细胞毒性测定方法-康奈尔大学刘瑞海实验室实验方法

细胞毒性检测方法总结！细胞毒性(cytotoxic)是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。

有时需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选。

细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测，常用以下几种方法：MTT、XTT法：利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测一.LDH的方法：通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性其它酶方法：如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等细胞增殖能力分析试剂原理：正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质（如MTT、XTT、WST-1等）还原为紫色的结晶状的物质，沉积在细胞周围，然后通过酶标仪读取OD值，从而检测到细胞增值状态优点：1）快速：96孔培养板形式，可进行高通量检测。

2）灵活：可直接通过显微镜观察，也可通过酶标仪进行定量检测。

二.荧光素发光法细胞生存能力检测原理：腺苷酸激酶（AK）存在于所有真核和原核细胞的胞浆中，AK具有激活ADP 生成ATP。

当细胞受损后，细胞膜发生破损，AK会释放到培养上清中。

该试剂盒利用荧光素酶和荧光素在ATP作用下可以发光，通过化学发光仪可以定量进行检测。

特点： 1）简单、快速。

2）板式检测，可进行高通量。

三.LDH法细胞毒性检测原理：LDH（乳酸脱氢酶）是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应形成紫色的结晶物质，可通过500nm酶标仪进行检测。

通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度特点：1）方法简单，安全，不使用放射性物质2）可进行高通量检测。

加入底物 100ul/well 室温避光孵育15min
实验步骤
• 单细胞悬液的制备 1. 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。 2. 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有2ml 1640培养液的平皿内。 3. 用纱网将脾组织包裹住，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣 碎。然后用1000ul加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入50ml 离心管中，用剩 余2ml培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一50ml离心管中。 4. 1000rpm，常温离心10分钟，弃上清，加1ml 1640培养液重悬细胞。
LAK细胞并非是一个独立的淋巴群或亚群，而是NK细胞或T细 胞体外培养时，在高剂量IL-2等细胞因子诱导下成为能够杀 伤NK不敏感肿瘤细胞的杀伤细胞，称为淋巴因子激活的杀伤细 胞（lymphokine activated killer cells,LAK）。目前应用 LAK细胞过继免疫疗法（adoptive immunotherapy）与直接注 射IL-2等细胞因子联合治疗某些肿瘤，已获得一定的疗效。
(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲基化合物，在570nm波长处有一
吸收峰，利用读取的Ａ值，可测得杀伤细胞毒活性。
乳酸脱氢酶释放法
靶细胞 NK
YAC-1
杀伤
靶细胞 膜损伤
LDH 释放到细胞外
无色底物
LDH底物 还 原
测OD570值
有色物质
实验值-自发释放值
杀伤率( %)=
Max- S自发 ×100
• 细胞计数： 1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中， 混匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀后取 20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。 2. 调脾细胞浓度至1×107/ml，每组所需总量为1ml 3. 调YAC－1细胞浓度至1×106/ml，每组需2ml

