POD活性测定

POD 、PPO 活性测定试剂：磷酸缓冲液（代号PBS ）配制A ：Na 2HPO 4•12H 2O 17.91g 加水 1000ml 定容B ：NaH 2PO4•2H 2O 7.8g 加水 1000ml 定容 0.05mol ·l -1PH6PBS 123mlA+877mlB 1000ml 定容即可 0.05mol ·l -1 PH7.8 915 ml A+ 85mlB 1000ml1%PVP （聚乙烯吡咯烷酮） 10gPVP ——加PBSPH7.8——1000ml （用来提取酶液）②愈创木酚（即0.02mol ·l -1邻甲氧基苯酚） ③30%H 2O 2④25mmol ·l -1焦性没食子酸（焦培酸）POD 反应液：取50ml0.05mol ·l -1PH6PBS 加入 28μl （愈创木粉）加入19μl30%H 2O 2 棕色瓶PPO 反应液：取50ml0.05mol ·l -1PH6PBS 加入 100μl 焦培酸 棕色瓶酶液提取：称取0.5g 样品放入研钵，分三次共加8ml1%PVP 冰浴研磨 全部倒进离心管 放进离心机 4℃、10000r ·min 离心15min →取上清夜备用（1）POD 测定：3ml 反应液μl 酶液 混匀 A470比色 (以反应液做对照) 每一分钟记录一次计算：POD 活性（U ·g -1FW ·min -1）=OD470×N 总体积/t ×n ×w ×0.01（2）PPO 测定：3ml 加入 100μl 酶液 混匀 30℃水中15min A420比色(以反应液做对照)计算：PPO 活性（U ·g -1FW ·min -1）=OD420×N 总体积/t ×n ×w ×0.001（反应液调零点，一个酶单位u 定义为0.001A 值变化）POD 、PPO 、多酚氧化酶的测定试剂：磷酸缓冲液（代号PBS ）配制A ：Na 2HPO 4•12H 2O 17.91g 加水 1000ml 定容B ：NaH 2PO4•2H 2O 7.8g 加水 1000ml 定容 0.05mol ·l -1PH6PBS 123mlA+877mlB 1000ml 定容即可 1%PVP （聚乙烯吡咯烷酮） 1gPVP 100ml 定容②愈创木酚（即0.05 mol ·l -1邻甲氧基苯酚）:取0.6208 g 的愈创木酚定容到100ml 容量瓶摇匀即可③0.1mol/LH2O2 5.68ml 稀释至1000ml ④25mmol ·l -1焦性没食子酸（焦培酸）⑤0.1mol/L 儿茶酚溶液：取0.5506克儿茶酚溶于50毫升蒸馏水中，定容摇匀即可。

一、实验目的了解过氧化物酶（POD）在植物生理学中的重要作用，掌握测定POD活性的方法，并分析不同因素对POD活性的影响。

二、实验原理过氧化物酶是一种广泛存在于植物组织中的酶，能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水（H2O）和氧气（O2）。

在实验中，通过测定在一定时间内POD分解H2O2产生氧气的量，来评价POD的活性。

反应方程式如下：2H2O2 → 2H2O + O2本实验采用愈创木酚法测定POD活性。

愈创木酚在POD催化下被氧化，生成对苯醌，进而与氯化铁形成紫色络合物，通过测定紫色络合物的吸光度变化来反映POD的活性。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 植物叶片（如马铃薯、菠菜等）- 过氧化氢（H2O2）- 愈创木酚- 氯化铁- 磷酸氢二钠（Na2HPO4）- 磷酸氢钠（NaH2PO4）- pH计- 离心机- 分光光度计- 研钵- 试管- 移液器- 电子天平2. 实验试剂：- 0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）- 0.1 M H2O2溶液- 0.5 M愈创木酚溶液- 0.1 M氯化铁溶液四、实验步骤1. 酶液提取：将植物叶片洗净、剪碎，加入预冷的磷酸盐缓冲液，在研钵中研磨成匀浆。

