第五章微生物酶的工业提取.pptx

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大曲、小曲、麸曲的主要微生菌群及其作用： ① 大曲 是以全小麦为原料，或以小麦︰大麦︰豌豆 ＝7︰2︰1或5︰4︰1制成混合原料，经自然接种培养而 制成的大砖块形的酒曲。大曲中的微生物主要是曲霉， 其次是根霉、毛霉和酵母菌，及少量细菌，为大曲酒的 糖化发酵剂。 曲霉和根霉是主要的糖化菌种， 其中黑曲霉的糖化力较高； 米曲霉和黄曲霉的糖化力较低，但液化力和蛋白 分解力较强； 根霉和红曲霉产生糖化酶和有机酸； 毛霉产生淀粉酶和蛋白酶。
因此，有计划和仔细地筛选微生物菌株，通 常可以获得能够生产几乎任何一种酶的适当菌 株。
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1.2 微生物酶的种类:
酶的组成与分类 单聚体蛋白
酶蛋白 寡聚体蛋白:谷酰胺合成酶 多聚体蛋白:丙酮酸脱氢酶
酶 辅基: 血红素
辅因子 辅酶: NAD, FAD, 生物素等 激活剂: 金属离子
胞内酶 酶
二、微 生 物 的 菌 体 及 其 内 含 物 的应用
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第一节
微生物的酶 及微生物代谢产物
的应用
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一、微生物酶
1.1 概况： 酶（enzyme）是活细胞产生的一种生物催
化剂。 酶是一类具有催化功能的蛋白质，能够使
生物体内发生各种各样的生物化学变化，无论 是动物、植物或微生物本身，它们的生长、发 育、繁衍后代等，新陈代谢时所进行的一切生 化变化，几乎都是在酶的催化下发生的，可以 说没有酶就没有生命。酶的催化作用很早就为 人们的生活所利用。
目前，常用糖化酶产生菌是：
黑曲霉As3.4309（俗称UV—11号），该菌产糖化
酶系纯、糖化力较高、耐高温、耐低pH、糖化时最适 温度600Ｃ 最适 pH4.0～4.6。

•制备性离心：
分离纯化和制备
•分析性离心：
测分子量、沉降系数、密度、纯度
五、沉淀分离（根据溶解度的不同）
•使溶液中的溶质由液相转变为固相析出 •古老、实用、简单的初步分离方法
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法： ⑴中性盐沉淀（盐析法） ⑵有机溶剂沉淀 ⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性） ⑷等电点沉淀 ⑸有机聚合物沉淀
原因：
高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水 分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度 而沉淀。
不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在 不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同 蛋白质先后析出，称分段盐析。
蛋 白 质 分 子 表 面 的 疏 水 区 域 和 荷 电 区 域
2. 盐析用盐
1）中性盐的选择 常用（NH4）2SO4，其突出优点： a. 溶解度大 b. 分离效果好 c. 不易引起变性 d. 价格便宜
（dialysis）或层析（chromatography）方法脱盐。
3. 盐析曲线的制作
如要分离一种新的蛋白质和酶，应先确定沉淀该 物质的硫酸铵饱和度。
蛋白质量(mg)或酶活力
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫铵
硫酸铵浓度（%） 枯草杆菌-淀粉酶发酵液的盐析曲线
4. 盐析的影响因素
脂类(8.5% ~ 13.5%)
细菌细胞壁的结构
酵母菌细胞壁的结构 M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖
（二）细胞破碎的方法
机械法 物理法 化学法 生物法（酶解）
1.机械法：
1）液体剪切：搅拌、匀浆。 2）固体剪切：研磨，珠磨，捣碎。
2.物理法：
1）超声波破碎法。 2）渗透压突变法：高渗（蔗糖，高盐等） 平衡后迅速转入低渗溶液或水中。 3）冻融法：反复低温冰冻，室温融化。

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4.干燥法
气流干燥 真空干燥 喷雾干燥 冷冻干燥
使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、 丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被 抽提出来。
气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干； 真空干燥多用于细菌。
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三、破碎率的测定与破碎技术的研究方向
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5.其他方法
1. X-press法
将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体，利用500MPa 以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破 碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起 的。
此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及 活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。
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3. 反复冻结-融化法
将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多 次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键 结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变 化，引起细胞膨胀而破裂。
适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融 过程中可能引起某些蛋白质变性。
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化学渗透法优点：
对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质 如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍 滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进 一步提取。
缺点： 通用性差；
时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 有些化学试剂有毒 。
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（2）EDTA螯合剂
处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结 构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持， 一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落， 使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补， 从而导致内层膜通透性的增强。

