实验五琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制

丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用竞争性抑制作用是指，当抑制剂在结构上与底物类似，能与底物竞争酶分子活性中心的结合基团，从而阻碍酶与底物结合。

它是可逆的，抑制作用的强弱取决于抑制剂与底物的相对浓度。

丙二酸对琥珀酸脱氢酶有竞争性抑制作用。

丙二酸的结构和琥珀酸非常相似，可竞争性地与酶的活性中心结合，使其不能与琥珀酸结合。

因此可通过研究不同浓度比例的丙二酸和琥珀酸，观察其对琥珀酸脱氢酶活性的影响。

1实验材料1.1酶提取液实验室提供1.2仪器滴管；玻璃棒；试管6支1.3试剂0.2mol/L琥珀酸；0.02mol/L琥珀酸；0.2mol/L丙二酸；0.02mol/L丙二酸；0.02％甲烯蓝；液体石蜡；蒸馏水2实验方法2.1实验原理琥珀酸经琥珀酸脱氢酶催化，脱氢生成延胡索酸。

在体外隔绝空气条件下，从琥珀酸上脱下的一对氢可由人工受氢体甲烯蓝（蓝色）接受后，被还原成甲烯白。

抑制剂丙二酸竞争琥珀酸脱氢酶的活性中心，阻碍底物与该酶的结合和催化反应，使甲烯蓝褪色的速度变慢。

丙二酸对该酶的抑制程度取决于其与琥珀酸的相对浓度比例。

2.2实验设计2.2.1竞争性抑制作用鉴定取6支试管，按下表操作：试剂\管号 1 2 3 4 5 6酶提取液20 20 20 20 20 - 0.2mol/L琥珀酸10 10 10 - - 10 0.02mol/L琥珀酸- - - 10 10 - 0.2mol/L丙二酸- 10 - 10 - - 0.02mol/L丙二酸- - 10 - 10 -蒸馏水10 - - - - 25 0.02％甲烯蓝 4 4 4 4 4 4各管混匀液体石蜡15 15 15 15 15 15放置室温不断观察各管甲烯蓝褪色置甲烯白（即呈肝匀浆色）的时间，比较各管顺序。

3实验结果记录各管褪色顺序，得下表：管号 1 2 3 4 5 6顺序 1 3 2 5 4 6 1号管中无抑制剂（丙二酸），所以琥珀酸在酶的催化下脱氢，使甲烯蓝褪色速度最快。

3、丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂
浓 度
4、本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔离空气条件下，
以甲烯蓝褪色程度来观察、判断丙二酸对琥珀酸脱氢
酶活性的抑制作用。
琥珀酸脱氢酶
琥珀酸
延胡索酸ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
FAD
FADH2
三、操作步骤：
1、酶提取液的制备 1 g 兔肌肉、剪碎＋海沙（研磨成糜状）
＋12 ml 1/15M磷酸盐缓冲液 (区别于0.1mol/L) （两次，研成糊状）；纱布过滤
２、酶促反应及竞争抑制作用
试剂（滴） １ ２ ３ ４ ５
酶提取液
20 20 20 20 -
0.2 mol/L琥珀酸 4
4
4
-
4
0.02mol/L琥珀酸 -
-
- 4-
0.2 mol/L丙二酸 -
4
-
4
-
0.02mol/L丙二酸 -
-4--
蒸馏水
4
-
-
- 24
0.02%甲烯蓝
2 2 2 22
3、 各管混匀，加石蜡5滴隔绝空气， 37℃水浴
保温，观察褪色情况。（斜执试管，沿壁缓慢加， 不要产生气泡）
四、结果、讨论： 阴性对照
编号 １
２
３
４
５
时间
10min
20min
30min 40min 50min 60min
褪色快
不褪色 褪色缓慢 不褪色 不褪色
五、注意事项：
1 、充分碾磨家兔肌肉，碾磨器械、纱布要及时清 洗，注意回收。
2 、滴加液体石蜡。(实验结束,试管用洗衣粉刷净) 3 、观察结果时不能振摇试管，避免甲烯白重新氧
实验三 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制

琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制[原理]肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶，能催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸。

反应中生成的FADH2可使蓝色的甲烯蓝还原为无色的甲烯白(还原型甲烯蓝)。

丙二酸与琥珀酸的分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，故能与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶的活性中心。

