细胞毒性实验方案上课讲义
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细胞毒理学实验免疫细胞毒性检测
引颈处死
吸取腹腔液
分别取实验组和对照组小鼠各1只，同时准备好玻片，做 好标记，分别取材，制备腹腔液涂片。
在干净的载玻片上滴加一滴生理盐水，向其中滴加一滴 腹腔液，静置10分钟，使腹水细胞贴壁，弃去生理盐水， 待其稍干后，进行瑞氏染色(浓染1-2min，淡染3-5min)。
未被吞噬的鸡红细胞
吞噬了鸡红细胞 的吞噬细胞
免疫细胞毒性检测
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能检测
目的要求
1．了解小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象的原理 2．熟悉细胞吞噬作用的基本过程 3．了解吞噬百分数和吞噬指数的计算方法及环磷酰
胺对腹腔巨噬细胞的毒性表现。
• 吞噬是单细胞动物摄取营养物质的主要方式，也是高等动 物的一种非特异性免疫防护机制。高等动物内的巨噬细胞 、单核细胞和中性粒细胞等具有吞噬功能，当病原微生物 或其他异物侵入机体时，巨噬细胞由于具有趋化性，会向 异物处聚集，将其内吞入细胞质，形成吞噬泡，然后吞噬 泡与溶酶体融合，将异物消化分解。
实验报告
• 镜检时，你能在视野中看到几种类型的细胞？ • 计算吞噬细胞的吞噬指数和吞噬百分数。
吞噬百分数=
活化的吞噬细胞的数量 100个吞噬细胞
吞噬指数=
活化的吞噬细胞中吞噬的鸡红细胞的总量 100个活化的吞噬细胞
吞噬百分数实验组对照组来自吞噬百分数平均值 吞噬指数
吞噬指数平均值
在实验组和对照组小鼠腹腔液涂片上各随机选取3-5个视 野，统计各视野内的吞噬百分数和吞噬指数，并对结果 进行统计学分析（独立样本T检验），比较两组数据有无 显著性差异。
2．试剂： 0.85%生理盐水；阿氏（Alsever）血液保存液；
蛋白胨2.0g加水100ml灭菌备用，环磷酰胺。 3．材料：小白鼠；1%鸡红细胞悬液
细胞毒实验的分类原理性检测方法与应用上课课堂
最大释放均值（Max）=最大释放孔cpm均值-最大释放对照孔cpm均值 自发释放均值（S自发）=自发释放孔cpm均值-培养基对照孔cpm均值
无菌取脾 研磨成单细胞悬液+2ml 1640
（无FBS)
细胞计数 【?/ml】 取20ul细胞+980ul的1640 混匀后取出20ul细胞+20ul台盼蓝
操作流程
行测定。
• 因此多年来人们一直试图寻找可以替代51Cr释放法的 CTL活性测定方法，如采用荧光标记、流式细胞分析 和报告基因等技术的灵敏可靠、简单易行的非同位素 测定法。
MTT（或MTS）还原法
本法根据细胞代谢活动与活细胞数直接成比例的原理，通过测定靶细 胞代谢活性的减少来反映效应细胞所致靶细胞的死亡。氧化型MTT进 入细胞后被线粒体脱氢酶还原生成蓝色formazan颗粒，经溶剂溶解后 比色定量，其颜色深浅直接与活细胞数有关，与靶细胞对照孔比较可 计算效应细胞杀伤靶细胞%。本法简便易行，无需预标靶细胞，与 51Cr释放法比较相关性好，还可测定淋巴细胞增殖活性和NK细胞活性。 MTT类似物MTS在细胞内还原的formazan产物具有水溶性，性质较稳定， 其测定简单快捷，特别适合于大批量测定。微生物污染可导致本法假 阳性结果。
验记录本上。
要对结果进行分析，写出影响结果的因素，及注意事项。
SI
50 40 30 20 10
0 100:1
Excel 作 图
NK杀伤实验
50:1 E：T
25:1
检测方法
1.1.1 alamarBlue一步荧光测定法 alamarBlue为活细胞代谢指示剂，易溶于水，进入细胞后经线粒体
酶促还原产生荧光及颜色变化，可用以定量。本法与51Cr释放法纺织 厂较有以下特点：①特异性相当但灵敏度更高，重复性好，组内及组 间差异很小。②使用方便，无需预先标记靶细胞及离心和洗涤步骤， 适用于大批量样品的高准确性自动测定。③alamarBlue的使用浓度不 影响细胞正常代谢及基因表达，可在无菌条件下测定后继续培养扩增 细胞，有利于对培养细胞的连续监测及深入研究。④还可测定淋巴细 胞增殖或化学物质的细胞毒性及细胞凋亡。⑤多种粘附或非粘附细胞 系、细菌、真菌等可用作靶细胞，所需效应细胞数较少（3×105/孔 即可）。⑥含胎牛血清（FCS）及酚红的培养液也不干扰测定结果
细胞毒性实验
4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。
若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5.终止培养，小心吸去孔内培养液。
6.每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）悬浮细胞：1）收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 l?g/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。
每板设对照（加100?(储存液100 1640）。
2）置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。
（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）4）离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。
5）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