celltiterblue实验步骤CellTiter-Blue细胞增殖试验是一种用于评估细胞毒性和细胞增殖的试验方法。

该试验利用了一种称为resazurin的荧光染料，当这种染料与活细胞中的代谢产物共同作用时，会产生荧光信号。

这种信号的强度可以反映出细胞的数量和活性，从而可以用来评估药物或其他化合物对细胞的毒性和影响。

CellTiter-Blue实验是一种非常常用的细胞毒性测试方法，它可以用于筛选潜在的药物候选物，评估不同化合物对细胞的影响，以及研究细胞增殖和代谢的变化。

在本文中，我们将介绍CellTiter-Blue 实验的步骤和操作流程，帮助读者了解如何进行这种实验。

一、准备工作在进行CellTiter-Blue实验之前，首先需要准备好所需的试剂和仪器设备。

其中包括培养基、细胞培养皿、吸光度计、多孔板、CellTiter-Blue试剂等。

另外，还需要将仪器进行预热和校准，确保实验的准确性和稳定性。

二、细胞准备1.选择合适的培养基和细胞培养条件，确保细胞可以正常生长和增殖。

2.将需要进行实验的细胞接种到培养皿或多孔板中，使其达到适当的密度。

3.将细胞培养在37℃、5% CO2的恒温培养箱中，使其恢复和适应培养条件。

三、实验操作1.将细胞培养基抽去，加入含有CellTiter-Blue试剂的新培养基，使其浓度达到终浓度。

2.将培养皿或多孔板放回恒温培养箱中培养一定时间，让CellTiter-Blue试剂和活细胞进行反应。

3.取出培养皿或多孔板，使用吸光度计测定反应后的荧光信号强度，从而评估细胞的数量和活性。

四、数据分析根据测得的荧光信号强度，可以计算出不同处理条件下的细胞增殖率或毒性影响。

通过比较不同处理条件下的信号强度，可以评估化合物对细胞的影响程度，从而获得相关的实验结果。

五、应用领域CellTiter-Blue实验可以广泛应用于药物筛选、毒性评估、细胞代谢和增殖研究等领域。

例如，可以用于评估化合物对肿瘤细胞的抗增殖作用，筛选抗肿瘤药物候选物；也可以用于评估化合物对正常细胞的毒性影响，以及研究细胞活性和代谢的变化。

细胞增殖—毒性实验步骤1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖—毒性实验步骤：实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂［细胞培养液（DMEM、1640)、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、胰酶（0.25% Trypsin—EDTA）、胎牛血清(FBS）、双抗］,所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。

显微镜下看细胞生长状态，有无污染。

1）倒去培养瓶内的培养液；2）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次；3)加入胰酶500ul/0。

5ml 2~10min（具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）;4）加入含10%FBS的培养液1～1.5ml[培养液：胰酶=（2～3）:1］中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜；6)将单细胞悬液吸入10～15ml离心管中,低速离心800rpm 3分钟,倒去上清液；7）加入含10%FBS细胞培养液1~2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液;8）吸取20ul细胞悬液(10ul细胞悬液+10ul台盼兰液:给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板,进行细胞计数；CCK-8实验：9）在96孔板中，给每孔加100μL(约7000个)的细胞悬液,将培养板放在培养箱预培养24-72小时（37℃，5％CO2），使细胞贴壁；10)向培养板中加入10μL不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物；11）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时(例如：6、12、24或48小时）（药物起作用);注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基)，去掉药物影响。

当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结实验原理：Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。

其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。

生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。

因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

一、用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。

二、优点：1.使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；K-8法能快速检测；K-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；K-8法的重复性优于MTT 法，MTT 实验生成的formazan 不是水溶性的，需要使用DMSO 等有机溶剂溶解；5.而本方法产生的formazan 是水溶性的，不仅省去了溶解步骤，更因此而减少了该操作步骤带来的误差；K-8法对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT 方法相比线性范围更宽，灵敏度更高；K-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。

三、所需设备及仪器：1. 10ul，100-200ul及多通道移液器2. 酶标仪（带有450nm滤光片）3. 96孔培养板4. 二氧化碳培养箱四、方法及步骤：实验一：细胞增殖分析1、制备细胞悬液：细胞计数。

2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（约1-2×104），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复。

3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。

4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。

细胞增殖-毒性实验步骤1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤：实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂[细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、胰酶（0.25% Trypsin-EDTA）、胎牛血清（FBS）、双抗]，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。

显微镜下看细胞生长状态，有无污染。

1）倒去培养瓶内的培养液；2）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次；3）加入胰酶500ul/0.5ml 2～10min（具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）；4）加入含10%FBS的培养液1～1.5ml[培养液：胰酶=（2～3）:1]中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜；6）将单细胞悬液吸入10～15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，倒去上清液；7）加入含10%FBS细胞培养液1～2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液；8）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数；CCK-8实验：9）在96孔板中，给每孔加100μL（约7000个）的细胞悬液，将培养板放在培养箱预培养24-72小时（37℃，5%CO2），使细胞贴壁；10）向培养板中加入10μL不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物；11）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时（例如：6、12、24或48小时）（药物起作用）；注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。