将匀浆液转移至离心管中，4℃、12,000 rpm离心10分钟，取上清液即为酶液。

2. 测定酶活性：取5支试管，编号为1-5，分别加入以下试剂：- 空白组：0.1 M磷酸盐缓冲液1.0 mL、0.1 M H2O2溶液1.0 mL、0.5 M愈创木酚溶液1.0 mL- 实验组：0.1 M磷酸盐缓冲液1.0 mL、0.1 M H2O2溶液1.0 mL、0.5 M愈创木酚溶液1.0 mL、酶液0.1 mL将各试管混匀，置于37℃恒温水浴中保温5分钟。

取出试管，立即放入冰浴中终止反应。

使用分光光度计在波长560 nm处测定各试管吸光度。

3. 计算酶活性：以空白组吸光度为基准，计算各实验组吸光度变化值（ΔA）。

根据下列公式计算酶活性：酶活性（U/g·min）= ΔA × 0.05 × 10^3 / 酶液浓度五、结果与分析1. 不同植物叶片POD活性比较：实验结果显示，不同植物叶片的POD活性存在差异。

叶绿素含量采用无水乙醇的方法测定超氧化物歧化酶SOD活性采用邻苯三酚自氧化法测定过氧化物酶POD活性采用愈创木酚法测定过氧化氢酶采用过氧化氢法测定丙二醛采用硫代巴比妥酸法测定蛋白质含量采用考马斯亮蓝法每次测定重复3次，取平均值测定方法一．SOD，CAT及POD活性的测定分别取0.4ｇ材料于预冷的研钵中，加入8 ml预冷的50 mmol-1磷酸缓冲液（pH 7.8）（甲液：取Na2HPO4 35.9g，加水溶解，并稀释至500mL 乙液：取NaH2PO4 2.76g，加水溶解，并稀释至100mL 取上述甲液91.5mL和乙液8.5mL，混合摇匀即得。

先加2ml, 在冰浴下研磨成匀浆后，将匀浆转入10ml离心管，再用6ml冲洗），10000 rpm离心15 min，取上清液定容至10ml后于4℃保存。

上清液用于可溶性蛋白质含量、SOD活性及POD活性的测定。

SOD活性测定1.显色反应取5mL指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按表47–1加入各溶液。

混匀后，给1支对照管照上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光，与其他各管同时置于4000lx日光灯下反应20-30 min(要求各管照光情况一致，反应温度控制在25～35℃之间，使酶活性高低适当调整反应时间)。

当样品数量较大时，可在临用前根据用量将表47–1中各试剂(酶液和核黄素除外)按比例混合后一次加入2.65mL，然后依次加入核黄素和酶液，使终浓度不变。

液蒸馏水0.5总体积 3.33.SOD活性测定至反应结束后，用黑布罩盖上试管，终止反应。

以遮光的对照管作为空白，分别在560nm 下测定各管的OD值，计算SOD活性。

3.<结果计算>已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。

SOD总活性[u/g(FW)]=式中：SOD总活性以酶单位每克鲜重表示。

比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。

pod酶活性测定实验报告一、实验目的过氧化物酶（Peroxidase，POD）广泛存在于植物体内，与植物的呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系。

本实验旨在掌握测定 pod 酶活性的原理和方法，了解其在植物生理过程中的作用。

二、实验原理POD 催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物。

本实验采用愈创木酚作为氢供体，在 POD 作用下，H₂O₂将愈创木酚氧化成红棕色的 4 邻甲氧基苯酚。

反应液颜色的深浅与 POD 活性呈正相关。

通过测定反应液在 470nm 处的吸光度变化，可计算出 POD 的活性。

三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜植物叶片（如菠菜叶）2、实验试剂（1）005mol/L 磷酸缓冲液（pH 55）（2）005mol/L 愈创木酚溶液（3）2% H₂O₂溶液（4）20% 三氯乙酸溶液3、实验仪器（1）分光光度计（2）离心机（3）恒温水浴锅（4）研钵（5）移液器（6）容量瓶（7）试管四、实验步骤1、酶液提取称取 2g 新鲜植物叶片，剪碎后放入研钵中，加入适量 005mol/L 磷酸缓冲液（pH 55），研磨成匀浆。

