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淋巴细胞分层液有两种（1）聚蔗糖—泛影葡胺液：聚蔗糖（polysucrose solution）,商品名Ficoll，分子量400 000，多配制成40±1％（W/V）水溶液，也有干粉出售。
应用时，用蒸馏水配制9％溶液。
泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici)，商品名Vrografin，结构式为3，5—二乙酰氨基2，4，6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇。
含量为60％或75％，每安瓶为20ml装，常用于人的脏器造影。
应用时，取60％泛影葡胺原液20ml，加双蒸馏水15.38ml，即为33.9％泛影葡胺。
1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制：9％聚蔗糖液24份33.9％泛影葡胺液10份混合即可。
必要时，可测比重。
需要备用，可用G5漏斗过滤除菌或114.3℃高压灭菌15min，4℃保存。
一般可保存3个月。
（2）泛影葡胺—右旋糖酐（dextran）液34％泛影葡胺液10份60％右旋糖酐液12.5份混合，即为比重1.07～1.09的分层液。
分装于棕色瓶中，4℃冰箱保存备用。
一、淋巴细胞分离人淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原则是收率较高，根据不同试验有相对纯度，尽最大可能保持细胞应有活性。
分离的技术可根据细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。
本文介绍常用的密度梯度离心法的原理及方法。
人外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为 1.074±0.001。
密度梯度离心法的原理主要根据各类血细胞比重的差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。
常用的分层液有Ficoll，Ficoll是一种合成性蔗糖聚合物的商品名，无毒，但高浓度溶液往往不等渗，且粘性高，易使细胞聚集，常使用60g/L低浓度溶液（密度1.020）加入泛影葡胺（Hypague），应用浓度为340g/L（密度1.200），以泛影葡胺适当比例与Ficoll混合，可配制成比重合适的细胞分层液（密度1.077±0.001）。
选择性必修三《生物技术与工程》学校:___________姓名：___________班级：___________考号：___________一、判断题1．乳酸菌是厌氧细菌，在无氧的条件下能将葡萄糖分解成乳酸（反应式C6H12O6−−→酶2C3H6O3＋能量），可用于乳制品的发酵、泡菜的腌制等。
（选择性必修3 P5）()2．酵母菌是一类单细胞细菌，是兼性厌氧微生物，在无氧条件下能进行酒精发酵（反应式C6H12O6−−→酶2C2H5OH＋CO2＋能量），可用于酿酒、制作馒头、面包等。
（选择性必修3P6）()3．多种微生物参与了豆腐的发酵，如酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是曲霉。
（选择性必修3P5）()4．泡菜发酵期间，乳酸会不断积累，当它的质量分数为4%～8%时，泡菜的口味、品质最佳。
（选择性必修3P6）()5．醋酸菌在无氧条件下利用乙醇产生乙酸()6．膳食中的亚硝酸盐不会危害人体健康。
()7．葡萄酒酿造过程中需加入红色素，使葡萄酒呈深红色。
()8．只有在糖源充足的情况下才能进行醋酸发酵()9．当人体摄入的亚硝酸盐总量达到0．3～0．5g时，就可以转化为致癌物——亚硝胺()10．将培养基倒入培养皿后，应立即将培养皿倒过来放置。
（选择性必修3P12）() 11．在采用稀释涂布平板法进行微生物的选择培养时，将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽后就可以进行涂布了。
（选择性必修3P17）()12．灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，对操作的空间、操作者的衣着和手要进行灭菌。
（选择性必修3P10）()13．牛肉膏和蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。
（选择性必修3P10）()14．刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
()15．尿素在脲酶的催化作用下分解成无机物。
()16．筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源。