丙二酸与琥珀酸脱氢酶结合后，酶活性受到抑制，则不能再催化琥珀酸的脱氢反应。

抑制程度的大小，随抑制剂与底物两者浓度的比例而定。

本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔绝空气的条件下，通过甲烯蓝的褪色程度来判断琥珀酸脱氢酶的活性，并籍此观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的抑制作用。

CH2COOHCH2 COOH FAD MB•2H（甲烯白）琥珀酸琥珀酸脱氢酶CHCOOHHOOCCH FADH2MB（甲烯蓝）延胡索酸[试剂]1．0.2mol/L琥珀酸: 取琥珀酸钠(MW:270.14)27克加水至500ml。

2．0.02mol/L琥珀酸: 取1液稀释10倍。

3．0.2mol/L丙二酸: 取丙二酸钠(MW:166.05)16.7克加水至500ml。

4．0.02mol/L丙二酸: 取3液稀释10倍。

5．1/15mol/L pH7.4磷酸盐缓冲: 1/15mol/LNa2HPO4溶液80.8ml与1/15mol/LKH2PO419.2ml 混合即成。

（1）1/15mol/LNa2HPO4溶液: 取Na2HPO4.12H2O （MW：358.14）23.876 克, 加水至1000ml。

（2）1/15mol/LKH2PO4溶液:取KH2PO4（MW：136.09）1.814克,加水至200ml.6．0.02％甲烯蓝溶液7．液体石蜡[主要器材]1．新鲜猪心2．玻璃研钵3．漏斗4．手术剪5．棉花6．恒温水浴箱[操作步骤]1．心肌提取液的制备取新鲜猪心约6g，用蒸馏水清洗后剪成碎块，置于研钵中，加入适量净沙，研磨成糜状。

再加1/15mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液12ml，研成糊状，用棉花过滤，滤液即为猪心提取液。

实验十琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制一、实验目的1、掌握竞争性抑制概念及作用机理。

2、了解在无氧情况下观察脱氢酶作用的简单方法。

二、实验原理存在于心肌、骨骼肌、肝脏等组织中琥珀酸脱氨酸，能使琥珀酸脱氢而成延胡索酸，脱下氢可使甲烯蓝退色，还原为甲稀白。

反应如下：草酸、丙二酸等在结构上与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酸的活性中心结合。

若酶已与丙二酸等结合，则不能再与琥珀酸结合而使之脱氢，产生抑制作用，且抑制程度取决于琥珀酸与抑制剂在反应体系中浓度的相对比例，所以这种抑制是竞争性抑制。

本实验通过观察在由不同浓度的琥珀酸与丙二酸组成的反应体系中使等量甲稀蓝退色反应时间，从而验证丙二酸对琥珀酸的竞争性抑制作用。

这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。

三、实验仪器、材料和试剂1、仪器：恒温水浴锅，研钵或组织匀浆机2、材料和试剂（1）新鲜兔肝（2） 0、10mol/L磷酸盐缓冲液（pH7、4）：0、1mol/L NaH2PO419 ml 加0、1mol/LNa2HPO481ml。

（3）0、093 mol/L琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠1、5g溶于100 ml蒸馏水中。

（4）0、10 mol/L丙二酸钠溶液：取丙二酸钠1、5g溶于100 ml蒸馏水中。

（5）0、02%甲稀蓝溶液。

（6）液体石蜡。

四、实验操作新鲜兔肝立即剪碎，放于组织匀浆机中研碎，加入pH7、4的0、10 mol/L磷酸盐缓冲液，制备成200 g/L的肝匀浆液备用。

取五支试管分别编号，按下表配制反应体系：试剂管号0、093 mol/l琥珀酸钠0、10 mol/l丙二酸钠0、10mol/l(pH7、4)磷酸缓冲液肝匀浆液0、02%甲烯蓝11ml2ml1ml3滴21、5ml0、5ml1ml1ml3滴31ml1ml2ml3滴42ml1ml1ml3滴51ml1ml1ml1ml3滴将各管溶液混匀后加一薄层液体石蜡后静置（此时不可摇动!），观察各管中的颜色变化，并记录各管颜色完全变化的时间。

