仪器分析实习指导

第五章 现代食品安全检测技术

第一节 高效液相色谱法测定蜂蜜中残留的四环素

一、实验目的

掌握高效液相色谱法测定蜂蜜中残留的四环素的原理

熟悉高效液相色谱法测定蜂蜜中残留的四环素的实验方法

了解高效液相色谱仪的基本结构与使用方法

二、实验原理

（一）四环素是一种广谱抗菌素，可用于治疗和预防一些动物性疾病，但如果长期使用，将导致四环素类药物在动物类组织中的残留。残留在动物类组织中的四环素类药物会影响食用者的健康。四环素类药物的毒性反应主要表现为对胃、肠、肝脏的损害及牙齿的染色等，还会造成过敏反应、二重感染、致畸胎作用。因此应严格控制其在食品中的残留量。

（二）用酸性的Na2 EDTA-Mcllvaine缓冲溶液将蜂蜜中蛋白质沉淀 ,同时将四环素提取出来，以草酸与乙腈为流动相，C18柱作为色谱柱，反相分离，紫外检测器检测，在四环素的标准曲线的线性范围内，依据其测得的峰面积与其含量间的线性关系进行定量分析。

三、仪器和试剂

（一）仪器

1. 高效液相色谱仪

2．紫外检测器

3．涡旋混合器

4．离心机

5．天平

（二）试剂

1．甲醇

2．乙腈

3．乙酸乙酯

4．磷酸二氢钠

5．盐酸

6．柠檬酸

7．乙二胺四乙酸二钠

8．草酸

四、操作步骤

1．提取

（1）称取5g试样，置于50mL离心管中，加入30mL0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine溶液,快速混合1min, 以3500r/min离心10min，上清液倒入另一离心管中。

（2）将上清液通过固相萃取柱，用2mLNa2EDTA-Mcllvaine溶液冲洗，再用20mL水洗，弃去全部流出液，减压抽干10min，用4mL流动相洗脱，定容至4mL，供液相色谱-紫外检测器测定。

2．标准溶液的配制

（1）称取四环素10mg，用甲醇溶解，并转移至100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得四环素储备液（0.1mg/mL）。准确移取该溶液1mL置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度,得0.01 mg/mL。准确移取该溶液0，0.05，0.10，0.20，0.40，0.80mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。得四环素标准溶液的浓度分别为0.05，0.10，0.20，0.40，0.80g/mL。

3．测定

（1）色谱条件：色谱柱：C18色谱柱，150mm×4.6mm, 5m；流动相：0.01mol/L草酸溶液（pH=2.5）-乙腈（80：20）；流速：1mL/min; 柱温：室温；紫外检测器：检测波长：355nm。

（2）将上述已制备好的不同浓度的四环素标准系列溶液一次进样20L，依据四环素的峰面积定量。以标准系列溶液的浓度为横坐标，其相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程。

（3）样品的测定：取已处理好的样品溶液20L进样分析，根据峰面积带入回归方程中计算。

五、结果计算

按下式可计算出蜂蜜中四环素的含量

X=C×V/m

式中：X为试样中四环素的含量，单位为g/g; C为从标准曲线计算得到的被测组分溶液浓度，单位为g/mL；V为试样溶液定容体积，单位为mL；m为试样溶液所代表的试样质量，单位为g。

六、注意事项

（一）流动相使用前必须经过脱气。如果流动相中含有气体，在较高的柱压下会产生气泡，使流动相流动受阻，对分离样品产生不利影响。

（二）固相萃取柱使用前应用5mL甲醇和10mL水活化。

（陈凌云）

第二节 液相色谱-串联质谱法测定水产品中的氟苯尼考

一、实验目的

（一）基本熟悉现代食品安全检测技术中高效液相色谱-串联质谱联用技术的测定方法和特点；

（二）了解液质联用技术的基本原理以及在食品安全检测中的重要性。

二、实验原理

氟苯尼考又名氟洛芬、氟甲砜霉素，分子式为C12H14Cl2FNO4S；分子量为358.2127；结构式为。氟苯尼考是一种兽用抗菌药，用于敏感细菌所致的猪、鸡及鱼的细菌性疾病，尤其对呼吸系统感染和肠道感染疗效显著。

