实验室拟南芥常用种植方法

种拟南芥的步骤
种拟南芥的步骤
1、紫外线照实验台15-20分钟。

准备：1/2MS培养基；平皿；枪；灭菌水；
0.1%Agar溶液（高温高压灭菌）；灭菌枪头（黄枪头要剪）；marker笔；无
水乙醇；95%乙醇；封口膜。

2、数种子于1.5ml的EP管中，做好标记。

3、微波炉化1/2MS培养基，倒板。

需要加抗生素的要加抗生素（潮霉素：每
100ml培养基加56ul；卡纳：每100ml培养基加100ul），无菌操作。

4、洗种子：
A、向盛种子的EP管中加1ml 75%的乙醇（250ul的无菌水加750ul的无水
乙醇，现配现用，且要先加无菌水），剧烈晃动8分钟。

【或者洗两次，每次4分钟】
B、将上述酒精倒出后，加入95%的乙醇冲洗5遍。

【3遍也可以】
C、用无菌水清洗2遍，倒掉水。

【1遍也可以】
5、将种子悬起。

加入100—200ul的0.1%的Agar溶液，将种子用枪吹起。

【Agar
的量要视情况而定】
6、点种子。

用200ul的枪和剪过的黄枪头吸取种子，在培养基上依次点种，尽
量分散均匀，晾干。

7、封皿，并做好标记。

8、层化。

放于4度的冰箱处理3天。

9、将层化的种子置于光照培养箱中育苗一周，培养皿要倾斜放置。

10、移栽于土中。

拟南芥的栽培拟南芥生长周期短，6∽8周即可完成从种子到种子的整个生活周期。

1.播种腐殖质土：珍珠岩或赭石=2 : 1，播种前土壤混合物进行高压灭菌30 min，以杀死可能混有的害虫。

通常使用培养皿点播拟南芥种子，点播时使用琼脂糖浓度为0.8 %的1/2 MS培养基进行点播种子（因为该琼脂糖浓度有利于在不伤根的情况下取出培养基中的小苗，移植至土壤中）。

直接土壤播种后，将播有种子的容器移至低温条件下（2∽4 ℃）2∽4 d，以破除种子休眠（对新鲜收获的种子尤为重要），在种子发芽期间必须保持土壤高湿度，故容器需要用塑料膜覆盖1周左右揭去。

2.生长发育条件控制光：光强度为120∽150 umol/(m2•s)，光周期为16 h光照，8 h黑暗。

长日照促进拟南芥提前开花，使叶数量减少且降低种子生成，较短日照有利于营养生长。

温度：拟南芥最适生长温度为25 ℃左右（对于迟开花拟南芥生态型来说，幼苗期要给以4 ℃左右几周的春化处理，以破除休眠）。

水分：拟南芥两片真叶开始伸展之前必须避免干旱，但供水过量会引起土表藻类和真菌的生长；当真叶长出后，灌水频率可相应减少（如每周一或两次），至长角果充实阶段必须保证水分供应，以利于种子形成，但当长角果进入成熟阶段时，较低湿度（< 50 %）是有利的。

营养：营养贫瘠的植株叶呈微淡绿色，植株矮、提早开花，且种子着生少；营养充足的健壮植株呈暗绿色。

防止杂交：防止昆虫进入导致杂交，各品系种植之间的距离>20 cm，从而防止不同品系的花相互接触。

3.拟南芥的花浸法注意事项：当拟南芥花序枝刚伸出时，摘除初生花序枝，促进其长出更多的花序枝，并移至长日照（16∽24 h光照/d）下生长，约一周后进行转化。

正常的生长条件下，转化约3周后收获种子以供鉴定。

确认再生植株为转基因植株的方法有：Southern印迹，报告基因的活性测定和组织化学等鉴定。

在取得一系列突变体后，可用功能互补的转化法来鉴定一个基因，即：用某种途径取得的DNA片段去转化一个功能缺失的突变体，如果转化后能够补偿基因功能突变表型的话，那么这个片段即为含目的基因片段。

[转载]拟南芥培养一、拟南芥播种种子装入dorf管内，20μl种子加1ml 75% 乙醇消毒1分钟；吸去乙醇，加入1ml 50%次氯酸钠：50%无菌水：0.05%吐温（or 5%漂白粉），震荡洗涤15-20分钟；稍离心使种子沉于下部，吸去次氯酸钠或漂白粉，加入无菌蒸馏水清洗（清洗3次，每次洗完后稍离心，吸净水分）；将种子用接种环均匀铺于MS培养基上，用封口膜封口，放入4℃冰箱内冷处理2-3天（春化）。