（三）MTT的配制MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
细胞毒性讲义ppt课件
MTT、XTT法：利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行 转化，然后通过酶标仪进行检测 LDH的方法：通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性 其它酶方法：如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等
细胞形态 学观察
细胞毒性检测
细胞生长 状态观察
代谢活性
细胞活性检测 指标
膜电位
细胞膜对核酸染料的通透性
0.0865 0.5553 15.58
0.04325 0.5553 7.79
0.0365 0.5553 6.57
经验与技巧
• 细胞接板
• 待测物质处理细胞 • 弃去反应液 • DMSO溶解formazan
哪些产品需要进行 细胞毒性试验？
与人体接触或植入体内的医疗器械都需要 进行细胞毒性试验。 接触部位： 1）表面：皮肤、粘膜、损伤表面 2）外部接入：血路间接、组织/骨/牙、 循环血液 3）体内植入：组织/骨、血液
i) 结果计算：
(1) 细胞存活率%=加药细胞的OD值/对照细胞的OD值* 100 (2) LOEC (lowest observed effect concentration) IC50 (concentration leading to a 50% decrease of cell growth) ：T/C=50% 约 20 uM ，即21.65 uM
噻唑蓝比色法
噻唑蓝（MTT）比色法是目前应用最广泛的一种检验细胞 活性的方法 原理：线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为难 溶解的蓝色结晶Formazan
Formazan 含量
细胞活性
琥珀酸脱 氢酶活性
试验材料：细胞系
推荐使用ATCC CCL1(NCTC clone 929)[小鼠 成纤维细胞]或ATCC CCL2 (Hela)[人上皮细胞]。 如能证明试验的重现性和精确性，也可选用 其他细胞系。优先采用已建立的细胞系并应从 认可的贮源获取。 用选定的细胞系和培养基制备试验所需的细胞。 使用冻存细胞时, 如加有细胞保护剂应除去, 使 用前至少传代培养一次。
最新补体介导的细胞毒实验课件ppt(完整版幻灯片课件
取景器
闪光触点
快门速度调节盘 卷片扳手
数码相机
奥林巴斯 C-750
SONY DSC-F717
视频展示台
视频展示台
视频展示台的基本工作过程是：利用摄像头 将展示台上的景物转换成视频信号，再通过电视 机或投影仪播放，其工作原理实际上和摄像机相 同，是一种图像信号采集设备。
利用视频展示台可以将文字、图片、实物等 转换成视频信号，也可以将透明胶片、幻灯片甚 至活动的图片等转换成视频信号。
补体介导的细胞毒实验课件PPT （完整版）
补体的作用和激活途径
❖ 补体的作用 ▪ 溶菌和溶细胞 ▪ 促进中和溶解病毒 ▪ 调理吞噬 ▪ 炎症介质
❖ 补体的激活途径 ▪ 经典途径 ▪ 旁路途径 ▪ MBL途径
操作步骤
一、小鼠胸腺/脾 脏细胞悬液的
胸腺
制备
4~6周龄小鼠
断颈处死，取出胸
脾脏
腺/脾脏放至含有
4、打开投影仪电源开关。 5、调整反射镜的方向及张角，使投射出的光线照
向银幕。 6、将投影胶片放置在投影仪玻璃面上。调整调焦
旋钮使投影出的画面清晰。 7、再次调整反射镜，使投影画面处于银幕中适当
位置。
光学投影仪注意事项
1、不要触摸及随意擦拭反射镜。 2、投影仪在工作中，不得遮挡其进出散热风
现代教育传播媒体 –主要包括投影、电声、电视、计算机、通信网 络等等。
教育传播媒体的功能
1.传递信息 2.存储信息
现代教育传播媒体的特殊作用
1. 给教学活动提供具体的经验 2. 使学习者的思维活动正确 3. 改善学习者的行为态度 4. 优化教育教学过程
教育传播媒体的基本特性
1. 选择性； 2. 组合性； 3. 刺激递减性；
细胞毒性实验方案
细胞毒性实验设计方案1.准备材料：DMEM(高糖 ) 胰酶双抗( 青霉素/ 链霉素） DAPIMTT(5mg/mL) DMSO PBS 4% 多聚甲醛指甲油6孔培养板96 孔培养板超薄载玻片培养瓶 (25mL) 一包 0.45μm 滤膜灭菌： 50mL ， 10mL， 5mL离心管两种枪头2. 实验方案本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅（SiO2-SS-HA/DOX），在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时夹心二氧化硅中药物得以释放。
本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化硅（ SiO2-SS-HA/DOX）的细胞毒性。
实验组为 SiO2-SS-HA/DOX、SiO2-SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞 , 分别采用 HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和 L929成纤维细胞为正常细胞模型。
SiO2-SS-HA/DOX、采用HepG2 人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO2-SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞。