将匀浆全部转入离心管中，在 4℃下以 10000r/min 离心 20min，上清液即为酶提取液。

2、反应体系配制在试管中依次加入 3mL 005mol/L 磷酸缓冲液（pH 55）、1mL 005mol/L 愈创木酚溶液、1mL 2% H₂O₂溶液，混合均匀，作为反应混合液。

3、酶活性测定取 2 支试管，分别标记为“测定管”和“对照管”。

向测定管中加入1mL 酶提取液和 3mL 反应混合液，立即摇匀，迅速放入 37℃恒温水浴锅中保温 15min。

同时向对照管中加入 1mL 经 20% 三氯乙酸溶液灭活的酶提取液和 3mL 反应混合液。

4、终止反应保温 15min 后，迅速向测定管和对照管中各加入 1mL 20% 三氯乙酸溶液，终止反应。

5、测定吸光度以对照管为空白，在 470nm 波长下测定测定管的吸光度（A₄₇₀）。

过氧化物酶（POD ）活性测定【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H 202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。

【实验试剂】 愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液[100mmol/L 磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL ，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL ，混合均匀保存在冰箱中]【方法步骤】（1）、粗酶液的提取 称取小麦叶片0.25g ，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL ，于研钵中研成匀浆，以4000r/min 离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL 提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。

（2）、酶活性的测定 取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL ，KH2PO41mL ，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL ，稀释后的酶液1mL （如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm 波长下测量OD 值，每隔1min 读数一次（4min ）。

以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD 值增加0.01定义为一个活力单位。

表1 紫外吸收法测定POD 酶活性配置表4.结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]表示之。

也可以用每 min内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。

POD 总活性[u/g(FW)]=式中：POD 总活性以酶单位每克鲜重表示。

其中 △470=ACK-AE比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。

ACK ——照光对照管的吸光度。

AE ——样品管的吸光度。

Vt ——样品液总体积，mL 。

可见光的范围350-770，紫外A 400-315nm，B 315-280nm，C 280-190nm酶活单位=△ODmg一1·FW·min一11. POD活性测定：称取组织1g放于研钵中，加5mL0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH5.5）在冰浴中研磨成匀浆。

将匀浆全部转入离心管中，在3000rpm，4℃条件下离心10min，上清液为酶粗提液，4℃保存备用。

取酶液100μL，加反应混合液1. 2.9ml 0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH5.5)2. 1mL 0.05mol/L愈创木酚溶液，0.05mol/L愈创木酚溶液,0.06207g愈创木酚定容10ml3. 1.0 ml 2%H2O2, 30% H2O2670μL，加水至10ml.在37℃水浴中混合均匀，于470nm处测定其吸光度，连续记录3min。

以不加酶的反应混合液作对照，每30秒钟读一次数，以每分钟吸光度值变化值0.01为一个酶活单位。

酶活计算: OD290。

g- 1.FW.h- 1=OD变化值/材料鲜重/反应时间POD的酶活性增加倍数与抗病性呈正相关2. CAT活性测定：设置两个重复一个对照,测定体系包括1. 0.2 ml酶液、2. 1.5 ml磷酸缓冲液pH7.0、3. 1 ml蒸馏水，4. 25℃预热后逐管加入300μL 0.1 mol/L的H2O2 (30% H2O256.8μL加水至10ml.)在240 nm下测定吸光度，每隔1 min读一次，共测3 min，以1 min内减少0.1的酶量为1个酶活单位。

3. SOD活性的测定：采用改进的高灵敏度的氯化硝基氮兰四唑（NBT）光还原法测定SOD活性。

每处理取3个小烧杯，分别加入3mLSOD反应液（参照附录B），A）0.lmol/L pH7.8磷酸缓冲液准确称取0.72gNa2HPO4·12H2O溶于20ml水中取18.3mL；准确称取0.312gNaH2PO4·2H2O 溶于20mL水中取1.7mL，混合并定容至20mL。