样品中的氟苯尼考在碱性条件下，用乙酸乙酯提取，提取液经旋转蒸发挥干，残渣以水溶解，经正己烷液-液萃取脱脂。液相色谱-串联质谱仪，以氘代氯霉素（d5-氯霉素）为内标，MRM离子对方式检测，内标法定量。

三、试剂和仪器

甲醇（HPLC）、乙酸乙酯（AR）、正己烷（AR）、氨水（AR，25%～28%）、无水硫酸钠（AR）、氟苯尼考和氘代氯霉素（d5-氯霉素）标准物质（纯度>99%）、超纯水。

液相色谱-串联质谱仪（API 4000 Qtrap），配电喷雾电离离子源（ESI）；分析天平，感量0.01mg和0.001g；离心机，≥4000r/min；小型台式离心机，≥13000r/min；组织捣碎机；匀浆机；减压旋转蒸发仪；涡旋振荡器；聚丙烯离心管：带盖，50mL，1.5mL；鸡心瓶：25mL；具塞比色管等。

四、操作步骤

（一）标准溶液配制

1．100μg/mL标准储备液的配制：称取适量氟苯尼考标准物质，用甲醇配成100μg/mL的标准储备液，于-18℃冰箱保存备用。

2.1μg/mL标准储备液的配制：准确吸取1.00mL 100μg/mL标准储备液于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，于-18℃冰箱保存备用。

3.内标标准溶液：氘代氯霉素（d5-氯霉素），100μg/mL，溶剂为乙腈，氘化度≥98%。

4.1μg/mL内标标准储备液：准确吸取1.00mL内标标准溶液于100mL容量瓶中，用甲醇稀释、定容至刻度，于-18℃冰箱保存备用。

5.20ng/mL内标标准中间液：准确吸取1.00mL内标标准储备液于50mL容量瓶中，以超纯水稀释至刻度，于4℃冰箱保存备用。

6.标准工作溶液的配制：分别准确吸取一定量的标准储备液和内标标准中间液，以空白基质溶液配成10、50、100、200、500ng/mL，含内标10ng/mL的标准工作溶液。

（二）样品的制备

1.标记：从所取样品中，取出有代表性的可食部分约500g，用组织捣碎机充分捣碎均匀，装入洁净容器，密封，并标明标记。

2.提取：称取5g充分捣碎均匀的试样，精确至0.001g，置于50mL聚丙烯离心管中，加入内标标准中间液75.0μL，加入25mL乙酸乙酯，0.75mL氨水，3g无水硫酸钠，匀浆提取30s，4000r/min离心5min，上清液转移至50mL比色管中。另取一50mL离心管，加入20mL乙酸乙酯，0.60mL氨水，洗涤匀浆刀10s，洗涤液转移至第一支离心管中，用玻棒搅动残渣，涡旋振荡提取1min，超声波振荡提取5min，4000r/min离心5min，上清液合并至50mL比色管，乙酸乙酯定容至50.0mL。摇匀后移取10.0mL乙酸乙酯提取液于25mL鸡心瓶，45℃减压旋转浓缩至干。

3.净化：鸡心瓶中的残渣用2.00mL水溶解，涡旋振荡混匀，超声5min，加入3mL正己烷涡旋振荡混合30s，静置分层，弃掉上层的正己烷，再加3mL正己烷涡旋振荡混合30s，静置分层，移取部分下层的水相至1.5mL的聚丙烯离心管中，13000r/min离心5min，0.2μm滤膜过滤后，供液相色谱-串联质谱测定。