培养基中含有 10%(v/v) FBS和 1%(w/v) 双抗 ( 青霉素 / 链霉素 ) 。
配制不同浓度的 SiO2 -SS-HA/DOX、SiO2 、HA、DOX药物载体培养基溶液。
(1). 以 HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型:培养基的配置：双抗1% 血清 12% DMEM 87%具体操作步骤：细胞的复活：①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入 37℃温水中，使细胞快速溶解。
②将悬浮的细胞移至离心管中，加 5mL 无血清培养基， 1000rmp,5min 离心去上清，再加 5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。
（每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。
）③将培养瓶放入培养箱中培养。
细胞的传代：将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中 2mL，冻存于 -20 ℃，每次使用一管，避免反复冻融。
①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷 75%的酒精放入超净台。
细胞毒性实验方案
---细胞毒性实验设计方案1.胰酶双抗( 青霉素/ 高DMEM( 糖)链霉素）DAPI准备材料：MTT(5mg/mL) DMSO PBS 4% 指甲油6 孔培养板多聚甲醛培养瓶(25mL) 96 孔培养板超薄载玻片一包0.45滤膜m μ灭菌：50mL ，10mL，5mL离心管两种枪头2. 实验方案材料本实验所用的为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅（SiO2-SS-HA/DOX），在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时SiO2-本实验的夹心二氧化硅中药物得以释放。
目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化硅（，SiO2-SS-HASiO2-SS-HA/DOXSS-HA/DOX）的细胞毒性。
实验组为、、DOX成纤维细胞为正常人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和分别采用, HepG2 L929空白对照组为纯细胞细胞模型。
SiO2-SS-HA/DOX、HepG2 人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为采用1%(w/v) DOXSiO2-SS-HA、，空白对照组为纯细胞。
10%(v/v)培养基中含有FBS和、、。
配制不同浓度的链霉素青霉素双抗( / ) SiO2 -SS-HA/DOXSiO2 HA药物载、DOX体培养基溶液。
:HepG2以人肝癌细胞为肿瘤细胞模型(1).12% DMEM 87%1%血清培养基的配置：双抗具体操作步骤：细胞的复活：℃温水中，使细胞快速溶解。
②将悬浮的细①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37 无血清培养基，5mL 胞移至离心管中，加1000rmp,5min 离心（每次转移时，将之前的离心管洗涤，5mL去上清，再加有血清培养基，转移至培养瓶中。
并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。
）③将培养瓶放入培养箱中培养。
细胞的传代：℃，每次使用一管，避的胰酶分装至小离心管中，0.25%将，冻存于2mL每个管中-20免反复冻融。
的酒精放入超净台。
②将培养液倒入废液75%①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷缸，操作完成后，残留培养基用吸管吸干净，培养瓶口------用火烧。
细胞毒性讲义
d) 弃去原培养液，每孔加入100μL的空白对照液，阴性 对照液，阳性对照液，100％ 和50％浓度的试验样品 浸提液。每组至少设8孔。 e) 置含5％二氧化碳的二氧化碳培养箱, 在7℃±2℃温度 下进行培养。培养间期可分为24h、48h、72h。 f) 每个培养间期后,每孔加入MTT溶液20μl，置含5％二 氧化碳的二氧化碳培养, 在37℃±2℃温度下培养5小 时。 g) 弃பைடு நூலகம்孔内液体，每孔分别加入200μl DMSO，将培养 板放置10分钟，水平振摇使孔内溶液颜色均匀。 h) 用酶标仪测定吸光度，可采用双波长测定，选用的波 长可为570nm和630nm。
噻唑蓝比色法
噻唑蓝（MTT）比色法是目前应用最广泛的一种检验细胞 活性的方法 原理：线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为难 溶解的蓝色结晶Formazan
Formazan 含量
细胞活性
琥珀酸脱 氢酶活性
试验材料：细胞系
推荐使用ATCC CCL1(NCTC clone 929)[小鼠 成纤维细胞]或ATCC CCL2 (Hela)[人上皮细胞]。 如能证明试验的重现性和精确性，也可选用 其他细胞系。优先采用已建立的细胞系并应从 认可的贮源获取。 用选定的细胞系和培养基制备试验所需的细胞。 使用冻存细胞时, 如加有细胞保护剂应除去, 使 用前至少传代培养一次。
有几类细胞毒性试验方法？