POD、PPO活性测定：POD 、PPO 活性测定试剂：磷酸缓冲液（代号PBS ）配制A ：Na 2HPO 4?12H 2O 17.91g 加⽔ 1000ml 定容B ：NaH 2PO4?2H 2O 7.8g 加⽔ 1000ml 定容 0.05mol ·l -1PH6PBS 123mlA+877mlB 1000ml 定容即可 0.05mol ·l -1 PH7.8 915 ml A+ 85mlB 1000ml1%PVP （聚⼄烯吡咯烷酮） 10gPVP ——加PBSPH7.8——1000ml （⽤来提取酶液）②愈创⽊酚（即0.02mol ·l -1邻甲氧基苯酚）③30%H 2O 2④25mmol ·l -1焦性没⾷⼦酸（焦培酸）POD 反应液：取50ml0.05mol ·l -1PH6PBS 加⼊ 28µl （愈创⽊粉）加⼊19µl30%H 2O 2 棕⾊瓶PPO 反应液：取50ml0.05mol ·l -1PH6PBS 加⼊ 100µl 焦培酸棕⾊瓶酶液提取：称取0.5g 样品放⼊研钵，分三次共加8ml1%PVP 冰浴研磨全部倒进离⼼管放进离⼼机 4℃、10000r ·min 离⼼15min →取上清夜备⽤（1）POD 测定：3ml 反应液µl 酶液混匀 A470⽐⾊ (以反应液做对照) 每⼀分钟记录⼀次计算：POD 活性（U ·g -1FW ·min -1）=OD470×N 总体积/t ×n ×w ×0.01（2）PPO 测定：3ml 加⼊ 100µl 酶液混匀 30℃⽔中15min A420⽐⾊(以反应液做对照)计算：PPO 活性（U ·g -1FW ·min -1）=OD420×N 总体积/t ×n ×w ×0.001（反应液调零点，⼀个酶单位u 定义为0.001A 值变化）POD 、PPO 、多酚氧化酶的测定试剂：磷酸缓冲液（代号PBS ）配制A ：Na 2HPO 4?12H 2O 17.91g 加⽔ 1000ml 定容B ：NaH 2PO4?2H 2O 7.8g 加⽔ 1000ml 定容 0.05mol ·l -1PH6PBS 123mlA+877mlB 1000ml 定容即可 1%PVP （聚⼄烯吡咯烷酮） 1gPVP 100ml 定容②愈创⽊酚（即0.05 mol ·l -1邻甲氧基苯酚）:取0.6208 g 的愈创⽊酚定容到100ml 容量瓶摇匀即可③0.1mol/LH2O2 5.68ml 稀释⾄1000ml ④25mmol ·l -1焦性没⾷⼦酸（焦培酸）⑤0.1mol/L ⼉茶酚溶液：取0.5506克⼉茶酚溶于50毫升蒸馏⽔中，定容摇匀即可。

一、过氧化物酶（POD）活性的测定POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。

测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。

然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。

在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。

以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。

△470 ×V TPOD活性=0.01×t×Vs×W式中：△470----反应时间内吸光度值的变化；V T ----提取酶液的总体积（ml）t----反应的时间（min）Vs ----测定时取用酶液体积（ml）W----样品鲜重（g）二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。

酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。

PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。

混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活。

PPO活性= O D×V T0.01×t×0.5g×V s= O D×V T0.005OD——反应时间内吸光值的变化；V T ----提取酶液的总体积（ml）Vs ----测定时取用酶液体积（ml）T———反应时间(min)；三、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性的测定参照张志良等(1990)人的方法并稍作改动。

保护酶活性测定方法一、过氧化物酶（POD）活性测定1、酶液的制备：称取样品3 g，加入预冷的0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液少量，用粗纱布过滤，定容至10ml，低温离心（12×104r/min,0~4℃）15min,取上清夜置于低温冰箱备用。

