牙髓间充质干细胞培养

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是骨髓中除造血干细胞外另一重要的干细胞。

MSC 具有自我更新、多向分化、免疫调控和支持造血的能力，而且来源广泛，容易在体外培养和扩增，目前已经应用于临床并显示了良好的治疗效果。

虽然MSC临床应用广泛，但许多关键问题如免疫调控的具体机制等并未解决。

小鼠是重要的实验动物之一，广泛用于基础实验研究。

在体外成功分离培养MSC，并得到大量纯化的MSC是研究其分化及功能调控机制的前提。

目前分离小鼠骨髓MSC的方法包括全骨髓贴壁法、骨片消化法、流式或磁珠分选法等。

然而全骨髓贴壁法获得的细胞往往含有不少造血细胞；骨片消化法需要进行胶原酶消化，步骤多且消化时问不好控制；流式或磁珠法虽然获得细胞较纯，但程序复杂，花费高且获得的细胞相对少。

骨髓MSC的分离目前常用的方法有全骨髓贴壁法、骨片消化法和流式细胞术或磁珠分选法。

全骨髓贴壁法即根据MSC的贴壁性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。

然而该方法获得的MSC往往含有较多基质细胞和造血细胞污染。

我们的结果也显示，全骨髓贴壁法原代培养的细胞有75％为CD45阳性的细胞，传至第3代，MSC中仍有5％的CD45阳性细胞，即造血细胞。

骨片消化法，是先将骨髓冲干净，将股骨和胫骨剪碎，然后进行胶原酶消化。

虽然该方法获的MSC纯度较高，但是程序复杂，且不同鼠龄骨片胶原酶消化时间不同，不容易掌握。

随着对MSC表面抗原认识的深入，有研究者利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法对其进行分离纯化旧191；虽然这些方法可以得到纯度较高的细胞，但分离过程对细胞的活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性；而且实验条件要求高，需要骨髓量大，加之耗费较大和技术难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。

本研究采用骨髓加骨片法分离小鼠MSC，即将股骨和胫骨肌肉去干净后，不需冲骨髓，不需消。

临床研究用人间充质干细胞质量评价规范（讨论稿）前言人间充质干细胞(human MSCs, hMSCs)是一类具有一定的自我复制更新和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于胎儿和成人各组织中，如骨髓、脂肪、皮肤、牙髓、肌腱，以及新生儿附属组织，如脐带、胎盘、羊膜等等组织。

除一定程度的分化潜能外，hMSCs还具有独特的免疫调控和组织再生功能，参与调控异常免疫反应、维护免疫平衡，帮助机体形成有利于病损组织细胞修复或再生的微环境，以促进损伤组织细胞的修复或再生。

hMSCs独特的生物学功能决定了其应具有广泛的临床适应症，并使其成为近十年来细胞治疗领域中发展最为广泛、最为迅速的干细胞类型。

过去10年来所积累的大量临床前及临床研究数据显示，不同组织来源的hMSCs均具有不同程度，针对不同临床适应症的治疗效果。

目前在登记的各种自体或异体组织来源的hMSCs临床适应症类型或疾病亚型已有上百种，其中常见的临床适应症类型包括骨关节疾病、心血管疾病、器官功能衰竭、神经退行性疾病、移植物抗宿主病、多发性硬化、脊髓损伤、炎性结肠炎、脊髓侧索硬化、系统性红斑狼疮，等等。

然而，无论是临床前或临床研究阶段，现有的研究结果仍都存在不同程度的问题，而所有问题又都不同程度地汇聚到hMSCs的质量问题上。

其中临床前研究所表现的问题是，不同研发者所使用的hMSCs来源、培养体系、制备工艺、质量标准、评价技术等存在很大差异，也存在质量评价内容和技术的合理性等问题，因此导致不同研究者间的研究结果很难具有可比性，或结果难以重复，因此也很难形成相对统一的质量标准。