GB/T 16886.5－2003/ISO 109935:1999中推荐了三类细胞毒性试验： 1） 浸提液试验 2）直接接触试验 3）间接接触试验（包括琼脂扩散试 验、滤膜扩散试验）
常用的细胞毒性试验方法
• 浸提液试验（MTT）比色法 或MTT法： 哺乳动物胞的线粒体酶可将黄绿色的MTT降 解形成蓝紫色的物质，用二甲基亚砜 （DMSO）将其溶解成溶液，用酶标仪测定 其浓度，从而定量测定细胞的存活比例。该 试验用于细胞毒性细定量评价。对该试验有 干扰的供试品不适于本试验。
细胞毒性药物安全PPT课件
第18页/共61页
•防止皮肤直接接触药物或被玻璃包装刺破。 一旦造成皮肤接触或破损应立即用清水清洗 并到急诊科作清创和消毒处理，避免或减轻 不必要的伤害。
第19页/共61页
•2、药师调配细胞毒性药物处方时，注意检查 药品性状，看是否有破损、污染或变性，准 确调配，选择相应排药框，确认无误后签名， 由另一人进行核对。
第41页/共61页
•之后可输注一些辅助性治疗药，如促肝细胞 生长素、亚叶酸钙、参芪扶正等，以最大程 度的减少不良反应的发生，减少因细胞毒性 药物治疗同时带来对机体的损害。
第42页/共61页
2、水化疗法：
•大剂量使用铂类药物时，建议用水化疗法， 以减少其对病人肾脏的损害。如顺铂 ≥100mg/m2一次大剂量给药时，则通常需 要连续水化4天，即用药前一天加用药的三天， 输液中可酌情给予呋塞米等利尿剂加强利尿 并注意电解质变化。
• 细胞毒性药物一直是治疗肿瘤的基础药物，在抗肿瘤药物中占有很大的比例。然而细胞毒性药物的危害性 也是众所周知的。其可通过皮肤接触或吸入等方式造成包括生殖、泌尿、肝肾等系统的毒害，同时具有致 畸、免疫抑制及损害生育功能等不良反应[1]。
第1页/共61页
• 由于我们对此类药物缺乏规范化管理、药品调配、使用过程中设备不全、调配人员在工作中未加强职业防 护以及此类药物的医疗废弃物缺乏规范化管理等原因，导致其对院内环境及工作人员和病人的健康安全等 构成很大威胁，医务人员和患者在药物使用过程中发生的不良反应和造成的伤害屡见不鲜。
第20页/共61页
• 核对药师应坚持“四查十对”，特别是科别、诊 断、姓名、年龄、药品、剂型、规格、数量、用 法用量，同时在排药框内并放入两只洁净包装袋 （一只用于盛放配好的输液，另一只以备调配结 束后盛放医疗废弃物），然后进行核对签名，分 病区、分药品类别分别存放以备次日调配。
•防止皮肤直接接触药物或被玻璃包装刺破。 一旦造成皮肤接触或破损应立即用清水清洗 并到急诊科作清创和消毒处理，避免或减轻 不必要的伤害。
第19页/共61页
•2、药师调配细胞毒性药物处方时，注意检查 药品性状，看是否有破损、污染或变性，准 确调配，选择相应排药框，确认无误后签名， 由另一人进行核对。
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•之后可输注一些辅助性治疗药，如促肝细胞 生长素、亚叶酸钙、参芪扶正等，以最大程 度的减少不良反应的发生，减少因细胞毒性 药物治疗同时带来对机体的损害。
第42页/共61页
2、水化疗法：
•大剂量使用铂类药物时，建议用水化疗法， 以减少其对病人肾脏的损害。如顺铂 ≥100mg/m2一次大剂量给药时，则通常需 要连续水化4天，即用药前一天加用药的三天， 输液中可酌情给予呋塞米等利尿剂加强利尿 并注意电解质变化。
• 细胞毒性药物一直是治疗肿瘤的基础药物，在抗肿瘤药物中占有很大的比例。然而细胞毒性药物的危害性 也是众所周知的。其可通过皮肤接触或吸入等方式造成包括生殖、泌尿、肝肾等系统的毒害，同时具有致 畸、免疫抑制及损害生育功能等不良反应[1]。
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• 由于我们对此类药物缺乏规范化管理、药品调配、使用过程中设备不全、调配人员在工作中未加强职业防 护以及此类药物的医疗废弃物缺乏规范化管理等原因，导致其对院内环境及工作人员和病人的健康安全等 构成很大威胁，医务人员和患者在药物使用过程中发生的不良反应和造成的伤害屡见不鲜。
第20页/共61页
• 核对药师应坚持“四查十对”，特别是科别、诊 断、姓名、年龄、药品、剂型、规格、数量、用 法用量，同时在排药框内并放入两只洁净包装袋 （一只用于盛放配好的输液，另一只以备调配结 束后盛放医疗废弃物），然后进行核对签名，分 病区、分药品类别分别存放以备次日调配。
医学检验·检查项目：淋巴细胞毒试验_课件模板
相关疾病：
慢性淋巴细胞性白血病、急性白血病、脑 瘤、骨的原发性淋巴瘤、何杰金病、胆管 癌、胆囊癌、肺癌、颈淋巴结结核、腺泡 细胞癌、腺样囊性癌、尿道癌、喉癌、乳 头状囊腺癌、鳞状细胞癌。
谢谢！
医学检验·各论：淋巴细胞毒试验 >>>
相关检查： 异形淋巴细胞、骨髓淋巴细胞系统、淋巴 细胞计数（L）、糖链抗原19-9、糖链抗 原242、糖链抗原72-4。
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相关症状： 浅表淋巴结肿大、淋巴增生、淋巴结退化、 淋巴发育不全、进行性消瘦、消瘦。
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简介：
殊设备，只需用显微镜计数靶细胞的存活 数，操作比较方便。后者则是用125I-脱 氧脲嘧啶核苷或51Cr标记靶细胞，以放射 性同位素的释放作为靶细胞受损伤的指标。 此法需要特殊设备如液闪仪等，但可自动 测量，结果重复性好。
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医学检验·各论 淋巴细胞毒试验
内容课件模板
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简介：
