PCR(基因扩增)仪温度示值误差校准结果的不确定度评定

xxxxx 所作业指导书校准细则YTIM -2018 聚合霉链反应分析仪温度2018-1-15批准 2018-1-15实施聚合霉链反应分析仪温度校准细则1 依据：JJF1527-2015聚合酶链反应分析仪校准规范JJF1059-1999测量不确定度评定与表示 GB9170-87数据修约制定本校准细则2 适用范围：适用于模块加热的聚合酶链反应（PCR ）分析仪计量性能的校准，对于其他类型的PCR 仪，可参照本细则。

3 校准前的准备工作：校准前将PCR 仪及温度校准装置各部件连接完好，将PCR 仪开机预热30min ，在温度传感器表面上涂抹适量的导热油，将温度传感器置于PCR 仪加热模块设定孔中。

4 校准方法及数据处理：参照被校PCR 说明书设定温度控制程序，如下表所示。

设定完成后，先启动PCR 仪检测系统，待系统可以正常采集数据后，再启动被校PCR 仪，记录整个数据采集过程并保存。

4.1 温度市值误差校准结果按以下公式计算：c sd T T T -=∆∑==ni i c T n T 11式中：d T ∆——温控装置工作区域内温度示值误差，℃； s T ——温控装置工作区域内设定温度值，℃；c T ——所有测温传感器测量值的平均值，℃；i T ——第i 个温度传感器测定值，℃。

4.2 温度均匀度校准结果按以下公式计算：min max T T T u -=∆式中：u T ∆——温度均匀度，℃；m ax T ——所有传感器测定值得最大值，℃；m in T ——所有传感器测定值得最小值，℃。

5 升降温速率校准参照被校PCR 仪说明书设定温度控制程序，如下表所示。

设定完成后，先启动PCR 仪检测系统，待系统可以正常采集数据后，再启动被校PCR 仪，记录整个数据采集过程并保存。

按照以下公式计算平均升、降温速率：t T T V A B UT -=，tTT V A B DT -= 式中：UT V 、DT V ——平均升、降温速率，℃/s ；A T ——50℃温度点测量值，℃；B T ——90℃温度点测量值，℃；t ——从A T 到达B T 的时间，s 。

link appraisement陕西中检计量测试技术有限公司图1 内部结构示意图CHINA SCIENCE AND TECHNOLOGY INFORMATION May.2021·中国科技信息2021年第10期10万～30万◎室或样品池中孔温度进行测量、在装有反映缓冲液的PCR管中安置温度传感器用于对反应缓冲液温度进行测量，是PCR仪现有的两种主要校准方法。

前者能将加热室或样品池中各点温度、均匀度直接获取，然而却无法将PCR管内反应体系温度反映；后者能获取可将PCR反应中各阶段温度更精确、真实反映的温度参数，然而PCR管质量却会对其构成巨大影响。

综合来看，采用后者展开测量，相对而言更加合理、科学。

PCR仪温度校准项目稳定的温度循环，是PCR得以成功实现的基础条件之一。

温度准确性、升降速度及温场均匀性和最大超调温度等温度控制的动、稳态特性，会对PCR扩增结果的准确性构成严重影响，温度准确性作为PCR仪关键性能指标之一的温度准确性，如果处于较低水平会引起非特异性扩增的情况，更有甚者会导致扩增结果出错，构成假阴性和假阳性。

现有PCR仪性能主要指标中，有关准确度方面的指标多以±0.5℃为主，个别PCR仪性能较好，能实现±0.3℃的温度准确度。

所以，有必要测试 PCR仪控温准确度。

在计算校准实验平均温度时，可采用公式：n ttnii∑==1，式中ti代表各个测量点实际温度值；i代表检测中使用的温度探头序号；n代表检测中使用的温度探头数量。

温场均匀性因PCR仪加热器难以均匀加热的缘故，PCR仪模块上各孔间会有适量温差存在，进而影响试验结果。

PCR仪边中间区域温度通常高于边缘点，因此PCR仪性能指标之一的均匀性也很重要，普遍规定在±0.5℃，个别性能较好的 PCR仪能实现±0.3℃的温度均匀度。

校准试验中，挑选16个孔板中的特殊反应位置用于温度测量，能将孔板温度均匀性获取。

数字温度指示调节仪校准结果的不确定度分析与评定摘要：数字温度指示调节仪是温度显示、调节常见的仪表之一，用输入被检点的标称温度值进行校准是最常用的方法，本文详细介绍了数字温度指示调节仪校准时不确定度评定的详细过程，对数字温度指示调节仪的校准工作具有一定的指导意义。