五．实验结果记录
试管1 试管2 试管3 试管4 试管5 试管6 [I]/[S] 0 0.1 1 10 0 0 褪色时间（分钟）
六．注意事项




1、酶提取液的制备应操作迅速，以防止酶活性降 低。 2、加入液体石蜡的作用是隔绝空气，以避免空气 中的氧气对实验造成影响，因此加石蜡时试管壁要 倾斜，注意不要产生气泡。 3、37℃水浴保温过程中，不能摇动试管，避免空 气中的氧气接触反应溶液，使得还原型的甲烯白重 新氧化成蓝色。 4、37℃水浴保温过程中，要注意随时观察各试管 的褪色情况。 5、实验结果结束后，一定要洗干净试管内的液体 石蜡。
二、实验原理
丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀 酸竞争，而和琥珀酸脱氢酶结合。若琥珀酸脱氢酶 已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种 现象称为竞争性抑制。如相对地增加琥珀酸的浓度， 则可减轻丙二酸的抑制作用。
三．器材与试剂


1. 器材 大白鼠、手术剪、镊子、磁盘、匀浆器、 量筒、烧杯、纱布、滤纸、试管及试管架、 恒温水箱、电热水浴锅 2. 试剂 0.2mol/L琥珀酸溶液、0.02mol/L琥珀酸溶 液、0.2mol/L丙二酸溶液、0.02mol/L丙二 酸溶液、1/15mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）、 0.02％甲烯蓝、液体石蜡
四.操作步骤

2.取试管6支，编号，再按下表步骤操作：
0.2mol/L 0.02mol/ 0.2mol/L 0.02mol/L 蒸馏水 甲烯蓝 琥珀酸溶 L琥珀酸 丙二酸溶 丙二酸溶液 （滴） （滴） 液（滴） 溶液（滴） 液（滴） （滴） 8 8 4 8 8 3
酶提 磷酸缓 取液 冲液 (ml) (ml) 试管1 2 试管2 2 -

1.琥珀酸脱氢酶作用及竞争抑制的观察2.紫外分光法测定核酸含量本实验分组为15组，如果为16组，相应材料要增加。

需要的试剂配制方法注意事项1.5%琥珀酸钠溶液7.5g琥珀酸钠→500ml→15小瓶没有琥珀酸钠则用琥珀酸代替后用NaOH调和至PH7.01%丙二酸钠5g丙二酸钠→500ml→15小瓶没有丙二酸钠则用丙二酸代替后用NaOH调和至PH7.00.02%甲稀蓝0.1g甲稀蓝→500ml→15小瓶（棕色瓶）甲稀蓝别名亚甲酰蓝1/15mol/L Na2HPO4 23.6g Na2HPO4 →2000ml→15大瓶石蜡油可以不用分装每个房间在水浴锅前放1个核酸称一定量的小牛胸腺DNA融入0.1%的NaOH5-50ug/mL浓度羊的心脏切碎成小块大约2g左右提前购买，将皮、脂肪处理掉分割后放在冰箱里石英砂均匀的撒在上面注：每三个人一组，分为15组。

如果人数多可以适当多分几瓶试剂。

所需仪器所需数量40ml试剂瓶4560ml试剂瓶15试管4x152x15 共90个移液管（优先10ml的本次用5ml移液管）15研钵15种类数量心脏提取液151.5%琥珀酸钠151%丙二酸钠150.02%甲稀蓝15蒸馏水15液体石蜡 2胶头滴管共77个紫外吸收法测定核酸含量1、实验目的：1.掌握紫外吸收法测定核酸含量的原理2.掌握利用紫外线分光度计测定核酸含量二、实验原理：DNA和RNA都有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在260nm波长处紫外线吸收是嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（－C＝C一C＝C 一），能够强烈吸收250~280nm 波长的紫外光。

等书上112页三、实验试剂与器材DNA样品紫外分光光度计四、实验步骤1.取DNA样品5ml，于紫外分光光度计上测定260nm与280nm处的OD值按下式按下式计算核酸浓度计算核酸浓度 DNA的质量浓度(mg/l)=OD260nm/0.020xL x稀释倍数计算核酸纯度=OD260nm/OD280nm2.取DNA样品5ml，沸水浴中加热5min于紫外分光光度计上，测260nm处的OD值比较DNA前后吸光度OD的差异。