猪小肠微血管内皮细胞的分离培养与纯化施晓杰;马维超;邓昱晨;邓伟;张倩;冯波;穆祥【摘要】旨在建立简单高效的获取猪小肠微血管内皮细胞(PIMVECs)的方法.将SPF新生仔猪麻醉处死后取空肠,经酶消化后用免疫磁珠分选获得纯化的PIMVECs,并对纯化后的细胞进行免疫荧光鉴定,采用WST-1法分析传代PIMVECs的增殖情况.分离纯化的PIMVECs呈短梭形或多角形,单层贴壁生长,汇合后呈铺路石样,血管内皮细胞特异性标志物VIII因子相关抗原表达阳性,且复苏后传代细胞增殖情况良好.采用免疫磁珠分选法可以快速直接获得纯化的猪小肠微血管内皮细胞,且细胞活性良好.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2019(055)001【总页数】5页(P36-38,43,封4)【关键词】微血管内皮细胞;猪小肠;体外分离;免疫磁珠【作者】施晓杰;马维超;邓昱晨;邓伟;张倩;冯波;穆祥【作者单位】北京农学院动物科技学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京昌平102206;北京农学院动物科技学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京昌平102206;北京农学院动物科技学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京昌平102206;北京农学院动物科技学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京昌平102206;中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;北京农学院动物科技学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京昌平102206;北京农学院动物科技学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京昌平102206【正文语种】中文【中图分类】S858.28血管内皮细胞可调节机体内环境稳定,具有分泌、合成、代谢及免疫功能,可产生多种细胞因子和生物活性物质[1]。
不同于大血管内皮细胞,在不同组织器官之间,微血管内皮细胞在表型和功能上均表现出差异性[2]。
肠微血管内皮细胞衬附于肠绒毛血管内壁,呈网囊状,是血管内外物质交换的重要屏障和各种肠内毒素入血的必经通路。
动物细胞培养生物反应器的操作模式(总7页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--动物细胞培养生物反应器的操作模式米力第四军医大学细胞工程中心，国家863西安细胞工程基地陕西西安，710032动物细胞培养工艺的选择首先考虑的重要一点是该产品所涉及的生物反应器系统。
选择反应器系统也就是选择产品的操作模式，操作模式选择将决定该产品工艺的产物浓度、杂质量和形式、底物转换度、添加形式、产量和成本，工艺可靠性等。
与许多传统的化学工艺不同，动物细胞反应器设备占整个工艺资金总投入的主要部分（＞50%），也就是说动物细胞培养工艺的选择主要部分是生物反应器系统的选择。
选择反应器系统及培养工艺时，必须对工艺的整体性进行全面考虑，主要包括以下几个方面：细胞株及生长形式、产物表达量和稳定性，培养基质及代谢物，产物分离和纯化难度等。
动物细胞大规模培养的生物反应器操作模式，一般分为分批式操作（batch）、流加式操作（Fed-batch）、半连续式操作（semi-continuous）、连续式操作（continuous）和灌流式操作（perfusion）五种操作模式。
1. 批式操作（batch culture）批式操作是动物细胞规模培养发展进程中较早期采用的方式，也是其它操作方式的基础。
该方式采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物、培养基的操作方式。
该方式的特点:(1) 操作简单。
培养周期短，染菌和细胞突变的风险小。
反应器系统属于封闭式，培养过程中与外部环境没有物料交换，除了控制温度、pH值和通气外，不进行其他任何控制，因此操作简单，容易掌握；(2)直观的反应细胞生长代谢的过程。
由于培养期间细胞的生长代谢是在一个相对固定的营养环境，不添加任何营养成分,因此可直观的反应细胞生长代谢的过程,是动物细胞工艺基础条件或"小试"研究常用的手段；(3)可直接放大。
