基于组学技术的抗菌肽的研究

养殖与饲料2014年第7期抗菌肽的来源、功能及其在畜禽生产中的应用郑邓祥长江大学动物科学学院，湖北荆州434025收稿日期：2014-05-08郑邓祥，男，1991年生，本科。

抗菌肽又称抗微生物肽或肽抗生素，来源于微生物的抗菌肽又称细菌素，是机体先天防御系统的重要组成部分。

自20世纪70年代，瑞典科学家Boman 研究小组从惜古比天蚕中发现第一种抗菌肽“天蚕素”以来，每年都有大量新的抗菌肽被发现。

目前发现的多数抗菌肽具有较宽的活性谱，可有效杀死细菌、真菌、寄生虫甚至包膜病毒。

更为重要的是，抗菌肽可以有效抑制对抗生素产生耐药性的细菌，因此抗菌肽又被誉为“天然超级抗生素”[1]。

本文对抗菌肽的来源、功能和在畜禽生产中的应用进行了综述。

1抗菌肽的来源1.1昆虫迄今为止，约有200种昆虫抗菌肽被发现。

昆虫抗菌肽多数为阳离子肽，氨基酸残基数一般不超过100个[2]。

根据其氨基酸序列和结构特点，可将昆虫抗菌肽分为4大类：两性分子α-螺旋抗菌肽、分子内形成二硫键的抗菌肽、富含脯氨酸的抗菌肽及富含甘氨酸的抗菌肽。

另外，还有一类抗真菌的抗真菌肽和一类既抗细菌又抗真菌的抗菌肽。

1.2植物thionins 是第l 类从植物中分离的抗菌肽，能够抑制多种植物病原菌的生长。

之后，陆续从植物的根、种子、花、茎、叶子等中发现许多抗菌肽，根据序列相似性和抗菌活性，将其分为几个主要的类别：defensins 家族、cyclotides 家族、hevein-like proteins 家族、knottins 家族、impatiens 家族和snakins 家族。

1.3哺乳动物哺乳动物抗菌肽被发现存在于嗜中性粒细胞、潘氏细胞、上皮细胞或蛋白质的降解产物中。

这些抗菌肽包括defensins 、cathelicidins 、bactenecins 和indolicidins 几大家族。

defensins 是研究最多的哺乳动物抗菌肽，其通过化学趋化因子受体作用于树状细胞和T 细胞来调控宿主适应性免疫，以应对微生物的侵害。

抗菌肽的应用与存在问题抗菌肽是生物细胞特定基因编码、经特定外界条件诱导产生的一类多肽，具有分子量小、热稳定、杀菌范围广、作用机制独特等特点。

另外，抗菌肽还具有明显的对真菌、病毒、原虫的杀伤作用，同时又可以促进伤口的愈合（可能是加速了创伤处细胞的分裂增殖），能攻击肿瘤细胞而对正常细胞没有作用。

更令人惊喜的是，这些作用的结果不会象抗生素一样使致病菌的抗药性随抗菌肽的使用而有所增加。

因为抗生素的抗菌作用一般是作用于特殊的受体或酶，细菌容易通过变异对抗生素产生抗性，而抗菌肽在抗菌时一般没有特殊的受体，抗菌肽一般是通过物理作用造成细胞膜的穿孔而达到广谱抗菌的效果，所以抗菌肽的使用不容易产生抗性菌和交叉抗性；而且在病原菌感染时，用抗生素治疗实际上对机体是有害的，因为它能刺激内毒素的释放，有时还会造成脓毒休克，但使用抗菌肽则无此现象，而且抗菌肽还能抑制细菌产物诱导产生对人体有害的细胞因子。

到目前为止，无论是在抗菌肽的基础研究还是在后续的人工克隆、临床应用等方面都已取得了很大的成绩，笔者主要将有关抗菌肽文献中一些基本的、独特的性质及功能介绍如下。

一、抗菌肽的分类目前，抗菌肽的分类还比较复杂，没有统一的标准。

本文就对目前大家普遍比较认可的几种分类方式做一概述。

1.1根据抗菌肽对不同病原体的作用分根据抗菌肽对细菌、真菌及肿瘤细胞的作用不同，可将抗菌肽分为抗细菌肽、抗真菌肽、抗肿瘤肽、既抗真菌又抗细菌的抗菌肽、既抗肿瘤又抗微生物的抗菌肽等。

1.2根据抗菌肽的结构分1.2.1具有螺旋结构的线性多肽cecropins是第一个被发现的动物抗菌肽，1980年，由Boman等从美国天蚕蛹中分离得到。

该类多肽抗生素一般含有37～39个氨基酸残基，不含半胱氨酸，其N端区域具有强碱性，可形成近乎完美的双亲螺旋结构，而在C端区域可形成疏水螺旋，两者之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区，多数多肽的C端被酰胺化，酰胺化对其抗菌活性具有重要作用。