当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

要对结果进行分析，写出影响结果的因素，及 注意事项。
SI
50 40 30 20 10
0 100:1
Excel 作 图
NK杀伤实验
50:1 E：T
25:1
检测方法
1.1.1 alamarBlue一步荧光测定法 alamarBlue为活细胞代谢指示剂，易溶于水，进入细胞后经线粒体
酶促还原产生荧光及颜色变化，可用以定量。本法与51Cr释放法纺织 厂较有以下特点：①特异性相当但灵敏度更高，重复性好，组内及组 间差异很小。②使用方便，无需预先标记靶细胞及离心和洗涤步骤， 适用于大批量样品的高准确性自动测定。③alamarBlue的使用浓度不 影响细胞正常代谢及基因表达，可在无菌条件下测定后继续培养扩增 细胞，有利于对培养细胞的连续监测及深入研究。④还可测定淋巴细 胞增殖或化学物质的细胞毒性及细胞凋亡。⑤多种粘附或非粘附细胞 系、细菌、真菌等可用作靶细胞，所需效应细胞数较少（3×105/孔 即可）。⑥含胎牛血清（FCS）及酚红的培养液也不干扰测定结果
肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）活性测定
从肿瘤组织中分离到的淋巴细胞称为“肿瘤浸润性淋巴细胞” （TIL细胞），并发现这种细胞在体外经白细胞介素2刺激后可 大量增殖。这种刺激后增殖的TIL细胞又称之为“肿瘤来源的 激活细胞”。它具有比LAK细胞更强的特异的杀瘤活性。由于 其特异高效的杀瘤活性，在实验研究及临床应用中，已展现出 用于临床治疗肿瘤的良好前景。
加入底物 100ul/well 室温避光孵育15min
实验步骤
• 单细胞悬液的制备 1. 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。 2. 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有2ml 1640培养液的平皿内。 3. 用纱网将脾组织包裹住，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣 碎。然后用1000ul加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入50ml 离心管中，用剩 余2ml培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一50ml离心管中。 4. 1000rpm，常温离心10分钟，弃上清，加1ml 1640培养液重悬细胞。

引颈处死
吸取腹腔液
分别取实验组和对照组小鼠各1只，同时准备好玻片，做 好标记，分别取材，制备腹腔液涂片。
在干净的载玻片上滴加一滴生理盐水，向其中滴加一滴 腹腔液，静置10分钟，使腹水细胞贴壁，弃去生理盐水， 待其稍干后，进行瑞氏染色(浓染1-2min，淡染3-5min)。
未被吞噬的鸡红细胞
吞噬了鸡红细胞 的吞噬细胞
免疫细胞毒性检测
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能检测
目的要求
1．了解小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象的原理 2．熟悉细胞吞噬作用的基本过程 3．了解吞噬百分数和吞噬指数的计算方法及环磷酰
胺对腹腔巨噬细胞的毒性表现。
• 吞噬是单细胞动物摄取营养物质的主要方式，也是高等动 物的一种非特异性免疫防护机制。高等动物内的巨噬细胞 、单核细胞和中性粒细胞等具有吞噬功能，当病原微生物 或其他异物侵入机体时，巨噬细胞由于具有趋化性，会向 异物处聚集，将其内吞入细胞质，形成吞噬泡，然后吞噬 泡与溶酶体融合，将异物消化分解。
实验报告
• 镜检时，你能在视野中看到几种类型的细胞？ • 计算吞噬细胞的吞噬指数和吞噬百分数。
吞噬百分数=
活化的吞噬细胞的数量 100个吞噬细胞
吞噬指数=
活化的吞噬细胞中吞噬的鸡红细胞的总量 100个活化的吞噬细胞
吞噬百分数实验组对照组来自吞噬百分数平均值 吞噬指数
吞噬指数平均值
在实验组和对照组小鼠腹腔液涂片上各随机选取3-5个视 野，统计各视野内的吞噬百分数和吞噬指数，并对结果 进行统计学分析（独立样本T检验），比较两组数据有无 显著性差异。
2．试剂： 0.85%生理盐水；阿氏（Alsever）血液保存液；
蛋白胨2.0g加水100ml灭菌备用，环磷酰胺。 3．材料：小白鼠；1%鸡红细胞悬液