当特异的效应T淋巴细胞在体外与靶 细胞接触时，可表现出破坏和溶解靶细胞 的特性，称为淋巴细胞毒作用 (cytotoxicity)。靶细胞可以是肿瘤细胞 或其它组织细胞。淋巴细胞杀伤靶细胞的 方式可通过直接杀伤或产生淋巴因子破坏 靶细胞。本试验方法有形态检查法和同位 素释放法两种。前者不需特
临床意义：
本试验可以作为体外测定肿瘤患者细 胞免疫的指标;也可以通过测定机体免疫 活性细胞杀伤肿瘤细胞的能力，来判断肿 瘤患者的预后;还可以鉴定淋巴细胞的功 能性亚群。
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简介：
当特异的效应T淋巴细胞在体外与靶 细胞接触时，可表现出破坏和溶解靶细胞 的特性，称为淋巴细胞毒作用 (cytotoxicity)。靶细胞可以是肿瘤细胞 或其它组织细胞。淋巴细胞杀伤靶细胞的 方式可通过直接杀伤或产生淋巴因子破坏 靶细胞。本试验方法有形态检查法和同位 素释放法两种。前者不需特
临床意义：
本试验可以作为体外测定肿瘤患者细 胞免疫的指标;也可以通过测定机体免疫 活性细胞杀伤肿瘤细胞的能力，来判断肿 瘤患者的预后;还可以鉴定淋巴细胞的功 能性亚群。
细胞毒性实验方案(仅供参照)
⑤迅速倒掉上清，加入6mLDMEM培养基，分装至两个培养瓶中，再各加入2mLDMEM，至5mL，于37℃，5%的CO2培养箱中培养48h。
⑥下一次传代步骤同①-⑤。
细胞存活率测定方法（布板，加样）：
①同传代步骤①-④。
②给每培养基转移到一个50mL离心管中，最终使液体体积为12mL。
③将培养瓶放入培养箱中培养。
细胞的传代：
将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL，冻存于-20℃，每次使用一管，避免反复冻融。
①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷75%的酒精放入超净台。
②将培养液倒入废液缸，残留培养基用吸管吸干净，操作完成后，培养瓶口用火烧。
③加入2mL胰酶将瓶底铺满，消化2-3min，于显微镜下观察细胞形态，呈圆形，即消化完毕，加入2mL 12% DMEM终止消化，用枪吹打，使细胞悬浮。
③96孔板中每个浓度设计5个复孔，每块板设一组空白调零孔，内加培养液，不含细胞与药物，一组空白对照组，只加培养基和细胞，不加药物。除过空白调零孔，每孔加入100μL含细胞的培养基。将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5% (v/v) CO2，温度保持在37℃，培养22小时。
④将0.03g谷胱甘肽加入到10mL培养基，充分溶解，浓度为0.003g/mL,取2微升的0.003g/mL谷胱甘肽溶液加入到10mL的培养基中，将这两个浓度含谷胱甘肽的培养基替换部分原来的培养基，作为对照，不需要加谷胱甘肽的孔换上新鲜培养基，将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5% (v/v) CO2，温度保持在37℃，培养2小时，具体的加样孔见图一。
④将细胞悬浮液移入10mL离心管中，1000rmp,5min,离心。
⑤迅速倒掉上清，加入6mLDMEM培养基，分装至两个培养瓶中，再各加入2mLDMEM，至5mL，于37℃，5%的CO2培养箱中培养48h。
⑥下一次传代步骤同①-⑤。
细胞存活率测定方法（布板，加样）：
①同传代步骤①-④。
②给每培养基转移到一个50mL离心管中，最终使液体体积为12mL。
③将培养瓶放入培养箱中培养。
细胞的传代：
将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL，冻存于-20℃，每次使用一管，避免反复冻融。
①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷75%的酒精放入超净台。
②将培养液倒入废液缸，残留培养基用吸管吸干净，操作完成后，培养瓶口用火烧。
③加入2mL胰酶将瓶底铺满，消化2-3min，于显微镜下观察细胞形态，呈圆形，即消化完毕，加入2mL 12% DMEM终止消化，用枪吹打，使细胞悬浮。
③96孔板中每个浓度设计5个复孔，每块板设一组空白调零孔，内加培养液，不含细胞与药物，一组空白对照组，只加培养基和细胞，不加药物。除过空白调零孔，每孔加入100μL含细胞的培养基。将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5% (v/v) CO2，温度保持在37℃，培养22小时。
④将0.03g谷胱甘肽加入到10mL培养基，充分溶解，浓度为0.003g/mL,取2微升的0.003g/mL谷胱甘肽溶液加入到10mL的培养基中，将这两个浓度含谷胱甘肽的培养基替换部分原来的培养基，作为对照，不需要加谷胱甘肽的孔换上新鲜培养基，将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5% (v/v) CO2，温度保持在37℃，培养2小时，具体的加样孔见图一。
④将细胞悬浮液移入10mL离心管中，1000rmp,5min,离心。
⑤迅速倒掉上清，加入6mLDMEM培养基，分装至两个培养瓶中，再各加入2mLDMEM，至5mL，于37℃，5%的CO2培养箱中培养48h。
《医学免疫学》课件-1_补体介导的细胞毒实验
这种选择是 否满足之前 的原则呢？
抗原、抗体
• Thy-1抗原是最早在胸腺淋巴细胞和T细胞 中发现的分化抗原之一。它首次是从小鼠 体内被鉴定出来的，它在小鼠和大鼠胸腺 细胞表面含量极为丰富，而且现在已经研 制出可以和它特异性结合的单克隆抗体并 投入生产。