2、试剂：0.05 mol/L pH 5.5磷酸缓冲液0.05 mol/L 愈创木酚溶液（2-甲基酚）20%三氯乙酸溶液2%H2O23、仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸量管4、过氧化物酶活性测定：（1）加入反应混合液2.9 ml磷酸缓冲液1 ml愈创木酚溶液（2-甲基酚）1 ml H2O20.1ml酶液（2）37℃水浴锅中保温15min,迅速转入冰浴，并加入2ml三氯乙酸溶液终止反应（3）过滤，适当稀释。

在470nm处测OD470。

5、结果计算：以每分钟内OD变化0.01为1个酶活力单位。

即酶活力=OD×D / 0.01t酶的比活力= OD×D /（0.01tw）其中：OD为反应时间内吸光度的变化W为材料鲜重t为反应时间D为稀释倍数。

即提取的总酶液为反应系统内酶的倍数二、多酚氧化酶（PPO）活性测定1、酶液的制备：称取样品3 g，加入预冷的0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液少量，用粗纱布过滤，定容至10ml，低温离心（12×104r/min,0~4℃）15min,取上清夜置于低温冰箱备用。

2、试剂：0.05 mol/L pH 5.5磷酸缓冲液0.05mol/L儿茶酚溶液（邻苯二酚）20%三氯乙酸溶液2%H2O23、仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸量管4、多酚氧化酶活性测定：（1）加入反应混合液3.9 ml磷酸缓冲液1 ml 儿茶酚溶液0.1 ml酶液（2）37℃水浴锅中保温15min,迅速转入冰浴，并立即加入2ml三氯乙酸溶液终止反应。

（3）过滤，适当稀释。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶是生物体内重要的防御系统，它们通过清除自由基来保护细胞免受氧化损伤。

其中，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是三种主要的抗氧化酶。

测定这些酶的活性对于评估生物体的抗氧化能力具有重要意义。

本文将介绍几种常用的抗氧化酶活性测定方法。

1. 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法SOD是一种能够催化超氧阴离子自由基（O2）歧化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2）的酶。

常用的SOD活性测定方法包括：氮蓝四唑（NBT）法：利用NBT在超氧阴离子自由基存在下被还原成蓝色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算SOD活性。

羟胺法：利用羟胺与超氧阴离子自由基反应硝酸盐，通过测定硝酸盐的量来计算SOD活性。

2. 过氧化物酶（POD）活性测定方法POD是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。

常用的POD活性测定方法包括：愈创木酚法：利用愈创木酚在过氧化物酶存在下被氧化红色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。

邻苯三酚法：利用邻苯三酚在过氧化物酶存在下被氧化紫色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。

3. 过氧化氢酶（CAT）活性测定方法CAT是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。

常用的CAT活性测定方法包括：紫外分光光度法：利用过氧化氢在紫外光下具有吸收的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算CAT活性。

酶偶联法：利用过氧化氢在过氧化物酶存在下被氧化水的特性，通过测定水的量来计算CAT活性。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定的实验步骤与注意事项实验步骤1. 样品准备提取酶：根据实验目的，选择合适的组织或细胞提取酶。

常用的提取缓冲液包括磷酸盐缓冲液、TrisHCl缓冲液等。

离心：将提取液离心，分离上清液和沉淀物。

上清液中含有目标酶，沉淀物则含有杂质。

蛋白质定量：使用 Bradford 法或 Lowry 法等蛋白质定量方法测定上清液中的蛋白质浓度。

过氧化物酶活性的测定POD过氧化物酶活性的测定POD一、原理：过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。

本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H 2O 2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚红棕色的物质可用分光光度计在470nm 处测定其消光值，即可求出该酶的活性。

，二、实验准备仪器：分光光度计、离心机、秒表、天平、研钵、磁力搅拌器试剂：愈创木酚、30%H 2O 2、0.2mol/L 磷酸缓冲液（7.8）、0.1mol/L 磷酸缓冲溶液（PH6.0，见附录）反应混合液[100mmol/L 磷酸缓冲溶液（PH6.0）50ml ，加入愈创木酚28μl ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解、待溶液冷却后，加入（待溶液冷却后再加入，否则引起分解）30%H 2O 2 19μl ，混合均匀，保存于冰箱中。

