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细胞毒性检测方法总结！细胞毒性(cytotoxic)是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。
有时需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选。
细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测，常用以下几种方法：MTT、XTT法：利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测一.LDH的方法：通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性其它酶方法：如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等细胞增殖能力分析试剂原理：正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质（如MTT、XTT、WST-1等）还原为紫色的结晶状的物质，沉积在细胞周围，然后通过酶标仪读取OD值，从而检测到细胞增值状态优点：1）快速：96孔培养板形式，可进行高通量检测。
2）灵活：可直接通过显微镜观察，也可通过酶标仪进行定量检测。
二.荧光素发光法细胞生存能力检测原理：腺苷酸激酶（AK）存在于所有真核和原核细胞的胞浆中，AK具有激活ADP 生成ATP。
当细胞受损后，细胞膜发生破损，AK会释放到培养上清中。
该试剂盒利用荧光素酶和荧光素在ATP作用下可以发光，通过化学发光仪可以定量进行检测。
特点： 1）简单、快速。
2）板式检测，可进行高通量。
三.LDH法细胞毒性检测原理：LDH（乳酸脱氢酶）是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应形成紫色的结晶物质，可通过500nm酶标仪进行检测。
通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度特点：1）方法简单，安全，不使用放射性物质2）可进行高通量检测。
celltiterblue实验步骤CellTiter-Blue细胞增殖试验是一种用于评估细胞毒性和细胞增殖的试验方法。
该试验利用了一种称为resazurin的荧光染料，当这种染料与活细胞中的代谢产物共同作用时，会产生荧光信号。
这种信号的强度可以反映出细胞的数量和活性，从而可以用来评估药物或其他化合物对细胞的毒性和影响。
CellTiter-Blue实验是一种非常常用的细胞毒性测试方法，它可以用于筛选潜在的药物候选物，评估不同化合物对细胞的影响，以及研究细胞增殖和代谢的变化。
在本文中，我们将介绍CellTiter-Blue 实验的步骤和操作流程，帮助读者了解如何进行这种实验。
一、准备工作在进行CellTiter-Blue实验之前，首先需要准备好所需的试剂和仪器设备。
其中包括培养基、细胞培养皿、吸光度计、多孔板、CellTiter-Blue试剂等。
另外，还需要将仪器进行预热和校准，确保实验的准确性和稳定性。
二、细胞准备1.选择合适的培养基和细胞培养条件，确保细胞可以正常生长和增殖。
2.将需要进行实验的细胞接种到培养皿或多孔板中，使其达到适当的密度。
3.将细胞培养在37℃、5% CO2的恒温培养箱中，使其恢复和适应培养条件。
三、实验操作1.将细胞培养基抽去，加入含有CellTiter-Blue试剂的新培养基，使其浓度达到终浓度。
2.将培养皿或多孔板放回恒温培养箱中培养一定时间，让CellTiter-Blue试剂和活细胞进行反应。
3.取出培养皿或多孔板，使用吸光度计测定反应后的荧光信号强度，从而评估细胞的数量和活性。
四、数据分析根据测得的荧光信号强度，可以计算出不同处理条件下的细胞增殖率或毒性影响。
通过比较不同处理条件下的信号强度，可以评估化合物对细胞的影响程度，从而获得相关的实验结果。
五、应用领域CellTiter-Blue实验可以广泛应用于药物筛选、毒性评估、细胞代谢和增殖研究等领域。
例如，可以用于评估化合物对肿瘤细胞的抗增殖作用，筛选抗肿瘤药物候选物；也可以用于评估化合物对正常细胞的毒性影响，以及研究细胞活性和代谢的变化。
细胞增殖—毒性实验步骤1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖—毒性实验步骤：实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂［细胞培养液（DMEM、1640)、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、胰酶（0.25% Trypsin—EDTA）、胎牛血清(FBS）、双抗］,所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。
显微镜下看细胞生长状态，有无污染。
1）倒去培养瓶内的培养液；2）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次；3)加入胰酶500ul/0。
5ml 2~10min（具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）;4）加入含10%FBS的培养液1～1.5ml[培养液：胰酶=（2～3）:1］中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜；6)将单细胞悬液吸入10～15ml离心管中,低速离心800rpm 3分钟,倒去上清液；7）加入含10%FBS细胞培养液1~2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液;8）吸取20ul细胞悬液(10ul细胞悬液+10ul台盼兰液:给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板,进行细胞计数；CCK-8实验：9）在96孔板中，给每孔加100μL(约7000个)的细胞悬液,将培养板放在培养箱预培养24-72小时（37℃，5％CO2），使细胞贴壁；10)向培养板中加入10μL不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物；11）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时(例如：6、12、24或48小时）（药物起作用);注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基)，去掉药物影响。