细胞毒理实验技巧与注意事项细胞毒理实验是研究物质对细胞的毒害程度和机理的重要手段之一。

进行细胞毒理实验需要掌握一系列实验技巧和注意事项，以确保实验的准确性和可靠性。

本文将介绍细胞毒理实验的常用技巧，并提供实验中需要注意的事项。

一、细胞培养技巧1. 细胞培养基的选择：选择适合细胞生长和发育的培养基，如DMEM、RPMI-1640等。

根据具体需要，可以添加适量的血清、培养液和抗生素。

2. 细胞传代的控制：定期进行细胞传代，避免细胞密度过高或过低。

细胞密度过高容易导致细胞凋亡，密度过低则会影响细胞生长。

3. 细胞的培养环境：确保培养箱内的温度、湿度和二氧化碳浓度稳定，以提供恒定的培养环境。

二、细胞毒性实验技巧1. 细胞暴露：根据实验需要，将待测试物质添加到细胞培养基中，使细胞与物质发生接触。

通常使用不同浓度的待测物质进行处理。

2. 细胞存活测定：细胞毒性实验的重要指标之一是细胞存活率。

常用方法包括MTT（3-(4,5-二甲基-2-噻唑啉基)-2,5-二苯基四唑盐）法、细胞计数法和荧光染色法等。

3. 細胞凋亡检测：细胞毒性实验中，往往需要检测细胞凋亡情况。

常用的检测方法有DNA凝胶电泳、细胞周期分析和Annexin V-FITC/PI染色等。

三、细胞毒性实验注意事项1. 控制实验组：在进行细胞毒性实验时，除了待测物质组外，还应设立阴性对照组和阳性对照组。

阴性对照组即细胞培养基组，阳性对照组则是已知对细胞有毒的物质组，以用于对比分析。

2. 重复实验：为了确保实验的可靠性，通常需要至少重复3次以上，以获得平均值和标准差。

同时，每次实验的重复次数也要保持一致。

3. 外源污染的避免：细胞培养实验中，外源污染的出现会严重影响实验结果。

因此，要确保实验条件干净、无菌，并采取相应的防护措施。

4. 合理的数据分析：对实验结果进行适当的统计学分析，使用合适的图表和数据处理工具，以得出准确的结论。

综上所述，细胞毒理实验是一项复杂而重要的实验工作。

免疫学实验
NK细胞毒检测
·1·
NK细胞活性检测
免疫学实验
❖自然杀伤细胞（NK）介导天然免疫应答，它不 依赖抗体和补体，即能直接杀伤靶细胞，如肿瘤细 胞或被病毒感染的细胞等；此外，尚有免疫调节功 能，也参与移植排斥反应和某些自身免疫病的发生 发展。 ❖NK细胞活性可作为判断机体抗肿瘤和抗病毒感 染的指标之一。例如在血液系统肿瘤、实体瘤、免 疫缺陷病、艾滋病和某些病毒感染患者，NK活性 减低；宿主抗移植物反应者，NK活性升高。
4. 1000rpm，常温离心10分钟，弃上清，加1ml 1640培养液重悬细胞。 ❖ 细胞计数：
1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中， 混匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀 后取20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。
1. 小鼠 (NS,OVA)
1只/组
2. YAC-1
1*106 * 2ml
3. 培养液（DMEM) 无FCS 10ml/组
4. 培养液(DMEM)10%FCS
10ml/组
3. LDH底物
3ml/组
4. 柠檬酸（终止液） 1ml/组
·4·
原理
免疫学实验
➢ NK（natural killer ）细胞属非特异性免疫细胞，为机 体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与T、B细胞并列的 第三类群淋巴细胞。 ➢ NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既 不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。 ➢YAC-1细胞为Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV)感染 的鼠T淋巴瘤细胞，对NK细胞敏感，可用于检测NK细胞的 杀伤活性。