小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及生物学特性分析刘寿生;雷俊霞;黎阳;项鹏;周敦华【摘要】[Objective] To establish an effective way for isolation and expansion of mouse adipose-derived stromal cells (ADSC), and to observe the biological characteristics of mouse ADSC. [Methods] ADSC were obtained from adipose of BALB/C mouse, isolated and purified in vitro to determine cell morphology, immunophenotype, differentiation potentiality, clone formation ability, growth kinetics and immunoloregulation characteristics in the lymphocyte proliferation inhibition test; T lymphocytes (1 ?105) were cultured in the presence of ConA (ConA was 20 μg/mL), and ADSC of different number interacted with activated T lymphocytes respectively. Experiment was divided into 8 groups by the different number of ADSC: A group as positive control (ConA+T lymphocytes), B group (ADSC 1× 103+ConA+T lymphocytes), C group (ADSC× 1 04+ConA+T lymphocytes), D group (ADSC 2 × 104+ConA+T lymphocytes), E group as negative control (T lymphocytes), F group (ADSC1 ×103), G group (ADSC1 × 104), H group (ADSC 2 × 104), F, G, H were reference groups. The ability of T lymphocyte proliferation was measured by cck-8 method. [Results] ADSC showed plastic-adherent, fibroblastic-like morphologic characteristics, cell proliferation was inadequate and cell morphology changed to flat, enlarged shapes with the passage increasing. ADSC at passage 3 highly expressed CD29 and CD44, moderately expressed Sca-1, weakly expressed CD34, CD45, and CDllb.Three passaged ADSC could be induced to differentiate into osteoblasts and adipocytes, and had strong ability to shape colony forming unit-fibroblasts (CFU-Fs). Doubling time of three,five, and eight passaged ADSC was (22 ?3)h, (24 ?3)h, and (30 ?3)h, respectively. The proliferation rate after passage 5 slowed down gradually. ADSC could suppress T lymphocyte proliferation, the inhibition ratios of B, C, and D group were 20. 78%, 47. 94%, and 60.70%, respectively, which was similar to bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC). [Conclusion] ADSC can be isolated and expanded effectively by using adherent culture, they possess general characteristics of mesenchymal stem cells, in addition, they are easier to be purified and their proliferation rate is faster compared with BMSC,so ADSC may be a good multipotential cell candidate for the future cell replacement therapy.