当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结实验原理：Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。
其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。
生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。
因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
一、用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。
二、优点：1.使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；K-8法能快速检测；K-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；K-8法的重复性优于MTT 法，MTT 实验生成的formazan 不是水溶性的，需要使用DMSO 等有机溶剂溶解；5.而本方法产生的formazan 是水溶性的，不仅省去了溶解步骤，更因此而减少了该操作步骤带来的误差；K-8法对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT 方法相比线性范围更宽，灵敏度更高；K-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
三、所需设备及仪器：1. 10ul，100-200ul及多通道移液器2. 酶标仪（带有450nm滤光片）3. 96孔培养板4. 二氧化碳培养箱四、方法及步骤：实验一：细胞增殖分析1、制备细胞悬液：细胞计数。
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（约1-2×104），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复。
3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。
4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
细胞增殖-毒性实验步骤1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤：实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂[细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、胰酶（0.25% Trypsin-EDTA）、胎牛血清（FBS）、双抗]，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。
显微镜下看细胞生长状态，有无污染。
1）倒去培养瓶内的培养液；2）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次；3）加入胰酶500ul/0.5ml 2～10min（具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）；4）加入含10%FBS的培养液1～1.5ml[培养液：胰酶=（2～3）:1]中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜；6）将单细胞悬液吸入10～15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，倒去上清液；7）加入含10%FBS细胞培养液1～2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液；8）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数；CCK-8实验：9）在96孔板中，给每孔加100μL（约7000个）的细胞悬液，将培养板放在培养箱预培养24-72小时（37℃，5%CO2），使细胞贴壁；10）向培养板中加入10μL不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物；11）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时（例如：6、12、24或48小时）（药物起作用）；注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。
当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
细胞毒理实验技巧与注意事项细胞毒理实验是研究物质对细胞的毒害程度和机理的重要手段之一。
进行细胞毒理实验需要掌握一系列实验技巧和注意事项，以确保实验的准确性和可靠性。
本文将介绍细胞毒理实验的常用技巧，并提供实验中需要注意的事项。
一、细胞培养技巧1. 细胞培养基的选择：选择适合细胞生长和发育的培养基，如DMEM、RPMI-1640等。
根据具体需要，可以添加适量的血清、培养液和抗生素。
2. 细胞传代的控制：定期进行细胞传代，避免细胞密度过高或过低。
细胞密度过高容易导致细胞凋亡，密度过低则会影响细胞生长。
3. 细胞的培养环境：确保培养箱内的温度、湿度和二氧化碳浓度稳定，以提供恒定的培养环境。
二、细胞毒性实验技巧1. 细胞暴露：根据实验需要，将待测试物质添加到细胞培养基中，使细胞与物质发生接触。
通常使用不同浓度的待测物质进行处理。
2. 细胞存活测定：细胞毒性实验的重要指标之一是细胞存活率。
常用方法包括MTT（3-(4,5-二甲基-2-噻唑啉基)-2,5-二苯基四唑盐）法、细胞计数法和荧光染色法等。
3. 細胞凋亡检测：细胞毒性实验中，往往需要检测细胞凋亡情况。
常用的检测方法有DNA凝胶电泳、细胞周期分析和Annexin V-FITC/PI染色等。
三、细胞毒性实验注意事项1. 控制实验组：在进行细胞毒性实验时，除了待测物质组外，还应设立阴性对照组和阳性对照组。
阴性对照组即细胞培养基组，阳性对照组则是已知对细胞有毒的物质组，以用于对比分析。
2. 重复实验：为了确保实验的可靠性，通常需要至少重复3次以上，以获得平均值和标准差。
同时，每次实验的重复次数也要保持一致。
3. 外源污染的避免：细胞培养实验中，外源污染的出现会严重影响实验结果。
因此，要确保实验条件干净、无菌，并采取相应的防护措施。
4. 合理的数据分析：对实验结果进行适当的统计学分析，使用合适的图表和数据处理工具，以得出准确的结论。
综上所述，细胞毒理实验是一项复杂而重要的实验工作。