·基础研究·杜仲抗菌肽ＥｕＣＨＩＴ１对白色念珠菌的抑菌作用及机制研究△赵丹１，２，张湘燕１，２，罗振华２，３，董旋４，赵德刚４１ 贵州省人民医院呼吸与危重症医学科／贵州省呼吸疾病研究所，贵州　贵阳　５５０００２；２ 肺脏免疫性疾病诊治国家卫健委重点实验室，贵州　贵阳　５５０００２；３ 贵州省人民医院中心实验室，贵州　贵阳　５５０００２；４ 贵州大学生物工程研究院／贵州大学生命科学学院，贵州　贵阳　５５０００２［摘要］　目的：研究杜仲抗菌肽ＥｕＣＨＩＴ１对白色念珠菌的抗菌活性及机制。

方法：通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增ＥｕＣＨＩＴ１蛋白的编码区，构建原核表达质粒并转化到大肠杆菌ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３），经异丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导，采用镍亲和色谱法纯化得到可溶性的ＥｕＣＨＩＴ１；采用二倍最小抑菌浓度（ＭＩＣ）法稀释ＥｕＣＨＩＴ１并测定其对白色念珠菌的抑菌圈直径；采用荧光分光光度计和酶标仪分别检测ＥｕＣＨＩＴ１对白色念珠菌细胞膜的去极化作用及对细胞膜通透性的影响；通过鲎试验动态浊度法和高效液相色谱法分别测定白色念珠菌中（１，３） β Ｄ 葡聚糖和麦角甾醇含量；酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）检测ＥｕＣＨＩＴ１对白色念珠菌感染的ＳＤ大鼠肺上皮ＷＴＲＬ１细胞中白细胞介素 １β（ＩＬ １β）、ＩＬ ６及肿瘤坏死因子 α（ＴＮＦ α）表达的影响。

结果：纯化得到的杜仲抗菌肽ＥｕＣＨＩＴ１相对分子质量为７７２１０，对白色念珠菌ＭＩＣ值为３２μｇ·ｍＬ－１，ＥｕＣＨＩＴ１质量浓度与抑菌活性之间具有量效关系；ＥｕＣＨＩＴ１可增加白色念珠菌细胞壁的去极化及通透性，降低白色念珠菌细胞壁（１，３） β Ｄ 葡聚糖及麦角甾醇的含量，同时ＥｕＣＨＩＴ１可降低白色念珠菌感染的ＷＴＲＬ１细胞中ＩＬ ６及ＴＮＦ α水平（Ｐ＜０ ０５）。

结论：ＥｕＣＨＩＴ１对白色念珠菌具有抑菌作用，主要机制可能是破坏细胞壁，导致细胞膜去极化、通透性增加，并降低白色念珠菌感染的肺上皮细胞ＩＬ ６及ＴＮＦ α水平。

刘子琦，刘正宇，郭银虹，等. 杂合抗菌肽NK-LPd 的设计、表达及抑菌活性评价[J]. 食品工业科技，2023，44（18）：173−180. doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100277LIU Ziqi, LIU Zhengyu, GUO Yinhong, et al. Design, Expression and Evaluation of Bacteriostatic Activity of Hybrid Antimicrobial Peptide NK-LPd[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(18): 173−180. (in Chinese with English abstract). doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100277· 生物工程 ·杂合抗菌肽NK-LPd 的设计、表达及抑菌活性评价刘子琦1，刘正宇1，郭银虹1，王鸿飞1，姚　波1,2, *（1.重庆科技学院化学化工学院，重庆 401331；2.工业发酵微生物重庆市重点实验室，重庆 401331）摘　要：目的：了解杂合抗菌肽NK-LPd 的抑菌活性，探讨进一步开发潜力。

方法：用两个甘氨酸作接头连接NK-lysin 和Piscidin 的活性片段，生物信息学技术预测杂合抗菌肽的理化性质和功能结构，根据毕赤酵母（Pichia pastoris ）的密码子偏好性优化杂合抗菌肽NK-LPd 基因序列，重叠延伸聚合酶链式反应（gene splicing by overlap extension polymerase chain reaction ，SOE-PCR ）扩增基因并与分泌型表达载体pPIC9K 连接，通过化学法将其转化至毕赤酵母KM71感受态细胞中，经0.5%甲醇诱导表达和亲和纯化后获得杂合抗菌肽NK-LPd ，评价其抗菌活性。

抗菌肽筛选
抗菌肽（AMPs）是一类不同种类的小阳离子肽分子，是多细胞生物进化的古老武器。

筛选抗菌肽的过程一般包括以下几个步骤：
- 筛选：对多种抗菌肽进行活性测试，并在此基础上选取效果较好的几种进行新一轮测试。

- 测试：测试对象包括粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、绿脓杆菌、阴沟肠杆菌和大肠杆菌等病原细菌，观察抗菌肽对这些细菌的抑制能力。