%[目的]建立一种有效的分离、培养小鼠脂肪间充质干细胞(ADSC)的方法,从而为小鼠间充质干细胞(MSC)的来源提供更广阔的选择,以利于MSC在小鼠模型中的研究.[方法]体外分离、纯化BALB/C小鼠ADSC,进行细胞形态、表面标志、成脂及成骨分化潜能鉴定、克隆形成能力、生长动力学等方面的研究,并通过淋巴细胞增殖抑制试验研究其免疫调节特性:用终浓度为20μg/mL的ConA作用于T淋巴细胞(1×105个),以不同数量的ADSC分别与活化T淋巴细胞作用,根据ADSC数量不同实验分为A组(ConA+T细胞)、B组(ADSC 1×103/孔+ConA+T细胞)、C组(ADSC 1×104/孔+ConA+T细胞)、D组(ADSC 2×104/孔+ConA+T细胞),同时E组(单纯T细胞)作为阴性对照组,F组(ADSC 1×103孔)、G组(ADSC 1×104/孔 )、H组(ADSC 2×104/孔)作为参照组.用CCK-8法检测作用前后T细胞功能.[结果]ADSC镜下形态呈贴壁、梭型,且随着代数的增加,细胞逐渐增大；第3代ADSC高表达CD29和CD44,中表达Sca-1,低表达或不表达CD34、CD45、CD1 1b;第3代ADSC可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞;第3代ADSC有很强的集落形成能力；第3代ADSC倍增时间为(22±3)h,第5代ADSC 倍增时间为(24±3)h,第8代ADSC倍增时间为(30±3)h,第5代后的ADSC增殖速度随着代数的增加逐渐减慢;ADSC可以抑制T淋巴细胞的增殖,B、C、D组的抑制率分别为20.78％、47.94％、60.70％,抑制能力和骨髓间充质于细胞(BMSC)相似.[结论]通过贴壁培养可以从小鼠脂肪中分离培养出高纯度ADSC,该方法效率高,培养出的ADSC具有BMSC的一般特性,且与BMSC相比更易纯化,具有更快的增殖速度,有望作为小鼠MSC的有效来源.【期刊名称】《中山大学学报（医学科学版）》【年(卷),期】2012(033)003【总页数】6页(P299-304)【关键词】间充质干细胞;小鼠;骨髓;脂肪组织;免疫调节【作者】刘寿生;雷俊霞;黎阳;项鹏;周敦华【作者单位】中山大学附属第二医院儿科,广东广州510120;中山大学中山医学院,广东广州510080;中山大学附属第二医院儿科,广东广州510120;中山大学中山医学院,广东广州510080;中山大学附属第二医院儿科,广东广州510120【正文语种】中文【中图分类】R725.5;R329.4间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）最初是在骨髓中分离出来的，但后来在脂肪组织、肌肉组织、牙根、胎盘、羊水及脐带血中均分离出MSC［1］。
小鼠肝实质细胞的分离、鉴定及原代培养陈阳洁;高柯欣;王智豪;李峰;张琳琳;刘娇;陈晓光【摘要】为分离、培养高纯度原代小鼠肝实质细胞,并鉴定其纯度及生物活性,试验采用原位两步循环灌流法及多次低速差速离心法分离纯化肝实质细胞,促贴壁培养基原代培养,台盼蓝检测其存活率,PAS反应检测其糖原合成能力,免疫荧光化学检测细胞中CK18表达情况.结果表明:每只小鼠可获取约1.5×106个细胞,存活率>97％;镜下发现细胞在接种后6 h开始贴壁,72 h贴壁细胞生长状态良好,胞体变大、不规则,细胞间相互靠拢呈岛状或条索状连接;肝细胞出现成片紫红色糖原颗粒,CK18在细胞中均匀分布;糖原反应联合CK18免疫荧光显示细胞纯度在90％以上.说明该试验所用方法分离出肝实质细胞数量和存活率高,促贴壁培养基培养的肝实质细胞纯度高,为细胞代谢、细胞毒性等的研究奠定了基础.【期刊名称】《畜牧与饲料科学》【年(卷),期】2019(040)004【总页数】5页(P7-11)【关键词】小鼠;肝实质细胞分离;原代培养;细胞鉴定【作者】陈阳洁;高柯欣;王智豪;李峰;张琳琳;刘娇;陈晓光【作者单位】河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023【正文语种】中文【中图分类】Q813.11肝脏是哺乳动物机体内重要的解毒和代谢器官［1］。
当肝脏受到物理、化学或生物性损伤时，会产生肝肿瘤、中毒性肝病、肝硬化、急性重型肝炎等各种肝病［2］，而阐明各种肝病的发生机理是预防和治疗肝病、寻找开发新药物的第一步。
目前，将肝细胞分离、纯化并进行体外原代培养已成为探索肝病发病机制常用手段［3］，并在肝病相关研究中起着越来越重要的作用。