补体的选择
本实验中选择豚鼠 补体作为实验补体 各种实验动物中以 豚鼠血清的补体成 分含量最为丰富， 溶血能力较强，又 较容易获得。豚鼠 补体也符合上述选 择补体的依据。
补体的制备
胸腺细胞悬液 的制备
√
补体介导 细胞毒作用
补体介导的细胞毒过程
试验材料
试验管
1X107／ml胸腺 0.1ml 细胞悬液
Thy-1单克隆抗 0.1ml 体
Hank's液
——
1:3补体
0.1ml
补体对照管 0.1 ——
细胞对照管 0.1 ——
0.1
0.2
0.1
——
补体介导的细胞毒试验
实验材料的选择
1、胸腺位于 胸骨与肺之 间 2、应始终浸 入Hank‘s液 操作
用hank’s液 洗涤两次
在整个操作 中胸腺细胞 制备速度要 快，切忌将 细胞暴露在 空气中太久
颈椎脱臼法处死 研磨胸腺组织、 过筛
离心、洗涤
重悬于hank’s液
小鼠胸腺细胞悬液的制备
实验思路流程图
实验材料的选择
抗原 抗体 补体
实验具体操作过程
实际应用
补体介导的细胞毒试验（又名淋巴细胞毒 交叉试验），这个试验最基本的应用在于 检查细胞膜抗原及抗体的特异性：在器官 移植前检查器官移植受者体内有无针对供 者,或者供者针对受者的HLA 抗体。本实验 在临床上广泛应用于与移植有关的抗原-抗 体特异性检查，有重要的意义。
抗原、抗体
• Thy-1抗原是最早在胸腺淋巴细胞和T细胞 中发现的分化抗原之一。它首次是从小鼠 体内被鉴定出来的，它在小鼠和大鼠胸腺 细胞表面含量极为丰富，而且现在已经研 制出可以和它特异性结合的单克隆抗体并 投入生产。
补体的选择
本实验中选择豚鼠 补体作为实验补体 各种实验动物中以 豚鼠血清的补体成 分含量最为丰富， 溶血能力较强，又 较容易获得。豚鼠 补体也符合上述选 择补体的依据。
补体的制备
胸腺细胞悬液 的制备
√
补体介导 细胞毒作用
补体介导的细胞毒过程
试验材料
试验管
1X107／ml胸腺 0.1ml 细胞悬液
Thy-1单克隆抗 0.1ml 体
Hank's液
——
1:3补体
0.1ml
补体对照管 0.1 ——
细胞对照管 0.1 ——
0.1
0.2
0.1
——
补体介导的细胞毒试验
实验材料的选择
1、胸腺位于 胸骨与肺之 间 2、应始终浸 入Hank‘s液 操作
用hank’s液 洗涤两次
在整个操作 中胸腺细胞 制备速度要 快，切忌将 细胞暴露在 空气中太久
颈椎脱臼法处死 研磨胸腺组织、 过筛
离心、洗涤
重悬于hank’s液
小鼠胸腺细胞悬液的制备
实验思路流程图
实验材料的选择
抗原 抗体 补体
实验具体操作过程
实际应用
补体介导的细胞毒试验（又名淋巴细胞毒 交叉试验），这个试验最基本的应用在于 检查细胞膜抗原及抗体的特异性：在器官 移植前检查器官移植受者体内有无针对供 者,或者供者针对受者的HLA 抗体。本实验 在临床上广泛应用于与移植有关的抗原-抗 体特异性检查，有重要的意义。
细胞毒性实验
4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。
若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5.终止培养，小心吸去孔内培养液。
6.每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）悬浮细胞：1）收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 l?g/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。
每板设对照（加100?(储存液100 1640）。
2）置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。
（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）4）离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。
5）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
（三）MTT的配制MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
细胞毒性实验方案
细胞毒性实验设计方案1.准备材料：DMEM(高糖) 胰酶双抗(青霉素/链霉素）DAPIMTT(5mg/mL) DMSO PBS 4%多聚甲醛指甲油 6孔培养板96孔培养板超薄载玻片培养瓶(25mL) 一包μm滤膜灭菌： 50mL，10mL，5mL离心管两种枪头2.实验方案本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅（SiO2-SS-HA/DOX），在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时夹心二氧化硅中药物得以释放。
本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化硅（SiO2-SS-HA/DOX）的细胞毒性。
实验组为SiO2-SS-HA/DOX、SiO2-SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维细胞为正常细胞模型。
采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO2-SS-HA/DOX、SiO2-SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞。