4.空白基质溶液的制备：称取5g空白样本，精确至0.001g，除不加入内标标准中间液，其它按照样品制备、净化的步骤进行。

（三）液相色谱条件

1.色谱条件

色谱柱：安捷伦 Zorbax XDB C-18，5μm，150mm×2.1mm；柱温：40℃；流动相：甲醇-水（4/1）；流速：0.40mL/min；进样量：10μL。

2.质谱条件

离子源：电喷雾电离离子源（ESI）；

扫描方式：负离子；

检测方式：多反应选择离子检测（MRM）；

质谱条件的优化：以1μg/mL的氟苯尼考和氘代氯霉素内标溶液，针泵直接进样，流速5μL/min，分别进行MS1、MS2的优化，确定相应质谱参数，选择合适的检测离子对。

电喷雾电压(IS)：-4200V；辅助气温度（TEM）：600℃，其它参数见下表5-2-1：

表5-2-1氟苯尼考、氘代氯霉素（d5-氯霉素）质谱参数

名 称 定性离子对

(m/z) 定量离子对

(m/z) 采集时间

（ms） 去簇电压DP

（V） 碰撞能量CE

（V）

氟苯尼考 356.0/336.0 356.0/336.0

200 -75 -15

356.0/185.0 -25

氘代氯

霉素 326.0/157.0 326.0/157.0 -55 -26

五、结果计算

以内标法定量，在优化的最佳条件下，对基质标准工作溶液进样，以标准溶液中被测组分的峰面积与氘代氯霉素峰面积的比值为纵坐标，标准溶液中被测组分的浓度（或被测组分浓度与氘代氯霉素浓度的比值）为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，得提取液的含量C。

按下式计算出蔬菜中被测组分的含量

10001000mVCX

式中：

X——试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；

C——从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

V——样品溶液最终的定容体积，单位为毫升（mL）；

m——称取试样的质量，单位为克（g）。

六、注意事项

（一）样品采集要均匀、具有代表性；

（二）试样要捣碎、匀浆彻底；

（三）流动相要过滤、脱气，并现时配制；

（四）避免样品污染；

（五）色谱柱要充分平衡。

（马安德）

第三节 电感耦合等离子体质谱法检测茶叶中铅、砷及镉含量

一、实验目的

（一） 掌握电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定元素含量的原理、分析过程中的各项干扰情况及其消除方法、基本分析步骤

（二） 熟悉电感耦合等离子体质谱仪的基本构造及操作

（三） 掌握元素（总量）分析的样品前处理方法

二、实验原理

ICP-MS由进样系统、离子源和质谱仪三个主要部分构成。样品溶液经过雾化由载气送入ICP炬焰中，经过蒸发、解离、原子化、电离等过程，转化为带正电荷的正离子，经离子采集系统进入质谱仪，质谱仪根据质荷比进行分离。对于一定的质荷比，质谱积分面积与进入质谱仪中的离子数成正比。即样品的浓度与质谱的积分面积成正比，通过测量质谱的峰面积来测定样品中元素的浓度。

三、试剂和仪器

（一）试剂

硝酸（优级纯）

H2O2（优级纯）

纯水：电阻率大于18.0MΩ·cm。

铅（Pb）、砷（As）、镉（Cd）混合标准使用溶液：10 mg/L。

锗（Ge）、铟（In）、铋（Bi）内标溶液：100 μg/L

（二）仪器

Thermo fisher XSeriesII电感耦合等离子体质谱仪

Millipore超纯水制备仪

美国CEM Mars微波消解仪及配套消解管和架子

精确控温电热消解器

千分之一天平 100 L、1 mL、5 mL可调移液器各一支，以及相应吸头若干

100 mL容量瓶11个、1000 mL烧杯1个、10 mL量筒1个、1000 mL量筒1个

四、操作步骤

(一) 仪器开机预热

（以下步骤基于实验老师将仪器预先调整到Vacuum ready状态下进行）

检查Ar气压力是否在0.6~0.7MPa范围内，排风是否正常，电源是否稳定；