大鼠肝细胞与kupffer 细胞的分离与鉴定李婉雁1，2，相雪莲1，2，曹楠1，2，陈文斌1，2，潘建秋1，2，江丹莉1，2，田允波1，2，黄运茂1，2，许丹宁1，2*（1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广东广州510225；2.广东省水禽健康养殖重点实验室，广东广州510225）摘要：本研究旨在建立一种简单有效的分离大鼠肝细胞和kupffer 细胞的方法。
大鼠体外肝脏灌流，采用percoll 密度梯度分离法分离肝细胞与kupffer 细胞，糖原染色鉴定肝细胞，墨汁吞噬实验鉴定kupffer 细胞。
结果表明，此方法分离的肝细胞和kupffer 细胞活性都在95%以上，新分离的肝细胞鹅卵石样，贴壁能力不是特别强，24h 可分化出不同形态。
Kupffer 细胞具有较强的吞噬能力和贴壁能力，可看到墨汁被细胞吞噬。
结论：本实验建立的分离培养方法较稳定，为开展肝细胞和kuffer 细胞的相关研究提供方法依据，也为建立各种体外细胞分离培养方法提供借鉴。
关键词：大鼠；肝细胞；kupffer 细胞；分离；鉴定中图分类号：Q343.6文献标识码：B文章编码：1005⁃8567（2021）02⁃0046⁃04收稿日期：2021⁃03⁃16基金项目：广东省基础与应用基础研究基金项目区域联合基金⁃青年基金项目（2019A1515110106）作者简介：李婉雁（1988⁃），女，广东广州人，讲师，博士。
*通讯作者：许丹宁，E⁃mail ：*****************肝脏是机体最大的代谢器官，在机体的生命活动中扮演着相当重要角色，很多疾病的防治和肝脏的代谢息息相关［1］。
作为体外培养的一种原代细胞，肝细胞具有很强的活性和高代谢能力，在研究肝脏的代谢机制以及药物对肝脏的作用机制方面具有十分重要的作用，为研究药物代谢、开发新药物的研究提供了一个有效平台。
因此，建立有效稳定的分离和培养原代肝细胞方法，将为开展肝脏功能相关研究提供有力的方法支持［2，3］。
大鼠半月板纤维软骨细胞的分离、培养与鉴定杨军英;林金艳;韩菲【摘要】探讨体外大鼠半月板纤维软骨细胞分离培养与鉴定的实验方法,观察不同代次间细胞的形态学特征.手术分离大鼠双膝内外侧半月板,采用胰酶和Ⅱ型胶原酶消化法提取细胞,甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光法鉴定细胞,低糖DMEM完全培养液常规培养.结果表明,原代半月板细胞形态呈多角形,轮廓清晰,8～10 d可铺满瓶底;传代后的1～3代细胞,其贴壁及增殖能力加强,生长状态良好;传至4～5代尤其是第5代之后,细胞表型不稳定,密度稀疏,形态以长梭形为主且不规则,清晰度下降,传代周期延长;细胞鉴定结果呈阳性.双酶消化和低糖DMEM完全培养液常规培养可以获得具有良好生物学特性的半月板细胞,第4代之前的半月板细胞可以为运动损伤的组织工程学研究提供种子细胞.【期刊名称】《西北师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(054)005【总页数】5页(P68-72)【关键词】半月板;纤维软骨细胞;体外培养;鉴定【作者】杨军英;林金艳;韩菲【作者单位】河南师范大学体育学院,河南新乡 453007;河南师范大学体育学院,河南新乡 453007;河南师范大学体育学院,河南新乡 453007【正文语种】中文【中图分类】R329半月板作为膝关节的重要结构部分，具有稳定膝关节、维持运动协调，吸收震荡、承载及分散负荷，润滑关节、增加关节接触面等功能.半月板承受着至少50% 的膝关节压力，是膝关节运动损伤中比较常见的损伤部位.半月板损伤可分为退变性和创伤性2种，前者是长期磨损累积而致，发病人群多见于中老年人；后者常见于膝关节运动的急剧转变而使半月板被动运动后的撕裂损伤，属运动损伤范畴，多见于专业运动员及体育爱好人群.运动损伤是常见且易导致机体长时间功能障碍的疾病，而半月板的血供特点决定了其在损伤后，尤其是中央游离缘非血供区损伤后，几乎不具备愈合能力[1].故半月板的损伤是导致膝关节功能紊乱的最常见原因之一，因此,半月板损伤的修复治疗一直以来都是运动医学研究的热点和难题.组织工程技术修复半月板损伤，主要包括半月板种子细胞、半月板支架材料和细胞因子研究这3部分,其中半月板种子细胞包括半月板纤维软骨细胞、间充质干细胞和多能纤维细胞等.该技术尽可能地保留半月板的形态和功能，克服了半月板部分切除术的局限性和术后出现的功能缺陷以及并发症等问题[2-3]，在临床上取得了一些令人欣喜的进步.叶川等[4]研究发现胚半月板细胞的优化获取方法；Kang等[5]分离兔半月板纤维软骨细胞并用于同种异体组织工程半月板修复.但目前使用的种子细胞面临分化[6]、表型改变[7]、诱导和调控复杂、癌变潜能等问题[8].