［］ ２ 查锡 良， 周春燕． ０ ８ 生物化学 （ ７版 ） 北京 ： 民卫生 出版 ２０． 第 ． 人
社
［］ ３ 贾弘裎． ０５ 生物化学． ２０ ． 北京 ： 人民卫生出版社 ， ９ １ ８ ［］ ４ 杨光彩 ， 肖应庆 ， 方振伟．０ １ 生物化学 实验指导． ２０ ． 广州 ： 华南 理
工 大 学 出 版 社 ，６ ９
室外拿小盆盛 雪 以备用 ， 避免 了 因冰块 和试 管接 触面
积减少所造成 对酶 活性 的影 响 ， 这样 不 但能 提高 学生 对 实验操作 的兴趣 ， 而且增 强他们的求 知欲 ； 实验时 ④ 取心、 、 肝 骨骼肌 由原来 的 ５ 减少到 ３ ， ｇ ｇ制备 的酶液足
一
丙 二酸是琥珀酸脱 氢酶 的竞 争性 抑制 剂 ， 如果有 丙 二酸存在时 ， 酶 的活 性受 到抑 制 。丙 二酸 与琥 珀 此
酸 脱氢酶 的亲和力 远大 于琥 珀酸本 身 对它 的亲和 力 ，
因此 抑制作 用很 强 ｌ 。心 肌 、 、 骼肌 等 组织 细胞 － ５ Ｊ 肝 骨
中的琥 珀酸脱 氢酶 ， 能催化琥 珀酸脱氢 生成延胡索 酸 ， 脱 下的 ２ Ｈ由辅基 Ｆ Ｄ接受还 原成 Ｆ Ｄ ２ 然后依 次 Ａ ＡＨ ， 通 过泛醌 、 细胞 色 素体 系将 ２ 传 递 给 氧生 成 水 ［］ Ｈ ６。 实验 中用 甲烯蓝 （ Ｂ 为受 氢体 。在 隔绝 空 气 的条 Ｍ ） 件下脱下 的氢被蓝色的 甲烯蓝 接受 还原成无色 的 甲烯
用［ 。 引
３ 结 果 与 分 析
１ 号管在 ３ ℃恒温 时颜 色消 退最 快 ， 明酶 的活 ７ 说 性最强 ； ５号管 同样在 ３ ￣恒 温但加 的是煮沸后 的酶 ， ７Ｃ 颜 色不变 ， 说明酶没有 活性 ； ２号管 由于含 有丙二 酸抑 制剂 ， 以褪色 比 １ 管慢 ； 所 号 ３号管 由于没有加 入琥 珀 酸脱氢酶 ， 颜色不变 ； 管褪色速度 介 于 １ 和 ２号 ４号 号 管之间 ， 为反应液 中含有丙二酸抑制 剂 ， 并且 在抑制 剂浓度相 同的条件 下 ， 管底 物 浓度 比 ２号 管 增 大 ４号

【生物化学实验】丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑
制作用
琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂有很多，其中最常见的有丙二酸、草酸等。

因为丙二酸、草酸等的抑制剂与琥珀酸的分子结构十分相似，故能与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶的活性中心，丙二酸、草酸与琥珀酸脱氢酶的活性中心结合后，其酶的活性受到抑制，则不能再催化琥珀酸。

受抑制程度的的大小，随着抑制剂与底物两者浓度的比例而定。

琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，在体内，琥珀酸脱下的两个氢电子传递链传递，最后与氧结合生成水，并释放出能量。

实验三琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察一、基本原理脱氢酶的作用在于激活并脱下底物上的氢，使之通过一系列传递体最后传给氧而生成水。

在缺氧的条件下，适当的受氢体也可接受脱氢酶从底物上脱下的氢。

因此，选用适当的受氢体便可以观察到脱氢酶的作用。

琥珀酸脱氢酶能使琥珀酸脱氢生成延胡索酸，并将脱下的氢交给受氢体。

当在缺氧的条件下用甲烯蓝（美蓝，蓝色物质）作为受氢体时，甲烯蓝被氢还原生成甲烯白（美白，无色物质），其反应如下：CH2—COOH 琥珀酸脱氢酶HC—COOH| + MB ——————→‖+ MB·2HCH2—COOH 无氧条件HOOC—CH琥珀酸甲烯蓝(兰色)延胡索酸甲烯白(无色)根据这种蓝色转变为无色的变化过程，就可以判断出琥珀酸脱氢酶起了催化作用。

丙二酸的结构与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞相结合琥珀酸脱氢酶的活性中心，从而抑制该酶的活性，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。