药物毒理学中的细胞毒性评估方法药物毒理学是一门研究药物对生物体产生毒副作用的学科。

在新药开发过程中，对于药物毒理学的评价具有重要意义。

其中，细胞毒性的评估是药物毒理学研究中不可缺少的环节。

因此，本文将介绍药物毒理学中的细胞毒性评估方法。

细胞毒性的评估方法一般分为体外细胞实验和体内实验两种。

其中，体外实验是药物毒理学过程中重要的步骤，通过研究药物在人体外部对细胞的影响，能够帮助研究人员评估药物在体内的细胞毒性。

体外实验中，最常用的细胞系是人类癌细胞系或小鼠细胞系，这些细胞系的繁殖能力强，生长条件稳定，可大幅缩短实验周期。

一般情况下，细胞毒性评估实验中，人类肝肾细胞常被用作研究对象，因为它们在体内发挥的生理功能和代谢作用紧密相连。

其中，肝细胞的毒性评估尤为重要，因为药物通常是通过肝脏进行代谢和分解。

一、MTT法（三(4,5-二甲基噻唑-2-基) -2,5-二苯基四唑-溴化物法）MTT法是一种简单、快速和可靠的测定系统，用来评估药物对细胞中代谢活性的影响。

该方法的基本原理是：细胞吸收MTT（3 - (4,5-二甲基-2-噻唑）-2,5-二苯基四唑），通过细胞内线粒体的活性将其还原为其水溶性甲醛基甲基紫晶体紫色产物。