关键词：数字温度指示调节仪校准结果不确定度1概述1.1校准依据JJG 617-1996《数字温度指示调节仪》。

1.2校准环境条件温度（20±2）℃，相对湿度（45～75）%。

1.3校准标准及其主要技术参数本次校准采用的标准器是热工仪表校验仪，北京康斯特仪表科技股份有限公司制造，其主要技术参数如下：热电阻类型测量、输出范围（℃）给定准确度范围（℃）准确度（℃）测量输出2、3线制4线制Pt100-200-850-100-2000.140.090.09200-6000.250.150.15600-8500.340.210.211.4被校准对象及其技术参数被校数字温度指示调节仪量程为（0-600）℃，分辨力为0.001℃，准确度等级为0.5级。

1.5 校准方法采用输入被检点的标称温度值（0℃、100℃、200℃、300℃、400℃）进行校准的方法。

1.6 校准值不确定度评定的适用范围本次校准中不确定度的评定采用了合并样本偏差的方法，所以本次不确定度的评定结果适用于采用同一套计量标准在相同条件下进行校准示值基本相同的同类数字温度指示调节仪。

2数学模型根据JJG 617-1996《数字温度指示调节仪》计量检定规程的规定：△t=td -ts+tx式中：△t—仪表示值误差，℃；td—仪表显示的温度值，℃；ts—热工仪表校验仪输出的温度值，℃；tx—热工仪表校验仪的修正值，℃。

3灵敏系数=1=-1=-14各输入量的标准不确定度来源及评定方法被校准的数字温度指示调节仪校准值的标准不确定度u，其来源有：被校数字温度指示调节仪的测量重复性、数字温度指示调节仪的分辨力、校准用标准器溯源性、校准用标准器本身引入的标准确定度等。

Evaluation of Uncertainty inMeasurement Results of Polymerase Chain Reaction (PCR)AnalyzerZENG Bingmei(Hainan Kerui Measurement Technology Service Co.,Ltd.,Haikou 570206,China)Abstract :Taking the measurement results of polymerase Chain reaction (PCR)analyzer as the research object,this paper discusses the evaluation method and process of uncertainty of measurement results of polymerase Chain reaction (PCR)analyzer.Key words :polymerase chain reaction;measurement results;uncertainty聚合酶链反应（PCR ）分析仪测量结果的不确定度评定曾冰梅（海南科瑞计量技术服务有限公司，海南海口570206）【摘要】以聚合酶链反应（PCR ）分析仪测量结果为研究对象，论述了聚合酶链反应（PCR ）分析仪测量结果不确定度的评定方法与过程。

【关键词】聚合酶链反应；测量结果；不确定度【DOI 编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.06.0071概述聚合酶链式反应又称为PCR ，是分子生物学技术之一。

PCR 已成为分子生物学研究必不可少的一部分。

PCR 技术不仅可用于基础研究，还适用于日常的临床诊断、法医学调查和农业生物技术研究。

PCR 仪是一种能够为PCR 反应自动完成温度循环和孵育的仪器，能够在短时间内将单个DNA 分子扩增数百万倍。

JJF ××××─201×基因扩增仪（PCR仪）测温系统校准规范1 范围本规范适用于48孔或96孔孔板结构的测量范围为（0～120）℃的多通道基因扩增仪（PCR仪）测温系统或者单通道基因扩增仪(PCR仪）测温仪的的校准，其他孔板结构和温度范围的基因扩增仪（PCR仪）测温系统的温度校准可以参考本规范。

2引用文件本规范引用下列文件：JJF 1071-2000 《国家计量校准规范编写规则》JJF 1007-2007 《温度计量名词术语及定义》JJF 1527-2015 《聚合酶链反应分析仪校准规范》YY/T 1173-2010《聚合酶链反应分析仪》ITS-90 1990年国际温标凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本规范；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本规范.3术语3。

1 基因扩增仪（PCR仪），即聚合酶链反应分析仪polymerase chain reaction analyzer基于PCR(聚合酶链反应）技术原理，模拟DNA或RNA的复制过程,在模板、引物、校验和没等存在的条件下，特异扩增已知序列，对其进行检测分析的仪器设备。

［YY/T 1173-2010 3。

2］3.2 基因扩增仪（PCR仪）测温系统temperature measuring system for Polymerasechain reaction analyzer用于基因扩增仪（PCR仪)的专用温度校准装置。