这种抑制作用即属酶的竞争性抑制作用。

试剂及器材二、试剂及器材1．1.5% (w/v)琥珀酸钠溶液： 2．1% (w/v)丙二酸钠溶液：3. 0.02% (w/v)甲烯蓝溶液4. 1/15mol/L Na2HPO4溶液：5. 液体石蜡油6 手术剪,镊子7．研钵,净细砂8．恒温水浴锅, 酒精灯9．离心机及离心管10. 刻度吸管和滴管三、操作步骤1.猪心脏提取液的制备：(1)称取新鲜猪心脏1.5—2g放置研钵中剪碎；(2)加入等体积的净细砂1/15mol/LNa2HPO4溶液3—4 ml，然后将之研磨成匀浆；(3)再加入1/15mol/L Na2HPO4溶液6—7ml，放置30min，不时摇动；(4)于2000rpm离心10min，取上清备用。

2.取4支试管，按下表编号操作：2_52010421555103225_55(煮沸)2225_5510.02% 甲烯蓝（滴）蒸馏水（滴）1%丙二酸钠（滴）1.5%琥珀酸（滴）心脏提取液（滴）试管号3.加好试剂后混匀，然后立即在各试管中加入一层（约5－10滴）液体石蜡油。

琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
一、实验原理
在化学结构上与底物类似的抑制剂，能与底物竞争酶分子的活性中心，从而抑制酶的活性。

抑制程度随抑制剂浓度的改变而改变。

如果底物浓度不变，酶活性的抑制程度随抑制剂浓度的增加而增加。

反之，如抑制剂浓度不变，则酶活性随底物浓度增加而逐渐回复，这种类型的抑制称竞争性抑制。

琥珀酸脱氢酶是一种含铁的黄酶，它可以催化琥珀酸脱氢酶，生成延胡索酸，在有氧的情况下，脱下的氢经呼吸链的传递，与氧化合成水。

肝中含有丰富的琥珀酸脱氢酶，体外实验在隔绝空气的情况下，琥珀酸脱下的氢可被人工受氢体一甲烯蓝接受还原成甲烯白。

因此我们可以用甲烯蓝被还原褪色的速度和程度，来了解不同底物浓度，不同抑制剂浓度时酶活性的改变。

二、实验步骤与结果
2.将上述各试管摇匀，于夜面上加液体石蜡10滴，放37℃水浴中保温，随时比较，观察
各试管颜色变化。

3.结果
经观察，各个试管的褪色时间顺序为：1>4>2>3
三、结论
底物浓度、抑制剂浓度影响了酶的竞争性。

琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制实验报告的心得体会
琥珀酸脱氢酶（SDH）是一种酶,参与生物体内的三羧酸循环。

SDH的主要功能是将琥珀酸氧化为富能的丙酮酸和二氧化碳,为细胞提供能量。

SDH的活性受到一些物质的影响,例如甲肝灵等药物就可以抑制SDH的活性。

竞争性抑制实验是在SDH的底物琥珀酸中加入不同浓度的抑制剂,观察SDH的活性变化。

实验的结果可能呈现出以下几个情况：抑制剂呈现剂量依赖性的抑制作用,活性呈线性的降低；抑制剂对SDH的抑制作用存在饱和点,但达到饱和点后,SDH的活性降低幅度逐渐增加；抑制剂对SDH的抑制作用存在饱和点,但在饱和点后活性降低趋于不变。

实验者可以通过这些结果,得到抑制剂的半数抑制浓度（IC50）,进而评价抑制剂的效果。

在实验中,我们观察到抑制剂呈现剂量依赖性的抑制作用,且具有饱和点。

这说明抑制剂与SDH结合的速度是有限的。

从实验结果中可以看出,IC50值比较低,这表明抑制剂的效果比较好。

实验结果为我们提供了有关SDH的一些基本信息,也有助于我们更好地理解如何控制相关疾病,比如心肌缺血。

在这个实验中,我深刻认识到了科学研究的重要性,同时也学会了如何进行实验和如何分析实验结果。

这些经验对于我的学习和未来的研究都有一定的启示作用。

琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制目的与要求：了解琥珀酸脱氢酶的作用及酶促反应中的竞争性抑制作用实验原理：肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶，能催化琥珀酸脱氢转变为延胡索酸（三羧酸循环，线粒体）。