而临床研究中所存在的问题是，绝大多数临床研究还处在早期阶段，所观察的病例数还很有限，临床研究中细胞质量的标准化和细胞使用的规范性仍存在巨大差异，所有这些尚不足以完全支持hMSCs的安全性和/或疗效。

除此以外，因hMSCs临床前研究还远不够完善，对其临床研究的指导作用还不强，或者临床前研究与临床研究存在严重脱节现象，临床研究阶段细胞质量的稳定性研究欠缺，细胞质量评价和受试者评估体系尚未建立，等等。

炎症牙髓干细胞-从临床上诊断为不可逆性牙髓炎的牙髓组织中分离出来的一类成体干细胞炎症牙髓干细胞-从临床上诊断为不可逆性牙髓炎的牙髓组织中分离出来的一类成体干细胞。

学术术语来源---炎症牙髓干细胞：起步研究与未来发展文章亮点：1 此问题的已知信息：目前牙齿再生作为口腔组织工程的研究目标，合理的选择种子细胞是关键。

现阶段种子细胞多选用牙源性干细胞，包括人的健康牙周膜、牙髓组织及根尖周组织等，这些组织多取自智齿和正畸牙，存在供体与供牙来源有限的弊端，在一定程度上造成了治疗和研究的局限性。

当前牙髓治疗中最常用的方法是根管治疗，其中关键一步是拔除炎症或坏死的牙髓，拔除的牙髓是否可以作为口腔组织工程的种子细胞成为研究的关注点。

2 文章增加的新信息：炎症牙髓干细胞的研究尚处于起步阶段，培养条件和动物模型的建立正处于探究阶段，扩增能力和多向分化能力研究结果尚有争议，而在免疫特性、亚群研究和临床应用等方面研究较少。

3 临床应用的意义：一些学者从恒牙和脱落的乳牙牙髓中分离出牙髓干细胞并研究其特性后发现，牙髓干细胞能够形成牙本质样组织，在体外和体内实验中形成骨组织。

通过移植组织工程复合物进入免疫抑制的大鼠皮下组织能产生异位牙本质，这为牙再生带来了希望，能成功用于组织工程。

近年来，又从炎症牙髓组织中分离出炎症牙髓干细胞。

炎症牙髓干细胞在体外是具有组织再生潜能的细胞。

从临床应用上说，炎症牙髓干细胞可能会作为牙髓和牙本质再生的细胞资源。

关键词：干细胞；培养；炎症牙髓干细胞；表面标志；多向分化能力；扩增能力；研究进展主题词：干细胞；牙髓；牙髓炎；综述摘要背景：炎症牙髓干细胞是近年来新发现的一类牙髓干细胞，目前尚无对其研究进展的系统评价。

目的：系统评价炎症牙髓干细胞的研究进展。

方法：以“(Pulptis OR Inflam* Dental Pulp* OR Human Dental Pulp with Irreversible Pulpitis)AND Stem Cell*/(牙髓炎OR炎症牙髓OR不可逆性牙髓炎)AND干细胞”为检索词检索PubMed、Web of Science、CNKI、WanFang及VIP数据库(时间：建库至2014年2月)，同时手检纳入研究的参考文献。

专访毛剑博士-牙髓干细胞再生牙将会是根管治疗的下一次革命目前，多国科学家研究已经证实牙髓干细胞具备成功再生牙齿及身体其它组织的潜能。

来自全球的科学专家齐聚于纽约，参加讨论牙髓干细胞和颅颌面干细胞最新理念和科学突破的第一次国际会议。

《牙科论坛》亚太编辑DanielZimmerman n采访了美国哥伦比亚大学教授，兼本次会议的组织者之一Jeremy Mao博士，探讨本次会议以及研究成果什么时间能投入临床实践，为牙科医生所用。

Jeremy Mao博士与与会代表合影。

本次纽约会议是牙髓干细胞研究者的第一次国际盛会（照片由美国哥伦比亚大学惠赠）Daniel Zimmermann：Mao博士，牙齿再生或者牙齿结构部分再生也就意味着传统牙科治疗方式的终结。