培养基中含有10% (v/v) FBS和1% (w/v)双抗(青霉素/链霉素)。
配制不同浓度的SiO2-SS-HA/DOX、SiO2、HA、DOX药物载体培养基溶液。
(1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型:培养基的配置：双抗 1% 血清12% DMEM 87%具体操作步骤：细胞的复活：①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37℃温水中，使细胞快速溶解。
②将悬浮的细胞移至离心管中，加5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。
（每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。
）③将培养瓶放入培养箱中培养。
细胞的传代：将%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL，冻存于-20℃，每次使用一管，避免反复冻融。
①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷75%的酒精放入超净台。
②将培养液倒入废液缸，残留培养基用吸管吸干净，操作完成后，培养瓶口用火烧。
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细胞毒性实验设计方案
1. 准备材料：DMEM高糖)胰酶双抗(青霉素/链霉素)DAPI
MTT(5mg/mL) DMSO PBS 4% 多聚甲醛指甲油6 孔培养板
96孔培养板超薄载玻片培养瓶(25mL) 一包0.45 pm滤膜
灭菌：50mL , 10mL 5mL离心管两种枪头
2. 实验方案
本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅
(SiO^SS-HA/DOX ,在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时夹心二氧化硅中药物得以释放。
本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化硅(SiO2-SS-HA/DOX 的细胞毒性。
实验组为SiO2-SS-HA/DOX SQ2-SS-HA、DOX 空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维细胞为正常细胞模型。
采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO2-SS-HA/DOX SQ2-SS-HA、DOX空白对照组为纯细胞。
培养基中含有10%(v/v) FBS和1%(w/v) 双抗(青霉素/链霉素)。
配制不同浓度的SQ2-SS-HA/DOX SiO2、HA DOX药物载体培养基溶液。
(1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型：
培养基的配置：双抗1% 血清12% DMEM 87%
具体操作步骤：
细胞的复活：
①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37°C温水中，使细胞快速溶解。
②将悬浮的细胞移至离心管中，力卩5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。
(每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。
)
③将培养瓶放入培养箱中培养。
细胞的传代：
将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL冻存于-20 C，每次使用一管，避免反复冻融。
①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷75%勺酒精放入超净台。
②将培养液倒入废液缸，残留培养基用吸管吸干净，操作完成后，培养瓶口
用火烧。
③加入2mL胰酶将瓶底铺满，消化2-3min，于显微镜下观察细胞形态，呈圆形，即消化完毕，加入2mL 12% DME终止消化，用枪吹打，使细胞悬浮。
④将细胞悬浮液移入10mL离心管中，1000rmp,5min,离心。
⑤迅速倒掉上清，加入6mLDME培养基，分装至两个培养瓶中，再各加入
2mLDMEM至5mL于37°C，5%勺CO培养箱中培养48h。
⑥下一次传代步骤同①-⑤。
细胞存活率测定方法(布板，加样)：
①同传代步骤①-④。
②给每个离心管中加入定量的培养基，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀，将所有含有细胞的培养基转移到一个50mL离心管中，最终使液体体积为30mL
③96孔板中每个浓度设计5个复孔，每块板设一组空白调零孔，内加培养液，不含细胞与药物，一组空白对照组，只加培养基和细胞，不加药物。
除过空白调零孔，每孔加入100卩L含细胞的培养基。
将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5% (v/v) CO 2,温度保持在37C，培养22小时。
④将0.03g谷胱甘肽加入到10mL培养基，充分溶解，浓度为0.003g/mL,取
2微升的0.003g/mL谷胱甘肽溶液加入到10mL的培养基中，将这两个浓度含谷胱甘肽的培养基替换部分原来的培养基，作为对照，不需要加谷胱甘肽的孔换上新鲜培养基，将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5% (v/v) CO 2,温度保持在37C，培养2小时，具体的加样孔见图一。