反应中生成的FADH2可使甲烯蓝还原为甲烯白。

丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，与琥珀酸的分子结构相似，与酶的亲合力高。

丙二酸与酶结合后，酶活性受到抑制，则不能催化琥珀酸的脱氢反应。

本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔离空气条件下，以甲烯蓝褪色程度来观察、判断丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的抑制作用。

操作步骤：酶提取液的制备酶促反应管的制备37℃酶促反应，观察甲烯蓝褪色程度实验结果：间隔10分钟，记录各管甲烯蓝褪色程度，解释结果。

注意事项：充分碾磨家兔肌肉，碾磨器械、纱布要及时清洗。

滴加液体石蜡时，倾斜试管，避免产生气泡。

观察结果时不能振摇试管，避免甲烯白重新氧化变蓝。

改良Mohum法测定谷-丙转氨酶活性目的与要求：了解Mohum法测定谷-丙转氨酶活性的原理及测定方法实验原理：利用丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，在转氨酶作用下生成丙酮酸和谷氨酸，再利用2 4-二硝基苯肼与丙酮酸反应，生成棕色的丙酮酸二硝基苯肼，在520nm波长测定其光密度，与经同样处理标准丙酮酸溶液比较，即可计算谷-丙转氨酶的活性。

血清谷-丙转氨酶活性单位定义：每毫升血清在pH值7.4，37℃保温条件下与底物作用30min后，每生成2.5ug 的丙酮酸为1谷-丙转氨酶单位，正常值为2-40单位/ml。

实验步骤：见书Page 77酶活性测定表格。

实验结果：谷丙转氨酶活性单位A测定管/A标准管标准管中丙酮酸含量10/2.5。

注意事项：保温温度和时间要精确，即谷丙转氨酶发挥催化作用环境。

酶活性单位。

微量移液器的使用。

..。

各管置于37℃水浴箱中保温10-15分钟，随时观察各管的颜
色变化并记录结果。
管 号
1 2 3 4
七、注意事项
1、加试剂前一定要将试管清洗干净
2、加入液体石蜡后就不要再摇动试管。避免 空气中的氧接触反应溶液，使得还原型的甲 烯白重新氧化成蓝色 3、37℃水浴保温过程中，要注意随时观察各 试管的褪色情况
一、实验目的
1、通过实验证明组织中存在琥珀酸脱氢酶 2. 验证丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂
* 竞争性抑制的特点 (1) I 与 S结构类似，竞争酶的活性中心 (2) E 既可以结合 S 也可以结合 I, 但是不能同时结 合两者 (3) I 与 E的活性中心结合后, E 分子失去催化活性 (4) 抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及 底物浓度
CH CH COOH
延ห้องสมุดไป่ตู้索酸
+
MBH 2
还原性亚甲蓝（无色）
丙二酸与琥珀酸分子结构相似，能竞争
性抑制琥珀酸脱氢酶。通过观察在由不
同浓度的琥珀酸与丙二酸组成的反应体
系中使等量亚甲蓝退色的程度，从而鉴
定丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用和
抑制程度。
当抑制剂浓度较低时
随着抑制剂浓度的增高
当抑制剂浓度高达一定程度
二、实验原理 竞争性抑制作用
琥珀酸在琥珀酸脱氢酶催化下脱氢生成延
胡索酸，脱下的氢被受氢体接受。本实验 用亚甲蓝（MB）作为受氢体，蓝色亚甲蓝 接受琥珀酸脱下的氢由蓝色还原成无色的 甲烯白（MBH2）。
COOH CH2 CH2 COOH
琥珀酸 亚甲蓝（蓝色）
COOH + MB
琥珀酸脱氢酶 丙二酸（-）
六、实验结果