那么此种观念何时能变成现实？Jeremy Mao博士：牙体组织再生与组织工程学领域的研究进展非常迅速。

不同的牙体组织，如牙髓、牙本质和牙骨质，均已经在动物模型上成功的进行了组织再生。

尽管这些技术研究暂时不能运用到临床实践，但是在不久的将来一定会投入到临床使用，其关键在于一些监管机构的批准，例如美国食品与药物管理局。

科学研究只是这一进程的一部分。

Jeremy Mao博士在纽约会议上发言Daniel Zimmermann：与胚胎干细胞的研究相比较，对牙髓干细胞的研究的争议显得非常少，这是为什么呢？Jeremy Mao博士：事实确实如此。

之所以没有许多的伦理讨论，是因为与胚胎干细胞不同，胚胎干细胞必须通过破坏受精的胚胎而获取，而牙髓干细胞则是来自于被牙科医生称之为“牙科废物”，如被拔除的牙齿又或是没有功能的牙齿。

Daniel Zimmermann：那么牙科的哪一领域将会最受益于此项研究？Jeremy Mao博士：从理论上讲，对再生组织的类型好像没有什么限制，因此我们可以预计，整个牙科领域都将受益于此项研究成果。

那么剩下的就是时间问题，我们需要充分研究这些细胞，直到可以利用其潜能进行各种类型结构的组织再生。

大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定材料试剂(一)主要设备和产地1.手术器械上海手术器械厂2.台式水平离心机Eppendorf，5810R德国3.Nanopure超纯水仪日本SANYO公司4.AA一200型电子天平美国Denver Instrumol/Lent公司5.低温高速离心机ThermoForma公司6.90一2型磁力搅拌器上海沪西分析仪器厂7.电动匀速垂直转轮上海沪西分析仪器厂8.微量移液枪德国Eppendorf公司9.烧杯、容量瓶上海实生公司10.全自动酶标光度仪美国Bio-Rad公司11.6cm/10cm细胞培养皿美国Conring12.2mL冻存管、细胞冷冻储存器美国Conring13.低温高速离心机ThermoForma公司产品14.YJ-875超净工作台苏州工业园区三兴净化科技有限公司15.C02培养箱3111型美国Thermo Forma公司16.CK40-F200型倒置显微镜日本Olympus公司17.10ml注射器美国BD公司(二)试剂和材料1.谷氨酰胺(L-Glutamine)美国Hyclone公司2.75%消毒酒精上海生工3.肝素美国sigma公司4.胰蛋白酶美国Amresco公司5.胎牛血清美国Gibco公司6.α-MEM培养液美国Hyclone公司7.5-6周龄SD大鼠上海斯莱克实验动物有限公司8.Percoll细胞分离液美国GE公司9.DMSO(细胞培养级)美国Sigma公司Rat BMSC的分离与培养分离颈椎脱臼法处死大鼠，75%酒精中浸泡5分钟，超级工作台内依次取下大鼠两条胫骨及两条股骨。

用手术器械将长骨上附着的肌肉组织尽量去除干净，整个过程保持无菌。

用剪刀剪去长骨两端，10ml注射器吸取加入肝素的完全培养液（10%FBSα-MEM），从长骨一端开口处注入，将骨髓腔内的细胞出入到50ml离心管内，直至长骨冲洗的发白，认为骨髓腔内的细胞都被吹入离心管内。

骨髓间充质干细胞的研究进展作者：闫德祺等来源：《中国当代医药》2013年第24期[摘要] 骨髓间充质干细胞（BMSCs）是骨髓基质中存在的非造血系的成体干细胞，具有多向分化潜能，已成为国内外基础医学和临床医学研究的热点。

本文简要介绍了BMSCs的概念提出、生物学特性、培养、鉴定，并根据近年来国内外包括应用中药进行的诱导分化、组织工程、基因治疗、再生医学等相关研究及临床应用前景作一综述。