3。

3 温度校准专用等温块与配件isothermal block and accessory for temperature calibration与标准恒温槽配套使用并提供基因扩增仪测（PCR仪）温系统温度校准的洁净温场的辅助装置。

3.4 温度校准专用等温块测试孔testing hole for temperature calibration模拟基因扩增仪控温块内的结构，提供基因扩增仪(PCR仪）测温系统探头布放插孔的专用等温块。

国内统一刊号CN31-1424／TB 2019/1 总第271期2020/1 总第278期0　引言根据国家卫健委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》[1]，实时荧光RT-PCR 检测被列为确诊病例的两种方法之一，该方法由于检测时间短、成本低等特点[2]，已成为应用最广的确诊新型冠状病毒的方法。

用实时荧光RT-PCR 法进行疑似病例确诊需要检测到患者体内含有新型冠状病毒的特征基因，而特征基因的检测有两个重要的制约性条件：一是新型冠状病毒核酸检测试剂盒，二是检测结果准确可靠的荧光定量PCR 仪（以下简称PCR 仪）。

为确保PCR 仪检测结果的准确可靠，2015年发布了JJF 1527－2015《聚合酶链反应分析仪校准规范》[3]。

上海市计量测试技术研究院是全国最早开展PCR 仪计量校准的单位之一，根据多年的经验积累，现就荧光定量PCR 仪校准过程的影响因素进行探讨。

1　温度部分校准的影响因素温度检测计量器具通常由15个精密温度传感器、数据采集分析模块组成，测温范围为0~120 ℃，荧光定量PCR仪计量校准结果的影响因素分析及控制梁文　罗超　盛舒瑶 / 上海市计量测试技术研究院摘　要　分析了荧光定量PCR 仪计量校准过程中，温度检测部分和核酸样品定量检测部分的影响因素和控制方法，为校准实验室减小试验误差，提供准确可靠的荧光定量PCR 仪计量校准结果提供参考。

关键词　定量PCR 仪；温度检测；核酸检测测量不确定度U = 0.10 ℃（k = 2）。

该装置可实现静态温度测定、动态温度跟踪和多通路检测，每个探头的实时采集数据以曲线图格式保存在磁盘中，并通过软件解码处理[4]。

该装置用于对PCR 仪的温度示值误差、温度均匀度、平均升降温速率、样本示值误差等温度指标进行校准。

温度探头贴合性的影响：测温探头的外观应该和PCR 反应孔的外观一致，尺寸误差小于1 mm。

市场上在售PCR仪的厂家和型号众多，虽然反应孔的大小有行业的统一规定，但反应孔的高低有0.1 mL 和0.2 mL 两种不同的型号。

pcr温度校准标准1. 简介PCR（聚合酶链式反应）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的技术，它通过扩增DNA片段来检测和定量目标DNA序列。