]三、步骤：1、粗酶液的提取：称取植物材料0.4-0.5g ，加磷酸缓冲液（7.8）5ml （分几次加入），于研钵中研磨成匀浆，以8000r/min 离心10min ，收集上清液于冷处（冰箱4度保存）。

2、酶活性的测定：一个试管入反应混合液3ml ，磷酸缓冲液（7.8）1ml ，作为校零对照，另外加入反应混合液3ml ，上述酶液1ml （龙麦26酶液稀释10倍，克旱16酶液稀释15倍），立即开启秒表计时，于470nm 测OD 值，每隔15秒读1次值，读45秒，以为每15秒钟OD 变化值测酶活性的大小，以△OD/min.mg蛋白质表示。

四、计算公式W t t=01.0V VA 活性POD 470 ΔA 470：反应时间内吸光值的变化W ：样品重量V ：提取液总体积，即5mlVt ：测定时所用体积,即1mlt ：反应时间注意：一般来说，都需要稀释，如果酶液稀释了，应在计算时乘上相应的倍数。

——张志良，瞿伟菁，P 123-124,2004高教版《植物生理学实验指导》——李玲主编，P 97-98，科学出版社，2009,《植物生理学模块实验指导》磷酸缓冲液配置A 0.2mol/l NaH2PO4 27.8g NaH2PO4?H2O 1000mlB 0.2mol/l Na2HPO4 71.7g Na2HPO4?12H2O 1000mlA(ml) B(ml)PH7.8 8.5 91.5200mlPH6.0 87.7 12.3。

POD测定方法范文
一、POD测定方法简介
POD (Phenoloxidase) 是一种自由型的酶活性，其功能是将
苯酚和一氧化氮合成多萜类酚，如黄嗜多萜和紫多萜。

它以自由酶或
合成酶形式存在于人体内，在血液、腹水以及其他细胞液的活性中发挥着
重要作用。

POD是一种常见的半乳糖苷/葡萄糖苷酶，主要功能是在体内
氧化苯酚或其他多萜类化合物，转化为色素，发挥着调节多萜代谢的作用。

二、POD测定方法
1.溶液准备：将体液样本取出，放入带有POD测定液的离心管中。

将POD测定液稀释至实验检测浓度，将其中的POD测定液体积补充至10 ml。

2.试管准备：将试管清洗，用水洗涤，并待试管冷却至25°C。

3.缓冲液准备：将0.1M磷酸钠/酒石酸缓冲液（pH8.2）加入实验液中，待溶液混合均匀。

4.添加苯酚：将2-4ul纯苯酚加入混合溶液中，搅拌均匀。

5.恒温：将试管放入37℃恒温水槽中，室温48-52℃，恒温30分钟。

6.检测：取出试管，放入水中，搅拌均匀，观察溶液是否出现颜色变化，若发生褐色，则表明溶液中存在POD活性，POD活性可用添加苯酚后
的溶液与实验前溶液的色差强度的变化来表征。

酶活性测定方法一、过氧化物酶（POD）活性的测定POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。

测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。

然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。

在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。

以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。

△470 ×V TPOD活性=0.01×t×Vs×W式中：△470----反应时间内吸光度值的变化；V T ----提取酶液的总体积（ml）t----反应的时间（min）Vs ----测定时取用酶液体积（ml）W----样品鲜重（g）二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。

酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。

PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。

混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm 下测定其吸光度值，计算酶活。

PPO活性= O D×V T0.01×t×0.5g×V s= O D×V T0.005OD——反应时间内吸光值的变化；V T ----提取酶液的总体积（ml）Vs ----测定时取用酶液体积（ml）T———反应时间(min)；三、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性的测定参照张志良等(1990)人的方法并稍作改动。

过氧化物酶（POD）活性的测定过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的遍化。

1、原理在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在 470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm 的吸光度变化测定过氧化物酶活性。