[关键词] 骨髓间充质干细胞；诱导分化；组织工程；中药[中图分类号] R392.12 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）08（c）-0025-03早在1867年，世界著名病理学家Cohneim发现了骨髓中非造血系的干细胞，发现这类干细胞能够产生愈合伤口的成纤维细胞，后来Caplan[1]称之为间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），因为这类细胞除骨髓外，还广泛分布于脂肪、外周血、脐血、羊水、胎盘、胎肺、胎肾、牙髓、肌腱、滑膜、骨骼肌等不同的组织中，可定向分化为造血细胞以外的神经胶质细胞、肌细胞、腱细胞、成软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、平滑肌细胞等多种细胞，支持造血，对造血干细胞有扩增作用，具有贴壁生长、高度可塑、免疫调节的性质，在体外易分离和扩增，还易于外源基因的转入和表达[1-2]。

本文在此基础上对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的研究及其应用作一综述，以期开拓新的研究领域和临床应用。

1 改良性的BMSCs分离培养和鉴定方面的研究体外培养的小鼠及人的BMSCs形态学特征主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形。

BMSCs的体外分离方法有四类：贴壁培养法、密度梯度离心法、流式细胞术和免疫磁珠分离法。

贴壁培养法更换培养液去除造血系细胞后还残留有单核细胞、淋巴细胞贴壁生长，需要严格控制胰蛋白酶的剂量和消化时间，连续培养才能清除并得到相对的纯化[3]。

干细胞技术在牙齿再生中的应用前景展望继医学领域取得一系列突破性进展之后，干细胞技术正成为牙齿再生的一种潜在治疗方法。

牙齿再生是指利用干细胞技术从患者自身身体中提取干细胞并培养、增殖，再将其应用于牙齿损伤或缺失的治疗中，以实现牙齿的再生与修复。

作为一项前沿技术，干细胞技术在牙齿再生领域带来了巨大的希望。

本文将对干细胞技术在牙齿再生中的应用前景进行展望。

首先，干细胞技术在牙齿再生中的应用有望实现牙本质的再生。

牙本质是牙齿最重要的组织之一，它负责提供牙齿的强度和耐磨性。

然而，牙本质损伤或缺失往往导致牙齿功能的丧失，传统的修复方法往往难以满足患者的需求。

而干细胞技术能够从患者体内提取干细胞，并通过合适的培养和诱导，将其转化为具备牙本质特性的细胞。

这种方法不仅可以实现牙齿本质的修复，还可以避免患者受到异体或人工材料的异物排斥反应。

其次，干细胞技术在牙齿再生中的应用也有望实现牙骨再生。

牙骨是牙齿基础结构中的重要组成部分，对于牙齿的稳固性和维持功能起着至关重要的作用。

然而，牙骨缺损或破坏经常发生在牙齿疾病或外伤后，这给患者的生活和咀嚼功能带来了困扰。

利用干细胞技术，可以采集患者体内的干细胞并培养、增殖，然后将其应用于牙齿缺损区域，通过自身干细胞的分化和增长，实现牙骨的再生。

这种方法不仅能够恢复牙齿的稳定性，还可以为种植修复提供坚固的支撑。

此外，干细胞技术在牙齿再生中的应用还有望实现牙髓再生。

牙髓是牙齿内部的软组织，包含了丰富的血管和神经，起到营养牙齿、感觉牙齿的作用。

目前，患有牙齿髓炎的患者通常需要进行根管治疗或拔牙，这对患者的口腔健康和生活质量带来了一定的负面影响。

干细胞技术可以将患者自身体内的干细胞移植到受损的牙髓组织中，通过其再生和分化功能，实现牙髓的再生。

这种方法能够保留患者的牙齿，并恢复其正常功能。

至于干细胞技术在牙齿再生中的临床应用前景，尽管目前仍面临一些挑战，但其潜力不容忽视。

首先，干细胞的来源和获取方式是一个重要问题。