⑤将1.2mg的SQ-SS-HA/DOX羊品溶到3mL的培养基中，分成两份，其中
一份里加入1.5mL的培养基，再将稀释后的含液样的培养基分成两份，其中一份加入1.5mL新鲜培养基，依此类推，便得到一个浓度梯度的SiO^SS-HA/DOX样品。
SiO2-SS-HA样品的浓度配制方法同上。
⑥将0.918mg的SQ-SS-HA/DOX羊品溶到3mL的培养基中，剩下的步骤同⑤。
⑦将配制好的载体溶液替换原来96孔板中的培养基，如图1所示。
将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5%(v/v) CO，温度保持在37C，培养24小时。
⑧配制5 mg/mL的MTT溶液，将孔板中的培养更换成MTT溶液，将孔板放
入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，
5% (v/v) CO
2
,
温度保持在37 C。
培养
4小时后，将孔板中的培养基取出，用PBS溶液清洗3次，然后向每孔加入100卩L 的DMSO溶解孔中的甲瓒，采用酶标仪测定，波长设定为490nm
(2).以L929成纤维细胞为正常细胞模型
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图1药物载体布板示意图
实验组为SQ-SS-HA/DOX SiO^SS-HA、DOX空白对照组为纯细胞。
实验
目的为测定药物载体溶液对正常细胞的细胞毒性。
培养基的配置：双抗1% 血清12% DMEM 87%
具体操作步骤：
细胞的复活：
①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37°C温水中，使细胞快速溶解。
②将悬浮的细胞移至离心管中，加5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。
（每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。
）
③将培养瓶放入培养箱中培养。
细胞的传代：
将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL冻存于-20 C，每次使用一管，避免反复冻融。
①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷75%勺酒精放入超净台。
②将培养液倒入废液缸，残留培养基用吸管吸干净，操作完成后，培养瓶口用火烧。
③加入2mL胰酶将瓶底铺满，消化2-3min，于显微镜下观察细胞形态，呈圆形，即消化完毕，加入2mL 12% DME终止消化，用枪吹打，使细胞悬浮。
④将细胞悬浮液移入10mL离心管中，1000rmp,5min,离心。
⑤迅速倒掉上清，加入6mLDMEI培养基，分装至两个培养瓶中，再各加入
2mLDMEM至5mL于37C，5%勺CO培养箱中培养48h。
⑥下一次传代步骤同①-⑤。
细胞存活率测定方法（布板，加样）：
①同传代步骤①-④。
②给每个离心管中加入定量的培养基，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀，将所有含有细胞的培养基转移到一个50mL离心管中，最终使液体体积为12mL
③96孔板中每个浓度设计5个复孔，每块板设一组空白调零孔，内加培养
液，不含细胞与药物，一组空白对照组，只加培养基和细胞，不加药物。
除过空白调零孔，每孔加入100卩L含细胞的培养基。
将孔板放入培养箱中，培养箱保持一
定的湿度，5% （v/v） CO 2,温度保持在37C，培养22小时。
④将所有加样的孔换成新鲜培养基，作为与癌细胞④的对照。
将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5%(v/v) CO,温度保持在37C,培养2小时。
⑤将0.4mg的SQ-SS-HA/DOX羊品溶到1mL的培养基中，分成两份，其中
一份里加入0.5mL的培养基，再将稀释后的含液样的培养基分成两份，其中一份加入0.5mL新鲜培养基，依此类推，便得到一个浓度梯度的SiO^SS-HA/DOX样品。
SiO^SS-HA样品的浓度配制方法同上。
⑥将0.306mg的SQ-SS-HA/DOX羊品溶到1mL的培养基中，剩下的步骤同⑤。
⑦将配制好的载体溶液替换原来96孔板中的培养基，如图2所示。
将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5%(v/v) CO，温度保持在37°C，培养24小时。
⑧配制5 mg/mL的MTT溶液，将孔板中的培养更换成MTT溶液，将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5% (v/v) CO 2，温度保持在37 C。
培养4小时后，将孔板中的培养基取出，用PBS溶液清洗3次，然后向每孔加入100卩L 的DMSO溶解孔中的甲瓒，采用酶标仪测定，波长设定为490nm
细胞存活率采用百分比表示：细胞存活率=(OB eated --OD blank /OD control -OD blank ) X 100% OD ank是只有培养液，没有细胞的培养孔的吸光值，0D Control为不含药物载体含细胞和空白培养基的培养孔中所测吸光值，ODtreated为含药物载体培养孔所测吸光值。
细胞相对存活率根据吸光值计算。
UOX
图2正常细胞组的药物载体布板示意图。