产生的这种产物沉淀在细胞形成的胞外矩阵内，从而逐渐形成紫色晶体，晶体的数量正比于活细胞的数量，从而被用来评估细胞活性。

二、清除自由基方法自由基是许多细胞毒素产生的主因，它们可以对细胞膜、DNA、核蛋白的结构造成不可修复的损害，从而导致细胞死亡。

因此，清除细胞内自由基的方法被广泛地应用于细胞毒性评估中。

目前常用的清除自由基方法是通过给予体内或外源性抗氧化剂，如超氧化物歧化酶，抗坏血酸，山梨醇等。

这些抗氧化剂可以与自由基发生反应，从而减少其对细胞的损害。

三、细胞凋亡检测细胞凋亡是由于外界因素刺激所引起的程序性死亡，是药物毒理学研究中常见的一种现象。

在研究中，通过凋亡指标的检测可以帮助确定药物是否可以触发细胞凋亡，以及细胞凋亡的程度。

celltiter glotm法CellTiter-Glo™法是常用的细胞增殖和细胞毒性试验方法之一。

本文将针对CellTiter-Glo™法的原理、步骤、优点以及适用范围进行详细的阐述。

1. CellTiter-Glo™法的原理CellTiter-Glo™法基于细胞酶促反应测定细胞数量和代谢活性。

在细胞增殖过程中，ATP的合成与新细胞合成相关，ATP的浓度可以反映出细胞的数量和代谢活性。

通过加入琼脂糖酶和Luciferin酶的底物，测量生成的发光来量化ATP。

发光信号与细胞数量和代谢活性成正比。

2. CellTiter-Glo™法的步骤2.1 细胞处理将待测样品细胞加入到96孔板中，并处理所需实验条件。

2.2 加入CellTiter-Glo™酶底物CellTiter-Glo™酶底物中的Luciferin和琼脂糖酶被加入到每个孔中。

这样可以使样品中的ATP分子被氧化成AMP，并向空气中释放出荧光素，产生明亮的发光信号。

2.3 孔板震荡和孔板读数孔板需要进行震荡，并在一个较低的荧光素的温度下保存。

最后可以通过流明计或微孔板读板仪进行测量和分析。

3. CellTiter-Glo™法的优点3.1 短时间内得出准确结果CellTiter-Glo™法可以在20到30分钟内得到结果，且结果十分准确。

与传统的MTT法相比，CellTiter-Glo™法对时间很敏感，可以准确地检测细胞数量和活力。

3.2 易于操作CellTiter-Glo™法操作简单，只需要一些基本设备，无需过多的设备和特殊技能。

3.3 可靠性高CellTiter-Glo™法的可靠性高，其误差小，预测结果准确，具有较强的实验稳定性。

4. CellTiter-Glo™法的适用范围CellTiter-Glo™法可用于一系列应用，如：4.1 细胞增殖和细胞毒性筛选CellTiter-Glo™法可用于细胞增殖和细胞毒性的筛选。

对于细胞相关的研究项目，这是非常有帮助的。

细胞毒性分级标准mtt细胞毒性分级标准mtt是一种常用的细胞毒性评价方法，通过对细胞代谢活性的测定，可以评估化合物对细胞的毒性作用。

该方法常用于药物筛选、毒性评价、环境污染物检测等领域，具有操作简便、结果可靠的特点。

下面将介绍细胞毒性分级标准mtt的原理、操作步骤和数据分析方法。

原理：细胞毒性分级标准mtt的原理是利用细胞内还原酶的活性，将黄色的mtt（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物）显色为紫色的甲醛溶液，然后用溶剂将细胞内的紫色产物溶解出来，最后用酶标仪测定其吸光值，从而反映细胞的代谢活性。

细胞毒性程度与mtt还原的程度成正比，细胞毒性越强，mtt还原的程度越低。

操作步骤：1. 细胞接种，将细胞悬液均匀地加入到培养皿中，使细胞在培养皿底均匀分布。

2. 处理试剂，将待测化合物按照一定浓度加入到培养基中，与细胞共同培养一定时间。

3. 加入mtt溶液，在培养基中加入mtt溶液，使细胞与mtt溶液充分接触。

4. 加入甲醛溶液，将mtt溶液吸除后，加入甲醛溶液，使mtt还原产物显色。

5. 加入溶剂，将甲醛溶液吸除后，加入溶剂将mtt还原产物溶解出来。

6. 吸光值测定，用酶标仪测定吸光值，计算出细胞的代谢活性。

数据分析方法：根据吸光值的测定结果，可以计算出细胞的存活率或细胞毒性程度。

一般来说，吸光值越高，代表细胞的代谢活性越强，细胞存活率越高；吸光值越低，代表细胞的代谢活性越弱，细胞毒性越大。

根据实验需要，可以将数据进行统计分析，得出化合物对细胞的毒性分级标准。

细胞毒性分级标准mtt是一种简便、可靠的细胞毒性评价方法，广泛应用于药物筛选、毒性评价等领域。

通过对mtt的还原程度进行测定，可以快速准确地评估化合物对细胞的毒性作用，为药物研发和环境监测提供重要参考。

希望本文对您了解细胞毒性分级标准mtt有所帮助。

供试品厚度（mm） ≤0.5
＞0.5~1.0 ＞1.0
表面积或重量与浸提液体积的比例 6cm2/ml 3cm2/ml
1.25cm2/ml
不规则形状
0.2g/ml
表 2 浸提条件
浸提温度（℃）
浸提时间（小时）
37±1 37±1 50±2 70±2
24±2 72±2 72±2 24±2
检查法 第一法 相对增殖度法 阴性对照液 为不加供试品的细胞培养液。 阳性对照液 6.3％苯酚的细胞培养液 测定 取 33 个培养瓶，分别加入细胞悬液 1ml，细胞培养液 4ml，置 37℃±2℃，5％二氧 化碳的条件下培养 24 小时。培养 24 小时后弃去原培养液。 阴性对照组：取 13 个培养瓶加入 5ml 阴性对照液；阳性对照组：取 10 个培养瓶加入 5ml 阳性对照液；试验组：取 10 个培养瓶加入 5ml 含 50％供试液的细胞培养液，置 37℃±2℃，5％ 二氧化碳的条件下继续培养 7 天。
结果评价 生物毒性（细胞退化和畸变）按 0～4 级（见表 5）评价和分级。记录样品、阴
性、阳性细胞培养基的现象。如阴性对照为 0 级（无毒）、阳性对照不小于 3 级（中等毒），则
细胞培养基试验系统有效。若试验系统不成立，重复试验。样品不大于 2 级（轻微毒），则样品
判为合格。
365
分级 0 1 2 3 4
切成 0.5cm×2cm 条状，用湿热灭菌或紫外线照射消毒后，置玻璃容器内。除另有规定外，按表
1 加入氯化钠注射液或无血清培养基作为浸提液，使浸提液浸没供试品，按表 2 选择浸提条件（若
采用含血清培养基，应用 37℃±1℃、24 小时±2 小时的条件），浸提，即得。
表 1 供试品表面积或重量与浸提液的比例