本研究通过分离培养半月板细胞，分析其生物学特征变化，为体外探究半月板损伤的机制和细胞治疗中种子细胞(半月板纤维软骨细胞)的优选提供理论和实践基础.1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物 6周龄健康SD大鼠，体重280±20 g,由河南省干细胞和生物治疗研究中心提供.1.1.2 主要试剂及设备Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶(Gibco),Rabbit Anti-Collagen Ⅱ、FITC-羊抗兔 IgG(武汉博士德生物技术有限公司),甲苯胺蓝染色剂(Sigma),二甲基亚砜(Genview),胎牛血清，低糖DMEM(Gibco)等.CO2细胞培养箱、低温冷冻离心机(Thermo)、倒置相差荧光显微镜(Nikon)、200目铜网(Sigma)、超净工作台(Heal Force)等.1.2 实验方法1.2.1 半月板细胞的分离、培养麻醉并处死42 d龄SD大鼠后，无菌条件下打开膝关节，剥离双膝内外侧半月板.于超净工作台完成以下操作：PBS 缓冲液冲洗3次，眼科剪将组织剪碎约1 mm3大小，在37 ℃ 水浴下，先用0.25%胰蛋白酶预消化1 h，再用20倍组织块体积的0.2% Ⅱ型胶原酶震荡消化 8～10 h，加入培养液终止消化，800 r·min-1离心 5 min，收集细胞，加入含体积分数0.10的FBS,105 U·L-1的青霉素钠、105 g·L-1链霉素的DMEM培养液重悬细胞.台盼蓝染色，血细胞计数板计数后，单细胞悬液以1×106个·mL-1 接种于 25 cm2 培养瓶，置于37 ℃,5% CO2 、饱和湿度的细胞培养箱中培养.隔日换液1次，用倒置相差显微镜观察细胞形态变化和生长情况.当细胞铺满瓶底(80%～90%融合)时，用含0.1% EDTA的0.25% 胰蛋白酶消化，含10% FBS的DMEM培养液终止消化，将细胞悬液按1∶2 比例传代、培养.1.2.2 形态学观察倒置相差显微镜下观察各代细胞的形态，分析细胞生长状况及规律.1.2.3 甲苯胺蓝染色第3代半月板细胞爬片48 h，PBS 冲洗 3 次，4% 多聚甲醛固定30 min，1%甲苯胺蓝染色2 h，爬片用无水乙醇迅速漂洗2次，干燥后中性树胶封片.1.2.4 Ⅱ型胶原免疫荧光染色将第3代半月板细胞接种于 96 孔细胞培养板，常规培养 48 h 后，PBS 冲洗，4% 多聚甲醛固定1 h，0.5% Trixton X-100 清洗，山羊血清室温封闭 1 h.按照说明书进行以下操作：加入Rabbit Anti-CollagenⅡ 抗体4 ℃ 过夜，加入FITC-羊抗兔IgG，于37 ℃ 恒温箱避光孵育 1 h，PBS 清洗后进行 DAPI 复染.镜下观察并拍照.2 结果2.1 形态学观察原代半月板细胞呈小圆球形，悬浮状态.经台盼蓝染色计算，分离提取的细胞存活率高于 90%.原代半月板纤维软骨细胞贴壁较慢，接种后 6～10 h开始贴壁，48 h 后可完全贴壁.分裂增殖速率也较缓慢，8～10 d 可将 25 cm2 培养瓶铺满.贴壁后的细胞逐渐增大、伸长并形成突起，形态以多角形为主；胞核为椭圆形或圆形，位于胞体的中心.在第 1～3 次的传代后，细胞贴壁时间缩短、增殖速度加快，一般可在 4～6 h 贴壁，5～6 d 铺满培养瓶.传至 3 代后，细胞增殖速度减慢，细胞体积变大、形态逐渐变为长梭形；传至第5代后，细胞活力和增殖能力下降、形态不规则、相邻细胞间胞质连接松散、胞浆和胞膜不清晰.各代细胞形态见图 1.A.原代；B.第1代；C.第2代；D.第3代；E.第5代；F.第7代图1 培养的半月板细胞(10×20, 标尺=100 μm)Fig 1The cultured meniscus cells2.2 甲苯胺蓝染色结果细胞爬片经甲苯胺蓝染色后，细胞质呈淡蓝色，细胞核呈深蓝色，核仁清晰，细胞周围有少量异染颗粒.3代以内的半月板细胞的甲苯胺蓝染色明显，随着细胞传代次数的增加，染色逐渐变浅，软骨细胞特征逐渐减弱，结果见图 2.A.第1代；B.第3代；C.第5代图2 半月板细胞的甲苯胺蓝染色(10×20, 标尺=50 μm)Fig 2Toluidine blue staining of meniscus cells2.3 Ⅱ型胶原免疫荧光染色结果细胞贴壁牢固后，经Ⅱ型胶原染色和DAPI复染.倒置相差荧光显微镜下观察可见，胞质经 FITC 染色后在蓝光激发下呈清晰绿色，为阳性结果，胞核区域未着色，即Ⅱ型胶原于细胞质中表达.细胞核经 DAPI染色后，在UV滤光片下呈蓝色.Ⅱ型胶原免疫荧光染色可见,3代以内的半月板细胞，阳性反应明显；随着传代次数的增加，尤以5代后的半月板细胞，胞浆内绿色荧光明显减弱、阳性率降低(图3).A.第1代；B.第3代；C.第5代；A1B1C1.光镜下半月板细胞；A2B2C2.Ⅱ型胶原免疫荧光染色；A3B3C3.DAPI复染；A4B4C4.A2B2C2和A3B3C3叠加图图3 半月板细胞的Ⅱ型胶原免疫荧光染色(10×20,标尺=50 μm)Fig 3Collagen typeⅡimmunofluorescence staining of meniscus cells3 讨论半月板修复的方法因损伤类型而异，早在 1885 年，Annadale 首次报道半月板开放式全切手术可缓解患者症状、改善膝关节功能[9]；Kessler 等认为针对半月板无血区域撕裂损伤，若修补后愈合效果不佳，则部分切除术是其常见的治疗方法[10]；而有学者表明半月板全切或部分切除手术会不可避免地导致半月板撕裂等手术风险，研究显示该手术风险的高低与患者年龄相关(年龄≤40岁的患者风险升高)，此外可采用同种异体半月板或假体进行移植修复，该方法在取得一定疗效的同时也存在排斥反应及移植体回缩等弊端[11-12].