• 2．血清制备：
采血后室温下自然凝固后即析出血清。 • 冬季，采血后37℃水浴30min，可加快凝固。 • 或将全血置4℃冰箱3-4h，再以1500～2000rpm 离心15’
，上清液即为血清。
• 3．无蛋白血滤液制备 • 方法：
• ①使蛋白质脱水沉淀：常用甲醇、乙醇、丙酮等有机试剂或（ NH4）2SO4、Na2SO4，NaCl等中性盐类沉淀。
置37 ℃ 和沸水浴，30min 内观察各管颜色变化
结果：各试管颜色由蓝变白速度快慢依次为：？
原因分析：1号？2号？3号？4号？
注意事项：
• 1> 心脏一定要充分研磨至糊状，使琥珀酸脱氢酶尽量释 放到溶液里
• 2> 离心时注意离心管一定要精确平衡，并将重要相等的 离心管对称放置
• 3> 离心结束后拿取离心管时动作要轻柔，不要振荡离心 管，以免糜液重新变浑浊
实验器材与试剂：
（二）器材
研钵、手术剪、手术镊子 2 mL 移液管 1000 uL微量可调仪器 10 mL 离心管 低速离心机等
实验操作：
1. 琥珀酸脱氢酶酶液的制备
剪碎，
3-4ml 1/15mol/L Na2HPO4 1 g 猪心
匀浆
6-7ml, 1/15mol/L Na2HPO4
放置20min
三、实验报告要求： • 原理
琥珀酸脱氢酶催化的反应、酶的竞争性抑制作用、本实验脱氢 酶活性观察的原理。
• 操作（用表格表示） • 结果 • 结果说明
思考题：
• 1: 为什么反应开始后，反应液必须静止，不能再 摇动?
• 2：抑制剂还可以选用什么物质？ • 3：利用本实验的数据，说明酶竞争性抑制的特点？
• ②有机酸沉淀剂：常用的有苦味酸，钼酸、磷钨酸、水杨酸及三 氯醋酸等。（PH要稍低于Pr.等电点）

琥珀酸脱氢酶的作用及丙二酸的抑制作用【目的】1 ．掌握琥珀酸脱氢酶作用及丙二酸抑制作用的实验技术与原理。

2 ．深化理解酶的竞争性抑制作用的特点。

【原理】肌肉组织含有的琥珀酸脱氢酶是一种结合蛋白酶，以 FAD 为辅基。

它能催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸， FAD 接受氢生成FAD·2H 。

体外实验以美蓝 ( 甲烯蓝 ) 为受氢体，使美蓝还原生成美白 ( 甲烯白 ) 。

其反应如下：琥珀酸脱氢酶活性越高，美蓝脱色所需的时间越短，由于美白易被空气中的氧氧化成美蓝。

故实验需在无氧条件下进行，可加一层液体石蜡以隔绝空气。

丙二酸与琥珀酸的化学结构很相似，能和琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酶结合，从而抑制琥珀酸的脱氢作用。

其抑制程度与抑制剂和底物二者的浓度有关。

本实验通过不同浓度的琥珀酸和丙二酸来观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用。

【器材】1 ．研钵与剪刀2 ．漏斗3 ．纱布4 ．恒温水浴【试剂】1 ． 0.2mol/L 琥珀酸溶液2 ． 0.02mol/L 琥珀酸溶液3 ． 0.2mol/L 丙二酸溶液4 ． 0.02mol/L 丙二酸溶液以上四种溶液均先用 5mol/L NaOH 溶液调至 pH7.0 ，再用 0.01mol/L NaOH 溶液调至 pH7.4 。

直接用琥珀酸钠或丙二酸钠配制亦可。

5 ． 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液（ pH7.4 ）1/15mol/L Na 2 HPO 4 80.8ml 与 1/15mol/L KH 2 PO 4 19.2ml 混匀即可。

6 ． 0.02% 美蓝溶液7 ．液体石蜡【操作】1 ．肌肉提取液的制备取用蒸馏水清洗过的新鲜动物肌肉组织约 10g ，置于研钵（或匀浆器）中，研磨成糜状，然后每克肌肉组织加 4 倍体积的冰冷的 pH7.4 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液，混匀，用双层纱布过滤，取滤液备用。

2 ．酶促反应取试管 5 支，编号，按下表操作。

将上述各试管液混匀后，沿各管壁加入液体石蜡 5 ～ 10 滴，使其在液面形成一薄层以隔绝空气。

一、实验目的1. 理解琥珀酸脱氢酶在细胞代谢中的作用。

2. 掌握琥珀酸脱氢酶的活性测定方法。

3. 观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。

二、实验原理琥珀酸脱氢酶（SDH）是三羧酸循环（TCA循环）中的一个关键酶，其主要功能是催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，同时将脱下的氢传递给电子传递链。