2、实验仪器研钵、电子天平、冰冻高速离心机、可见光分光光度计、3、实验试剂（1）100 mmol／L 磷酸缓冲液 pH6.0①0.2mol/L的 NaH2PO4：称取NaH2PO4___2.4__g,加重蒸水至100ml溶解。

②0.2mol/L的Na2HPO4：称取Na2HPO4___2.84__g加重蒸水至100ml溶解。

③取NaH2PO487.7ml，Na2HPO412.3ml，混合（2）反应液100 mmol／L 磷酸缓冲液（pH6.0）50 mL于烧杯中，加入愈创木酚28μl，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19μl，混合均匀，保存于冰箱中。

（3）20mmol/l的KH2PO4称取0.272g，定容至100ml 4、实验步骤（1）酶液的制备取1.00g植物叶片剪碎，加入预冷的20mM KH2PO45ml进行冰浴研磨提取。

浆液低温离心4000r/min 15min,上清液为酶粗体液（记录体积），定容至50ml 待测定。

（2）酶活性测定取光程1cm的玻璃比色杯2只，一只加入反应液3ml，20mM KH2PO41ml作为调零管。

另一只加入反应液3ml，提取的酶液1ml，立即开始计时，在470nm波长处进行比色，开始记录数据，然后每隔一分钟记录一次吸光度值，共测3min。

5、结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA 470 /[min ·g （鲜重）] 表示之。

抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法抗氧化酶SOD（超氧化物歧化酶）、POD（过氧化物酶）和CAT（过氧化氢酶）是植物体内重要的抗氧化酶，在植物的抗逆境应对中起着重要的作用。

因此，对这些抗氧化酶的活性进行测定和分析是研究植物生理生化过程的重要方面之一测定抗氧化酶活性的方法一般分为两类：直接法和间接法。

直接法是通过测定一些特定底物的降解速率来反映酶的活性；间接法是通过测定酶催化底物形成的产物的生成速率来间接反映酶的活性。

下面将分别介绍抗氧化酶SOD、POD和CAT活性的测定方法。

1.SOD活性测定方法：SOD活性测定方法主要分为NBT法和EPX法两种。

（1）NBT法：这是一种直接法，其基本原理是SOD将还原型的NBT 还原成穆尔蓝染色形成具有最大吸收峰值的NBT离子。

实验步骤如下：a.首先准备SOD底物溶液，其组成为：50mM磷酸缓冲液（pH7.8）+13mML-甲硫氨酸+75μM硝基蓝硝酸盐（NBT）。

b.将样品加入上述的SOD底物溶液中，混匀。

c.加入适量的酶抑制剂，使停止酶的活性，并将其放在冰上。

d.使上述反应在37℃下进行10分钟。

e.加入已经冷却的硝酸亚铁和磷酸以停止反应，并将其放在冰上10分钟。

f. 测定变色液的吸收光谱在560 nm波长处的吸光度。

（2）EPX法：这也是一种直接法，其基本原理是SOD将乙酸型形成的4-无水乙烯甲基-3-硝基噻吩染色。

实验步骤如下：a. 首先在试管中加入1 ml乙酸型测定液。

b.分别加入适量的SOD样品。

c.在30分钟内使试管中乙酸型完全消除。

d. 测定出试管中产生的4-乙烯基-3-硝基-5-硝基噻吩的吸收光谱在260 nm波长处的吸光度。

2.POD活性测定方法：POD活性测定方法可分为直接法和间接法。

（1）直接法：这种方法基于过氧化反应的特点，利用dianisidine 与过氧化氢在催化剂POD作用下形成有色产物的现象来测定POD的活性。

实验步骤如下：a.在试管中加入0.1M磷酸盐缓冲液（pH6.0）。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。

网上说定容到100ML我也不懂。

拜托（3）100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；（4）100μM核黄素溶液：取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml，避光保存，随用随配，并稀释10倍（5）750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存；酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加2ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml。

取5ml于10000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。

提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。

2、酶活性测定2．显色反应取试管（要求透明度好）5支，3支为样品测定管，1支为对照管，另外1支作为空白，按表39-1加入各溶液。