鉴于半月板切除移植重建的效果并不理想，且随着组织工程技术的发展推进，利用组织工程技术再造半月板成为国内外不少学者研究的热点[13].Zellner 等研究表明,自体 MSCs 和半月板细胞在动物模型中具有改善半月板愈合的功能[14]；Kim等研究发现载有纤维软骨细胞及 TYR 交联的水凝胶具有修复半月板的潜在价值[15].原代培养的半月板细胞是研究半月板损伤机制的最好载体，也是目前种子细胞最佳和应用最广泛的细胞来源[16].但半月板主要由纤维软骨细胞和大量基质构成，随着年龄增长，细胞成分含量减少，而胶原纤维含量则逐渐增加，其获取存在一定难度[17].本研究采用机械分离与酶消化相结合的方法，获得了活性大于95%的组织细胞，而且步骤简单，降低污染机会，减少半月板纤维软骨细胞的损伤，并且获取的细胞数量多、纯度高.已有研究发现，体外单层培养系统中半月板纤维软骨细胞随着传代的进行变为纤维细胞的表型，表现出去分化的现象[7,18].本研究结果显示，原代半月板纤维软骨细胞贴壁和分裂增殖速率较慢.传代后，细胞的贴壁能力和增殖速率大大增强，这可能与细胞受到机械性和化学性的损伤、原代细胞接种时的密度较稀疏及生存环境的改变有关.当细胞传至 5 代后呈现明显的增殖速率下降及衰老现象.细胞形态也由规则、大小均一的多角形变成以长梭形为主.这种变化与文献[8,19]的报道基本一致，可能是因为随着体外培养时间的延长及传代次数的增加，半月板合成基质相关基因表达下降，出现“去分化”现象[7].体外单层分离培养的第 5 代前的半月板细胞基本维持其表型和生物学特性.软骨细胞一般通过测定聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的表达进行鉴定.本研究对分离和培养的(5代以内)半月板纤维软骨细胞进行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色，实验结果均为阳性.表明其保留稳定的半月板纤维软骨细胞表型，具有良好的生物学活性及功能.4 结束语采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶联合消化半月板组织、低糖 DMEM 完全培养液常规培养的方法，可获取纯度及活性程度均较高的半月板纤维软骨细胞.第4代之前的半月板纤维软骨细胞能够保持良好的生物学特性，可以为半月板运动损伤的组织工程学研究提供种子细胞.参考文献:【相关文献】[1] ARNOCZKY S P,WARREN R F.Microvasculature of the human meniscus[J].The American Journal of Sports Medicine,1982,10(2):90.[2] MAJEED H,KARUPPIAH S,SIGAMONEY K V,et al.All-inside meniscal repairsurgery:factors affecting the outcome[J].Journal of Orthopaedics &Traumatology,2015,16(3):245.[3] TENGROOTENHUYSEN M,MEERMANS G,PITTOORS K,et al.Long-term outcome after meniscal repair[J].Knee Surgery Sports Traumatology Arthroscopy,2011,19(2):236.[4] 叶川,尹培荣,向阳,等.人胚半月板细胞的优化获取及生物学特性研究[J].贵州医药,2004，28(12):1075.[5] KANG S W,SON S M,LEE E S,et al.Regeneration of whole meniscus using meniscal cells and polymer scaffolds in a rabbit total meniscectomy model[J].Journal of Biomedical Materials Research A,2006,77A(4):659.[6] MINEGISHI Y,HOSOKAWA K,TSUMAKI N.Time-lapse observation of the dedifferentiation process in mouse chondrocytes using 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