烂，生长逐渐衰弱，以致整株死亡[67]。
但该病的症状与缺素、病毒病等有相似的症状，而且症状诊断带有很多主观因素，因此诊断准确率不高[8]。
20 世纪90 年代后，随着分子生物学方法的发展，大量准确灵敏的分子检测方法已用于该病的检测[9]。
目前最广泛用于黄龙病菌检测的是PCR方法[10]。
1996年Jagoueix等依据黄龙病菌核糖体蛋白基因设计了特异引物，应用常规PCR 检测柑橘黄龙病菌[11]。
2007 年Zhou 等为提高检测灵敏度，运用巢式PCR检测黄龙病菌[12]。
同样基于该菌的核糖体蛋白基因，2006 年Wang 等建立实时荧光定量PCR方法来检测黄龙病菌[13]。
本研究综合比较了这3种检测方法对广东柑橘黄龙病菌的检测灵敏度与田间检测率。
1 材料与方法1.1 样品与材料3种PCR检测所用的黄龙病疑似样品分别采自广东省的龙门、肇庆、云浮等地的柑橘基地，共189个样品。
阴性对照样品为本研究室种植于防虫网内的健康柑橘叶片，阳性对照为种植于防虫网内的感染黄龙病柑橘植株的叶片。
用于特异性检测的病原菌为本研究室保存于PDF 培养基上的柑橘溃疡病菌、柑橘炭疽病菌、辣椒疫霉菌（可危害柑橘）、保存于防虫网室内柑橘上的柑橘衰退病病毒和柑橘碎叶病病毒。
用于灵敏度测试的重组质粒为插入柑橘黄龙病菌16S rDNA的pMD19重组质粒，由本研究室构建。
1.2 检测叶片样品处理田间采集叶片置于塑封袋，再保存于冰盒内。
制样时清洗并晾干柑橘叶片，然后剪取叶片中脉放入灭菌研钵，加入液氮研磨成粉状，最后按爱思进公司试剂盒说明书提取样品总基因组。
质粒提取方法同样参照爱思进公司的试剂盒说明书。
在3种检测方法的灵敏度试验中，将重组质粒DNA原液10倍梯度稀释为10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5等系列稀释液，然后作为PCR的模板。
以本研究室保存于防虫网室内的健株柑橘叶脉DNA为阴性对照，以保存于防虫网内的感染黄龙病的柑橘叶片为阳性对照。
1.3 PCR 引物常规PCR：上游引物OI1：5′GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA3′，下游引物OI2c：5′GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT3′[11]。
巢式PCR 引物对：外侧引物为OI1/OI2c；内侧引物的上游引物CGO3F：5′RGGGAAAGATTTTATTGGAG3′，下游引物对CGO5R：5′GAAAATAYCATCTCTGATATCGT3′[12]。
SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR引物对上游引物CQULA04F：5′TGGAGGTGTAAAAGTTGCCAAA3′，下游引物CQULA04R：5′CCAACGAAAAGATCAGATATTCCTCTA3′[13]，引物对均由广州英骏公司合成。
PCR 缓冲液、Taq酶、SYBR Premix Ex Taq等购自大连宝生物公司。
质粒DNA提取试剂盒和基因组DNA提取试剂盒等购自爱思进公司。
使用仪器为：iCyclerTM ABI 7500型实时荧光定量PCR，Molecular Imager Gel Doc XR+型凝胶成像系统。
1.4 PCR检测体系及扩增程序50 μL 反应体系，包括 Pre mix Taq 25 μL、10 μmol/L 的引物各2 μL，DNA 模板1 μL，补水至50 μL。
扩增反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35 个循环；72 ℃延伸10 min[11]。
1.5 巢式PCR 检测采用常规PCR中的OI1/OI2c为巢式PCR外侧引物进行第1轮的PCR扩增，反应体系以及反应程序参照常规PCR反应。
取1 μL第1轮PCR反应产物为模板，以CGO3F/CGO5R为内侧引物进行第2轮PCR扩增，反应体系与常规PCR相同。
反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。
扩增完成后将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳[12]。
1.6 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测20 μL 的反应体系，包括SYBR Premix Ex Taq缓冲液10 μL、10 μmol /L 引物对各0.8μL、模板1 μL、ROXDye2 0.4 μL、补水至20 μL。
PCR反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，45个循环；72 ℃延伸5 min[13]。
PCR 扩增结束后进行熔解曲线分析，用于验证扩增的特异性。
2 结果与分析2.1 常规PCR、巢式PCR 的检测灵敏度通过对浓度稀释梯度为10-1～10-9的重组质粒DNA样品的检测发现：常规PCR和巢式PCR检测方法均可快速、特异、灵敏地检测出黄龙病菌的16S rDNA片段，常规PCR可在浓度梯度为10-1～10-5的5个重组质粒DNA稀释样品中检测出清晰的目标条带，其中对10-5稀释的样品检测中发现：凝胶电泳条带非常微弱（图1）。
而巢式PCR检测结果显示：10-5稀释的样品中仍可检测到清晰的目标条带，10-6～10-8稀释的DNA中亦能检测到条带。
10-9稀释模板后进行检测，无清晰的扩增条带出现。
表明巢式PCR方法的检测灵敏度是普通PCR检测方法的1 000倍（图2）。
3 结论与讨论柑橘黄龙病树有一些典型的症状，人们常以此来判断黄龙病的发生。
但症状诊断带有很多主观因素，且该病的症状与柑橘缺素症、柑橘病毒病等有很多相似之处，因此诊断准确率不高[6]。
人们还开发出了一些其他诊断方法，如：指示植物鉴定法、组织染色观察法、电镜切片观察法、核酸杂交检测法等，但这些方法或者检测时间长、操作复杂，或者检测灵敏度不够，难以直接应用于黄龙病的田间实际检测[8]。
PCR 技术具有快速、灵敏、准确等优点，已成为当前柑橘黄龙病检测的主要手段。
PCR 技术主要有：普通PCR、巢式PCR与实时荧光定量PCR[5]。
这3种检测方法对广东省各种柑橘品种的田间检测效果还缺少评价和报道。
本研究首先对比了3种PCR方法对柑橘黄龙病菌的检测灵敏度。
试验表明：普通PCR、巢式PCR、实时定量荧光PCR方法均可对黄龙病菌16S rDNA进行有效检测，但其检测灵敏度有所不同，依次为：常规PCR与实验室的理想条件不同，田间检测样品中混杂了很多柑橘基因组和一些可能干扰PCR 反应的抑制物[14]。
对采自田间不同柑橘品种的样品进行检测后发现：3种检测方法可有效抵御抑制物对PCR反应的影响，均可顺利地在田间样品中检测出黄龙病菌。
3 种PCR检测技术对本研究室保存的柑橘溃疡病菌、柑橘炭疽病菌、辣椒疫霉菌、柑橘衰退病病毒、柑橘碎叶病病毒及健康柑橘对照样品均无阳性反应，说明这3种检测方法的特异性较好。
研究还发现：这3种检测方法的田间检测效果是：常规PCR综上，普通PCR得益于其较低的成本，适合用于大规模的田间初次普查检测；实时荧光定量PCR非常适合对普通PCR没有检出的疑似样品进行进一步的确认，或可对黄龙病菌侵染早期，含菌量较低的样本，如种苗、接穗进行定量检测；巢式PCR同时具有前两者的一些优点，但由于对操作的要求较高，适合经验较为丰富的研究人员开展试验，且在试验中需严格遵守试验程序，确保试验用品的消毒，并严格控制样品污染，从而避免假阳性。
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