MS培养基的用量：直径为9cm的培养皿用25ml，直径为6cm 的培养皿用12.5ml。

加培养基时先将凝固的培养基用微波炉高温5分钟左右至全部解冻，然后慢慢冷却至不太烫手时倒板，如要加潮霉素等抗生素也是在此次加，加入后摇匀然后倒板。

倒板后至自然冷却即可铺种，如水分较多或板不够硬，亦可于倒板后将培养皿盖打开晾10分钟左右（此时超净台要关闭）。

种子的杀菌、清洗、铺板等过程在超净工作台上无菌操作，操作者进入超净工作台要用酒精棉球擦拭手、器具、超净台，防止感染细菌、真菌。

二、MS固体培养基制备1．培养基母液的配制和保存MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。

这样每次使用时，取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液。

现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。

大量元素(母液Ⅰ，20×) mg／LNH4NO3 33 000KNO3 38 000CaCl2·2H2O 8 800MgSO4·7H2O 7 400KH2PO4 3 400微量元素(母液Ⅱ，200×) mg／LKI 166H3BO3 1 240MnSO4·4H2O 4 460ZnSO4·7H2O 1 720Na2MoO4·2H2O 50CuSO4·5H2O 5CoCl2·6H2O 5铁盐(母液Ⅲ，200×) mg／LFeSO4·7H2O 5 560Na2-EDTA·2H2O 7 460有机成分(母液Ⅳ，200×) mg／LⅣA肌醇 20 000ⅣB烟酸 100盐酸吡哆醇(维生素B6) 100盐酸硫胺素(维生素B1) 100甘氨酸 400上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。

培养基上点种子：1.种子处理1.1 种子消毒处理在培养基中点样前，必须对种子进行消毒，防止感菌，具体方法为：先将种子倒在干净的纸上，挑去大的杂质，再将种子倒入EP管中，加入1mL70%酒精，振荡10min，将种子放在超净台中吹干。

1.2 点样将消毒处理后的种子，可以利用牙签点到培养基上，每次仅点一粒种子，根据培养皿的大小，确定一个里面能够点多少个种子，每个90mm培养皿上大约种30粒种子，防止植株长大后影响根与子叶的发育。

1.3 春化种子点样完毕后，将培养基密封，置于4℃冰箱里放置72h后，放回温室。

土培法：1.种种子前，要将营养土用自来水混匀后，121℃灭菌30min，待土冷却后，装入种植拟南芥的方盒中，再将方盒放入红色托盘中。

2.将要点的种子平铺在称量纸上，用牙签蘸取一粒种子点在营养土上,每点一个小盒时都用牙签做标记，以免遗种某个盒子。

（每个小盒子种5粒种子，每个大方盒子种9粒种子）3.将点了拟南芥种子的托盘置于22℃温室，并用一个干净的托盘盖在上面，大约两天后就可以打开上面的托盘，待植物长出4片叶子时，可以根据自己的实验需求对植物的幼苗进行取舍。

4.植株生长条件的控制幼苗移植后将花盆置于温室内，保证温室温度恒定在22℃，空气湿度70—80%，光照强度100—150μmol/m2/s，每天浇两次纯净水，上午9点左右一次，下午5点左右一次；一周浇一次营养液（1平匙溶于1L水中），营养液要灌在盆底。

浇水注意事项：1）水不可以浇的过多或过少，用手捏起一些土能挤出水来说明就有点太湿；2）水要浇均匀，托盘四个角的方向如果喷壶喷不到，可以用挤瓶均匀地喷一些水；3）用喷壶浇水时，喷壶的水柱不可以太大，以免把植物连根拔起；4）当植株出现花芽时，一定要保证水分的供应，促进果实的发育。

当植株结有豆荚时，可以适当的减少供水量，每两三天浇一次水便可，以利于种子的成熟。

开花后的植物不能再用喷壶浇水，要从盆底灌水，但不可以一次性灌太多水；5）在盆底灌水后，待植物吸收完水后，可以将盆底多余的水分倒出来；6）拟南芥受到胁迫判断标准：叶柄发紫，叶片发黄，开花期提前等；7）如果做生理实验，植物一旦受到胁迫，需要把植物丢弃，重新种植，以免实验数据不准确。

一、拟南芥播种种子装入dorf管内，20μl种子加1ml 75% 乙醇消毒1分钟；吸去乙醇，加入1ml 50%次氯酸钠：50%无菌水：0.05%吐温（or 5%漂白粉），震荡洗涤15-20分钟；稍离心使种子沉于下部，吸去次氯酸钠或漂白粉，加入无菌蒸馏水清洗（清洗3次，每次洗完后稍离心，吸净水分）；将种子用接种环均匀铺于MS培养基上，用封口膜封口，放入4℃冰箱内冷处理2-3天（春化）。

MS培养基的用量：直径为9cm的培养皿用25ml，直径为6cm的培养皿用12.5ml。

二、MS固体培养基制备1．培养基母液的配制和保存MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。

这样每次使用时，取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液。

现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。

大量元素(母液Ⅰ，20×) mg／LNH4NO3 33 000KNO3 38 000CaCl2·2H2O 8 800MgSO4·7H2O 7 400KH2PO4 3 400微量元素(母液Ⅱ，200×) mg／LKI 166H3BO3 1 240MnSO4·4H2O 4 460ZnSO4·7H2O 1 720Na2MoO4·2H2O 50CuSO4·5H2O 5 CoCl2·6H2O 5铁盐(母液Ⅲ，200×) mg／LFeSO4·7H2O 5 560Na2-EDTA·2H2O 7 460有机成分(母液Ⅳ，200×) mg／L ⅣA肌醇20 000ⅣB烟酸100盐酸吡哆醇(维生素B6) 100盐酸硫胺素(维生素B1) 100甘氨酸400上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。

