大鲵皮肤分泌液中抗菌肽的鉴定及生物活性研究王利锋;李学英;王大忠【摘要】目的:鉴定大鲵皮肤分泌液中抗菌肽,研究其部分生物活性.方法:5%醋酸浸提和Sephadex G-50、G-25凝胶过滤色谱等方法分离纯化抗菌肤;采用抑菌圈法检测抗菌活性,Tricine-SDS-PAGE电泳和等电聚焦电泳鉴定其抗菌活性成份.结果:大鲵皮肤分泌液中舍有抗菌活性物质.对革兰阴性菌、革兰阳性菌和真菌均具有较强的抗菌活性;电泳检测显示该小分子多肽相对分子质量约为4300,具有较强的碱性.结论:首次从大鲵皮肤分泌液中分离纯化到一种抗菌肽,此抗菌肽可能是一个具有较强阳离子特征的碱性肽.%Purpose To characterize the antimicrobial peptides from the skin secretions of the Andrias davidianus and to study its bioactivity. Methods This antimicrobial peptide was purified by 5％acetic acid extraction and Sephadex G-50, G-25 gel filtration chromatography. The antimicrobial ability was characterized by inhibiting zone determination. The antimicrobial active substance was identified by tricineSDS-PAGE electrophoresis and isoelectric focusing(IEF) electrophoresis. Results The skin secretions of the Andrias davidianus contain antibiotic active substance. It strongly inhibited Gram-negative, Gram-positive bacteria and fungus. The electrophoresis results showed that its molecular weight was about 4 300 with a strong alkaline property. Conclusion An antibacterial peptide was isolated from the skin secretions of the Andrias davidianus for the first time and this antimicrobial peptide may be a strong feature of the basic peptide cation.【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2011(032)004【总页数】4页(P269-272)【关键词】大鲵;皮肤;抗菌肽;分离纯化【作者】王利锋;李学英;王大忠【作者单位】遵义医学院细胞生物学与遗传学教研室,贵州遵义,563003;遵义医学院细胞生物学与遗传学教研室,贵州遵义,563003;遵义医学院细胞生物学与遗传学教研室,贵州遵义,563003;铜仁学院,贵州铜仁,554300【正文语种】中文【中图分类】R282.74;R961两栖类皮肤湿润、裸露，无疑给外界微生物的侵入提供了便利条件，为了自身生存和适应栖息地多样化生态环境的需要，它们依靠皮肤腺体分泌出一系列抗菌肽，防御外界病原菌的侵袭[1]。
相关研究结果显示，两栖类皮肤抗菌肽呈现出超乎想象的分子和功能的多样性[2-3]。
国内外对于两栖类皮肤抗菌肽的研究主要集中在无尾目两栖类，例如最广泛分布的蛙科(Ranidae)，它们皮肤抗菌肽在种类和数量等方面，都是极其惊人的[4]。
而对于有尾目两栖类，除红瘰疣螈[5](Tylototriton verrucosus)和山溪鲵[6](Batrachuperus)外，目前尚未见文献报道其皮肤分泌液存在抗菌活性物质。
大鲵(Megalobatrachus japonicus daridianus Blanchard)属大型两栖纲有尾目隐鳃鲵科，是我国二级保护动物，有活化石之称。
人们在欧洲、东亚和北美地区发现的大约距今300万至7000万年的大鲵化石暗示其在地球上曾广泛分布[7]。
目前我国大鲵的人工养殖已经实现产业化，为从大鲵皮肤分泌液中提取抗菌肽提供了丰富的资源。
作为现存个体最大的两栖类动物，其皮肤腺发达，在试验中观察到大鲵皮肤在受到理化刺激时能分泌大量白色状黏液，最初呈白浆状，后渐变为黏稠胶状物，具浓涩气味。
本实验对大鲵皮肤分泌液中是否含有抗菌活性物质进行了检测，并鉴定其部分性质，为进一步的研究工作奠定基础。
1 材料1.1 动物和菌种成年大鲵雌雄各一尾，购于贵州锦江娃娃鱼有限公司。
菌种:大肠埃希菌(Escherichia coli)No.ATCC 25922、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)No.ATCC 29213、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)No.ATCC 35984、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)No.ATCC 27853、白色念珠菌(canidia Albicans)No.ATCC 10213、溶血性链球菌(Hemolytic streptococcus)No.CMCC(B)32264，遵义医学院微生物学教研室保藏。