PCR反应的准确性和可重复性是保证实验结果可靠性的关键因素之一。

因此，PCR温度校准标准的制定和实施对于确保PCR实验数据的准确性至关重要。

2. PCR温度校准标准的背景2.1 PCR反应中温度参数的重要性在PCR反应中，不同温度阶段（变性、退火、延伸）对于扩增目标序列起着至关重要的作用。

不同目标序列需要不同的退火温度，而延伸阶段则需要适当控制延伸时间。

因此，正确控制PCR反应中各个阶段的温度参数对于扩增特定目标序列非常关键。

2.2 PCR仪器中温度控制系统现代PCR仪器通常配备了高精确度、高稳定性和快速响应速度的热电偶或光学传感器来监测和调节反应体系中各个阶段所需的精确温度。

然而，由于PCR反应过程中温度的变化，仪器中的温度控制系统可能存在一定的误差。

因此，制定PCR温度校准标准以确保反应体系中真实的温度是非常必要的。

3. PCR温度校准标准的制定3.1 标准样品选择PCR反应体系中常用的标准样品是由特定序列构建而成的DNA片段。

这些片段具有已知序列和长度，并且已经在许多实验室和研究领域进行了广泛应用。

选择合适的标准样品对于确保PCR反应体系中真实温度测量结果非常重要。

3.2 标准样品测量在制定PCR温度校准标准时，必须对所选标准样品进行精确测量。

这可以通过使用高精密仪器和合适的测量方法来实现。

例如，可以使用高分辨率热电偶或光学传感器来监测和记录PCR反应体系中不同阶段所需的精确温度。

3.3 数据分析与处理通过对多次重复实验数据进行统计分析和处理，可以得到更加可靠和可重复性结果。

这些数据可以用于建立PCR温度校准曲线和计算温度误差范围。

根据这些数据，可以制定PCR温度校准标准，以确保实验数据的准确性和可重复性。

4. PCR温度校准标准的实施4.1 标定PCR仪器一旦制定了PCR温度校准标准，就可以使用标定样品来验证和调整PCR 仪器的温度控制系统。

陕西XXXX技术有限公司数字温度指示调节仪检定/校准结果测量不确定度评定报告编制：审核：批准：2020年06月06日检定/校准结果测量不确定度评定报告一、概述1、预评估对象：数字温度指示调节仪，C4180334040（北京汇邦)2、检定方法：JJG 619-1996《数字温度指示调节仪》3、检定项目：示值误差4、检定环境：温度21℃；湿度52%RH5、检定用计量标准器：多功能校验仪 二、测量结果不确定度的评定（一）、配热电阻类数字温度指示调节仪 1、检定方法及原理按JJG617-1996《数字温度指示调节仪检定规程》要求，按“输入基准法”进行测量，所使用的标准器为PR231B-2型多功能校验仪。

被测对象为分辨力为1℃的仪表：规格为Pt100分度、测量范围为（-199～600）℃、最大允许误差△d =±0.2%FS=±1.6℃。

2、 数学模型s d t t t -=∆式中：△t ———仪表的示值误差； t d ———仪表的显示值；t s ———标准器电阻示值对应的温度值3、输入量的标准不确定度评定3.1 输入量t d 的标准不确定度)(d t u 的评定输入量t d 的 不确定度来源主要有两部分：测量重复性和仪表的分辨力。

3.1.1 测量重复性导致的标准不确定度)(1d t u)(1d t u 可以用“示值基准法”在同一温度点上通过连续多次测量得到测量列，采用A类方法进行评定。

不同分辨力的仪表具有不同的测量重复性。

按照上述方法我们对本次评定所使用的分辨力为1℃ 在200℃点进行连续10次测量得到如下结果：200℃、199℃、199℃、199℃、199℃、199℃、199℃、199℃、199℃、199℃。

其平均值；d t = 199.1℃单次实验标准偏差为： ℃32.01)(12=--=∑=n t ts ni d di任选3台同类型仪表分别在量程的10%、50%、90%附近进行重复条件下的连续10次测量，共得到9组测量列。

聚合酶链反应分析仪温度示值误差测量结果不确定度评定作者：李翔来源：《科学与财富》2018年第12期摘要：本文通过温湿度试验设备自动检定系统，对聚合酶链反应分析仪的温度示值误差测量结果进行不确定度分析。

关键词：聚合酶链反应分析仪；不确定度评定；温度1 概述1.1测量依据：根据JJF 1527-2015 《聚合酶链反应分析仪校准规范》及JJF 1059-2012 《测量不确定度评定与表示》1.2 计量标准：温湿度试验设备自动检定系统1.3测量方法：采用比较法，将聚合酶链反应分析仪（以下简称PCR仪）及温湿度试验设备自动检定系统各部件连接完好，在测温探头表面上涂抹适量的导热油，将测温探头置于PCR 仪（96孔）加热模块设定孔中；参照PCR仪说明书设定温度控制；启动温湿度试验设备自动检定系统，记录整个数据采集过程并保存。

2. 测量模型[2]3. 不确定度来源温度测量Tc主要是由温度的测量重复性引入的不确定度u1（Ti）和温湿度试验设备自动检定系统引入的不确定度u3（Ts）。

而设定温度Ts被测仪器本身引起的不确定度u2（T0）由仪器最小分辨率引入。

4. 不确定度分量的计算4.1 重复性引入的不确定度u1（Ti）在温度测量时间段内，读取15个测温探头的数据，见表1，计算其标准偏差s根据测量结果计算：4.2 仪器最小分辨率引入的不确定度u2（T0）一般PCR仪的最小分辨力为0.1℃，则半区间宽度为0.05℃，按均匀分布，取k= 3 可得：4.3 温湿度试验设备自动检定系统引入的不确定度u3（Ts）温湿度试验设备自动检定系统校准不确定度由标准温度传感器校准证书的不确定度引入，取k=2，可得：5. 标准不确定度一览表6. 合成不确定度的评定校准点30℃：7. 扩展不确定度的评定取包含因子k=2，则聚合酶链反应分析仪示值误差的扩展不确定度为：校准点30℃： U=kgu（△）=0.255×2℃=0.5℃，k=2。