本实验采用比色法测定琥珀酸脱氢酶的活性，通过观察甲烯蓝的脱色时间来反映酶的活性。

丙二酸作为竞争性抑制剂，其化学结构与琥珀酸相似，可以与琥珀酸竞争酶的活性中心，从而抑制琥珀酸脱氢酶的活性。

三、实验材料与仪器实验材料：1. 大肠杆菌2. 琥珀酸钠3. 甲烯蓝4. 磷酸缓冲液5. 丙二酸溶液6. 液体石蜡实验仪器：1. 试管2. 吸量管3. 电热水浴锅4. 恒温水浴箱5. 移液器四、实验步骤1. 菌液制备：将大肠杆菌接种于斜面培养基，37℃培养24小时，用无菌移液器取菌苔，加入5ml磷酸缓冲液，振荡混匀后，在离心机上以2500 r/min离心5分钟，弃去上清液，加入6ml磷酸缓冲液重悬菌体。

2. 酶活性测定：a. 取试管3支，分别编号为A、B、C。

b. 向A管中加入1ml菌液，B管中加入1ml菌液和1ml丙二酸溶液，C管中加入1ml菌液和1ml磷酸缓冲液。

c. 向各管中加入0.5ml琥珀酸钠和1ml甲烯蓝溶液。

d. 将试管放入恒温水浴箱中，在37℃下保温5分钟。

e. 将各管取出，立即在离心机上以5000 r/min离心5分钟，取上清液。

f. 用分光光度计在波长620nm处测定各管的吸光度值。

3. 计算酶活性：a. 计算A管和C管的平均吸光度值。

b. 计算A管和C管的吸光度比值。

c. 根据标准曲线计算琥珀酸脱氢酶的活性。

五、实验结果与分析1. 通过实验，成功制备了大肠杆菌菌液，并测定了琥珀酸脱氢酶的活性。

2. 加入丙二酸溶液的B管与未加丙二酸溶液的C管相比，吸光度值明显降低，说明丙二酸对琥珀酸脱氢酶具有竞争性抑制作用。

3. 通过计算，得出琥珀酸脱氢酶的活性为X单位。

实验五琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制【实验目的】1、掌握竞争性抑制概念及作用机理。

2、了解在无氧情况下观察脱氢酶作用的简单方法。

【实验原理】存在于心肌、骨骼肌、肝脏等组织中琥珀酸脱氨酸，能使琥珀酸脱氢而成延胡索酸，脱下氢可使甲烯蓝退色，还原为甲稀白。

反应如下：草酸、丙二酸等在结构上与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酸的活性中心结合。

若酶已与丙二酸等结合，则不能再与琥珀酸结合而使之脱氢，产生抑制作用，且抑制程度取决于琥珀酸与抑制剂在反应体系中浓度的相对比例，所以这种抑制是竞争性抑制。

本实验通过观察在由不同浓度的琥珀酸与丙二酸组成的反应体系中使等量甲稀蓝退色反应时间，从而验证丙二酸对琥珀酸的竞争性抑制作用。

【实验用品】1、试剂（1）0.10mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）:0.1mol/L NaH2PO419ml 加0.1mol/LNa2HPO481ml。

（2）0.093mol/L琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠1.5g溶于100ml蒸馏水中。

（3）0.10mol/L丙二酸钠溶液：取丙二酸钠1.5g溶于100ml蒸馏水中。

（4）0.02%甲稀蓝溶液。

（5）液体石蜡。

2、器具（1）0.10mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）：0.1mol/L NaH2PO419ml加0.1mol/LNa2HPO481ml。

（2）0.93mol/L琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠1.5g溶于100ml蒸馏水中。

（3）0.10mol/L丙二酸钠溶液：取丙二酸钠1.5g溶于100ml蒸馏水中。

（4）0.02%甲烯蓝溶液。

（5）液体石蜡。

2、器具（1）恒温水浴箱（2）研钵或组织匀浆机【实验操作】新鲜免肝立即剪碎，放于组织匀浆机中研碎，加入pH7.4的0.10mol/L磷酸盐缓冲液，制备成200g/L的肝匀将各管溶液混匀后加一薄层液体石蜡后静置（此时不可摇动!），观察各管中的颜色变化，并记录各管颜色完全变化的时间。

【思考题】1、抑制的分类及其特点？2、本实验中液体石蜡起什么作用?3、各管中的反应体系配好后为什么不能再摇动?4、制备肝浆时用磷酸缓冲液，可否换用蒸馏水，为什么？。