- 分析：对筛选出的抗菌肽的抗菌活性、作用机理和安全性进行分析。

筛选出的抗菌肽作用机制不单一，体现出方法没有特定的偏好性。

抗菌机制转录组学 抗菌机制是生物体对抗微生物入侵的一种保护机制，包括多种生理和免疫反应。转录组学是研究生物体在特定环境中基因表达的全集，通过转录组学的研究可以深入了解抗菌机制的调控网络和分子机制。本文将详细介绍转录组学在抗菌机制研究中的应用，并探讨其在新药研发和抗菌策略设计中的潜在价值。

转录组学是一项通过高通量测序技术获取和分析生物体内全体mRNA（messenger RNA）的研究方法。mRNA是DNA转录和翻译过程中的关键中间产物，可以反映出生物体在特定环境中的基因表达状况。通过转录组学的研究，可以获取大量基因表达数据，并在此基础上分析基因的表达模式、信号通路以及调控网络，从而揭示生物体对不同环境刺激做出的适应性反应和生理功能调控机制。

在抗菌机制的研究中，转录组学可以帮助研究人员发现和鉴定与抗菌反应相关的基因和通路。当生物体受到微生物入侵时，一系列基因的表达会发生变化，从而触发一系列的免疫反应和抗菌机制。通过对转录组数据的分析，研究人员可以发现与抗菌反应相关的基因表达模式，并进一步分析这些基因的功能和相互作用，从而深入了解抗菌机制的分子机制。

近年来，人们利用转录组学在抗菌机制研究中取得了很多重要的进展。例如，在感染病原微生物的早期阶段，一些抗菌蛋白会被转录上调表达，以增强生物体对微生物的抵抗能力。通过转录组学的研究，研究人员发现了许多与抗菌蛋白相关的基因，如抗菌肽和相关调控基因。这些发现有助于我们了解抗菌蛋白在抗菌机制中的作用，并为开发新的抗菌药物提供了潜在的靶点。 此外，转录组学还可用于研究抗菌机制的调控网络。调控网络是一组相互作用和影响基因表达的因子和通路。通过转录组学的研究，可以分析基因的共表达模式，从而揭示出抗菌机制的整体调控网络。例如，研究人员可以通过转录组学的手段发现一些关键的转录因子和信号通路，在抗菌反应中发挥重要作用。通过对这些关键因子和通路的研究，可以揭示出抗菌机制的整体调控网络，并有助于我们寻找新的抗菌靶点。

抗菌肽及其在畜牧业中的应用摘要抗菌肽是阳离子型活性肽，目前发现抗菌肽或类似抗菌肽的小分子肽类广泛存在于昆虫、两栖类、水产动物、哺乳动物及植物中，这种内源性抗菌肽经诱导而合成，在机体抵抗病原的入侵方面起着重要的作用，具有分子量小、热稳定性好、无免疫原性、抗菌谱广等特点。

从抗菌肽的分类、作用机理、应用等几个方面综述了抗菌肽的研究状况及其在畜牧业中的应用。

关键词抗菌肽；作用机理；进展；应用抗菌肽（antibacterial peptides）又称抗微生物肽（peptide antibiotics），是生物体在抵抗病原微生物的防御反应过程中产生的一种具有抗微生物小分子多肽。

1972年，瑞典科学家Boman等首先在果蝇中发现抗菌肽及其免疫功能[1]，随后首先从惜古比天蚕蛹诱导分离到具有抗菌活性的多肽，命名为Cecropins。

迄今为止，已在许多生物中发现300多种这样的内源性抗菌肽，可大致分为4类：cecropins（杀菌肽）、富含Pro残基的magainins（蛙皮素）、富含Gly残基的melittins （蜂毒素）和富含Cys残基的defensins（防御素）。

这些抗菌肽除了具有广谱的抗菌活性外，同时还有高效的抗真菌和（或）抗病毒和（或）原虫和（或）抗肿瘤活性[2-3]。

因此，这些肽类抗菌物质显示了在医学和农业上潜在的研究和应用价值。

1抗菌肽的特点1.1抗菌肽的理化特点抗菌肽的理化性质现已基本清楚，其相对分子质量一般在4KD左右，它是生物先天免疫防卫系统的一个重要组成部分[1]。

多数抗菌肽的相对分子质量低、水溶性好、等电点大于7，表现出较强的阳离子特征。

在家蚕抗菌肽的稳定性试验中发现，家蚕抗菌肽在121℃、1.5×105Pa的高温高压处理30min，抗菌肽仍保持原有活性，说明抗菌肽具有对热稳定的特性[4]。

同时还发现抗菌肽对弱酸弱碱的耐受性较强，但对胰蛋白酶和蛋白酶K非常敏感，易被水解。

1.2抗菌肽的结构特点抗菌肽具有广谱抗菌和其他优良的特性，与它自身的结构特点密不可分。