1.2 试剂葡聚糖凝胶SephadexG-50和SephadexG-25，GE Healthcare公司;低相对分子质量(Mr)标准蛋白，北京经科宏达生物技术有限公司;TEMED、Tris、Tricine、丙烯酰胺、过硫酸铵、考马斯亮蓝R-250，美国Sigma公司;BCA法蛋白定量试剂盒，上海碧云天生物公司;营养肉汤培养基、MH(A)培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司。
2 方法2.1 皮肤分泌液的粗提采用电刺激法诱导大鲵皮肤分泌黏液。
按体积比1∶1将收集到的皮肤分泌液用5%乙酸浸提，4℃下搅拌24 h。
12000 r/min离心30 min取上清，用磷酸盐缓冲液调pH至7.2，12000 r/min离心30 min，取上清冷冻干燥，2.2 抗菌肽分离纯化粗提物用注射用水溶解，截留Mr10000的超滤膜4℃下超滤分离，收集Mr大于10000和小于10000两部分溶液，抑菌圈法[7]筛选有抗菌活性的溶液，经 0.45 μm 膜过滤后，Sephadex G-50 凝胶色谱(1.6 cm ×60 cm)分离，用0.05 mol/L 的Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)平衡色谱柱，样品上样后用同样的缓冲液洗脱，流速为2.0 mL/8 min，每8 min收集1管，测定A280nm，绘制洗脱曲线，收集各峰。
同样方法筛选具有较强抗菌活性的峰，冷冻干燥浓缩样品至4.5 mL，再采用相同方法，进行Sephadex G-25凝胶色谱(1.6 cm×60 cm)分离，得到具有抗菌活性的溶液浓缩后4℃保存。
2.3 蛋白质含量检测BCA法蛋白定量试剂盒检测抗菌肽溶液的蛋白质含量，按试剂盒说明书操作。
2.4 电泳鉴定2.4.1 Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分离胶、夹层胶、浓缩胶分别为16.5%，10%和4%的丙烯酰胺凝胶，厚度为0.75 mm，3 种胶长度比例为4∶1.5∶1，阳极缓冲液为0.2 mol/L Tris缓冲液(pH 8.9)，阴极缓冲液为 0.1 mol/L Tris(内含 0.1 mol/L Tricine，0.1%SDS，pH 8.25)溶液。
每孔上样量15 μL，30 V恒压电泳约30 min，当样品进入分离胶时，电压升至100 V约3 h。
2.4.2 等电聚焦电泳按《中国药典》三部(2005版)方法进行，不同之处在于配制凝胶时加入尿素，使最终的电泳胶含33%的尿素。
2.5 抗菌活性检测大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌培养基为MH(A)培养基;溶血性链球菌的培养基为在MH(A)培养基中加入10%的脱纤维羊血;白色念珠菌培养基为沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂培养基(SDA)。
采用抑菌圈法，中央孔加入注射用水作为阴性对照，其中一孔加入相应抗生素为阳性对照，37℃恒温培养18 h(白色念珠菌28℃恒温培养2 d)，观察抑菌圈大小。
抑菌圈10 mm作为样品最小抑菌浓度的检测标准。
2.6 溶血活性检测微量溶血试验评估溶血活性。
取健康人血液用生理盐水洗涤红细胞至上清无色，3000 r/min离心1～2 min，弃上清，用生理盐水配成2%红细胞悬液，将抗菌肽溶液用生理盐水稀释成500，100，50，40，30，20，10 μg/mL 的溶液，加入等体积的2% 红细胞悬液，阳性对照为0.1%TritonX-100，阴性对照为生理盐水，每个样品设3个平行孔，37℃孵育1 h，离心去掉完整的红细胞。
取上清，540 nm波长处测定各管的吸光度值。
2.7 稳定性实验2.7.1 热稳定性实验100 μg/mL抗菌肽溶液分别在 40，50，60，70，80，90，100，121 ℃下处理 10 min，冰浴冷却，以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为试验菌，未处理抗菌肽溶液为对照，测定其抑菌圈直径，每个处理样品重复试验3次，根据抑菌圈直径大小确定其热稳定性。
2.7.2 酸碱稳定性实验100 μg/mL抗菌肽溶液用0.1 mol/L HCl溶液或 0.1mol/L NaOH 溶液调整样品pH 2.5～10.0;室温放置2 h，用磷酸盐缓冲液将样品pH值复调至7.2，未经处理的抗菌肽溶液为对照，以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为试验菌，每个处理样品重复试验3次，根据抑菌圈直径大小确定其酸碱稳定性。
3 结果3.1 大鲵皮肤分泌物中抗菌肽的分离纯化超滤液抗菌活性检测，Mr小于10000的溶液具有明显的抗菌活性。
Sephadex G-50柱色谱分离，得到2个明显的主峰(图1)。
抗菌试验表明，第2个主峰36～89管收集液有明显的抗菌活性。
Sephadex G-25柱色谱分离，得到3个明显的峰(图2)。
抗菌试验表明，第2个峰11～40管收集液有明显的抗菌活性。
图1 Sephadex G-50凝胶过滤色谱结果Fig.1 The result of gel chromatography by Sephadex G-50图2 Sephadex G-25凝胶过滤色谱结果Fig.2 The result of gel chromatography by Sephadex G-253.2 蛋白质含量检测线性回归方程为:A=0.344 C+0.145，r=0.997，根据回归方程计算出抗菌肽溶液蛋白质含量为 0.95 mg/mL。
![一种大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/02e7e171a9956bec0975f46527d3240c8447a103.png)