细胞毒计算公式
细胞毒性的计算公式有多种，以下是其中两种常见的公式：
1.细胞毒性（%）=〔反应孔OD（490 nm）-自然释放孔OD（490 nm）/最大释放孔
OD（490 nm）-自然释放孔OD（490 nm）〕× 100%。

这个公式通常用于LDH释放法计算细胞毒性。

在这个方法中，首先测量不同浓度毒性物质处理后细胞的LDH释放量，然后通过酶标仪测量490 nm处的吸光度值，最
后代入公式计算细胞毒性。

2.%细胞毒性=[1-（对应浓度梯度450nm吸光度-空白培养基对照)/（未处理细胞组吸
光度-空白培养基对照）]×100。

这个公式是另一种常见的细胞毒性计算公式。

在这个方法中，也需要测量不同浓度毒性物质处理后细胞的吸光度值，但使用的是450 nm处的吸光度值，并且需要设置一个空白培养基对照和一个未处理细胞组对照。

请注意，具体的计算方法可能因实验方法、试剂和仪器的不同而有所不同。

在实际应用中，应根据具体的实验条件和要求选择适当的公式进行计算。

免疫学研究中的细胞毒性检测细胞毒性检测在免疫学研究中扮演着非常重要的角色，它可以帮助科学家们快速检测药物和化合物对于人体免疫系统的影响，进一步了解人体免疫系统的机制。

在本文中，我们将探讨细胞毒性检测的意义、常用的方法和最新的技术进展。

一、细胞毒性检测的意义免疫系统是人体非常重要的生物防御系统，对于细菌、病毒以及其他病原体的攻击有着重要的作用。

人体免疫系统的机制非常复杂，包括多种细胞、分子和化合物的相互作用。

因此，为了了解何种新的方法可以用于改进人体免疫系统的保护机制，科学家们必须对于细胞毒性进行深入的研究。

细胞毒性即药物或化合物对于生物体细胞的危害程度。

通过进行细胞毒性检测，科学家们可以快速评价药物或化合物对人体免疫系统的影响，进而筛选出对人体免疫系统具有良好保护作用的化合物，这一过程为新药物的开发提供了有力的支持。

二、常用的细胞毒性检测方法1. 三（四）-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)法MTT法是最常用的细胞毒性检测方法之一。

首先，将各种药物或化合物与细胞分离液混合，培养数小时后再加入MTT液。

MTT液会与细胞代谢活跃的细胞线粒体结合并转换成紫色的甲酸盐晶体，浓度越高颜色越深。

然后，将培养基离心，除去上清液，并加入去甲酸盐来溶解甲酸盐晶体。

然后，通过测定吸光度就可以确定DNA修复的程度。

这一方法基于细胞线粒体对药物或化合物的敏感性，更能判定细胞毒性。

2. 流式细胞仪流式细胞仪是根据化合物对细胞表面标记的影响来评估细胞毒性的方法。

流式细胞仪利用荧光标记的细胞表面抗原，标记荧光标记物可以方便地对单一细胞进行检测。

例如，通过胸腺细胞中芳香族氨基酸受体的测定，可以在个体细胞水平上检测细胞毒性。

3. 细胞增殖/生存检测这种方法可以通过细胞增殖和生存率的减少以评估细胞毒性。

常用的方法包括白细胞介素-2（IL-2）生存下调和释放（ELISPOT或ELISA），它处理样本集的特定子集，例如CD4 + T细胞或CD8 + T细胞，通过检测其生存下调来评估细胞毒性。