【教材微点发掘】 1 ． 阅 读 教 材 第 84 页 ， 说 出 酶 制 剂 适 于 在 低 温 (0 ～ 4 ℃) 下 保 存 的 原 因 ：
__________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ______________________。 答案：在0 ℃左右时，酶的活性很低，但酶的空间结构稳定，在适宜的温度 下酶的活性可以升高
第2课时 酶的特性
学有目标——课标要求必明
记在平时——核心语句必背
1.酶具有高效性、专一性和作用条件的温和性 1.阐明酶的高效性、专一性和
2.酶具有高效性的原因：与无机催化剂相比，酶降 作用条件较温和
低活化能的作用更显著 2.通过相关的实验和探究，尝
3.过酸、过碱或温度过高都会使酶因空间结构遭到 试控制自变量、观察和检测
(2)设计方案ຫໍສະໝຸດ 项目 材料实验组对照组 等量的同一种底物
试剂
与底物相对应的酶 溶液
新知探究(一) 酶的高效性和专一性 【探究·深化】
[问题驱动] 1．验证酶的高效性 在比较肝脏研磨液(过氧化氢酶)和FeCl3对过氧化氢的 催化效率实验中(如图)，试管甲产生的气泡比试管乙多， 说明 与无机催化剂相比，酶的催化作用具有高效性 。
2．验证酶的专一性 (1)实验验证：淀粉和蔗糖不是还原糖，但淀粉水解后会生成麦芽糖，蔗糖水 解后会产生葡萄糖和果糖，麦芽糖、葡萄糖、果糖都是还原糖。下表为比较新鲜 唾液(唾液淀粉酶)对淀粉和蔗糖的催化作用实验，请分析：
操作步骤 可溶性淀

出的能量生成ATP的称为氧化磷酸化
2、ATP生成方式 （1）底物水平磷酸化 通式：X~Pi＋ADP––––ATP＋X
X~Pi－ATP，1.3－二磷酸甘油酸，乙酰磷酸， 2－磷酸烯醇式丙酮酸，氨甲酰磷酸 适用范围：适用于发酵作用进行生物氧化的微生物
（2）电子传递磷酸化 适用范围：适用于有氧或无氧呼吸作用进行生物
细胞膜：参与营养物质运输的酶（渗透酶） 细胞质：分解糖及有机物质的酶与合成酶 呼吸酶类：原核生物（细胞内膜）、
真核生物（线粒体） 核糖体：蛋白质合成酶
第二节 微生物的能量代谢
能量代谢––––微生物体内的能量转变过 程
热力学第二定律 能量守恒
微生物的能量代谢是通过生物氧化反应来实 现的
生物氧化–––微生物在细胞内酶作用下把 营养物质氧化的过程
酶的结构与功能
作用方式分为6种：水解酶、氧化还原酶、转移酶、异 构酶、裂解酶、合成酶
根据酶在细胞内的位置分：胞外酶（水解酶）、胞内酶 （还原酶、转移酶、裂解酶、异构酶、合成酶等）和细 胞间质酶（渗透酶等 细胞膜与细胞质中间）
酶产生规律：固有酶（成分酶）和适应酶（诱导酶）
酶在结构上可分为单成分酶和双成分酶
最初能源
有机物（化能异养菌） 日 光（光能营养菌） 无机物（化能自养菌）
通用能源
生物氧化的特点： （1）系列酶在温和的条件下按次序催化； （2）氧化反应能量释放分段进行 （3）放出能量一部分的化学能的形式储存在能
量载体内
生物氧化作用的实质是物质代谢中脱下的氢离子（电 子）转移给受氢体
根据最终电子（氢）受体的不同，可把微生物的生物 氧化作用分为三类：有氧呼吸作用、无氧呼吸作用、 发酵作用
绝对专一性、相对专一性、立体异构专一性

第五章 工业微生物产生菌的分离筛选.
36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素。(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头承 诺，踏 上旅途 ，义无 反顾。 40、对时间的价值没有没有深切认识 的人， 决不会 坚韧勤 勉。
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