拟南芥种植花序浸染法转化拟南芥（1）种植：选择吸水性好，土质松软的蛭石配合营养土（1：1/2）作为拟南芥种植土壤。

直径9cm的花盆，每盆播种20-30颗。

播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。

（2）去顶：在拟南芥初次开花时将花蕾剪掉，可以促进侧枝更多的花枝的增生。

适合转化植株的花卉并没有成熟，也没有产生已受精的角果。

（3）配制浸染液：在5%的蔗糖溶液中重悬农杆菌使OD=0.8，为了保持蔗糖溶液的新鲜，可以现配现用，无需灭菌。

100-200ml浸染2-3个小盆植株，400-500ml浸染，2-3个花盆（9cm）植株。

在浸染之前加入表面活性剂至浓度0.05%（500ul/L），如果产生表面活性剂的毒性现象（浸过部分发黄或死亡），将浓度降至0.02%。

（4）浸染：将盛花期拟南芥的花表面部分浸泡在农杆菌悬浮液中2-3s，同时轻轻旋转。

（5）暗培养：将浸染后植株套袋保持高度的湿润状态暗室培养24h。

（6）浸染后培养：隔天浇水，保证水分充足即可。

（7）种子收集：种子成熟，角果自然开裂后可以收种子。

（8）转基因种子筛选：在含有Kan抗生素的平板上培养浸染后所得种子。

40mg的种子大约200颗于含kan 10-50μg/ml 的0.5×MS培养基上春化2天，之后在持续光照条件下培养7-10天。

根据生长状况判断是否为转基因种子。

成功转入重组质粒的种子能够在抗性培养及上正常生长出4片以上真叶。

非转基因种子不能正常生长，仅能长出2片子叶，根的生长也受到严重抑制，一般萌发10天以后死亡。

（9）转基因植株转土栽培。

转基因种子在MS+kan平板上萌发2周以后，将阳性植株转入土壤继续培养。

转基因拟南芥纯合子筛选由于农杆菌介导的花序浸染法只能将目标片段整合到一条DNA单链上，为后续生理性状实验需要，将T0代转基因种子培育至T2代，利用抗性筛选得到纯合子。

根据杂合子在发生性状分离时会产生野生型后代，而野生型种子不能在MS+Kanr（50μg/ml）平板上正常生长，进行转基因植株纯合子的筛选。

培养基上点种子：1.种子处理1.1种子消毒处理在培养基中点样前，必须对种子进行消毒，防止感菌，具体方法为：先将种子倒在干净的纸上，挑去大的杂质，再将种子倒入EP管中，加入1mL70%酒精，振荡10min，将种子放在超净台中吹干。

1.2点样将消毒处理后的种子，可以利用牙签点到培养基上，每次仅点一粒种子，根据培养皿的大小，确定一个里面能够点多少个种子，每个90mm培养皿上大约种30粒种子，防止植株长大后影响根与子叶的发育。

1.3春化种子点样完毕后，将培养基密封，置于4℃冰箱里放置72h后，放回温室。

土培法：1.种种子前，要将营养土用自来水混匀后，121℃灭菌30min，待土冷却后，装入种植拟南芥的方盒中，再将方盒放入红色托盘中。

2.将要点的种子平铺在称量纸上，用牙签蘸取一粒种子点在营养土上,每点一个小盒时都用牙签做标记，以免遗种某个盒子。

（每个小盒子种5粒种子，每个大方盒子种9粒种子）3.将点了拟南芥种子的托盘置于22℃温室，并用一个干净的托盘盖在上面，大约两天后就可以打开上面的托盘，待植物长出4片叶子时，可以根据自己的实验需求对植物的幼苗进行取舍。

4.植株生长条件的控制幼苗移植后将花盆置于温室内，保证温室温度恒定在22℃，空气湿度70—80%，光照强度100—150μmol/m2/s，每天浇两次纯净水，上午9点左右一次，下午5点左右一次；一周浇一次营养液（1平匙溶于1L水中），营养液要灌在盆底。

浇水注意事项：1）水不可以浇的过多或过少，用手捏起一些土能挤出水来说明就有点太湿；2）水要浇均匀，托盘四个角的方向如果喷壶喷不到，可以用挤瓶均匀地喷一些水；3）用喷壶浇水时，喷壶的水柱不可以太大，以免把植物连根拔起；4）当植株出现花芽时，一定要保证水分的供应，促进果实的发育。

当植株结有豆荚时，可以适当的减少供水量，每两三天浇一次水便可，以利于种子的成熟。

开花后的植物不能再用喷壶浇水，要从盆底灌水，但不可以一次性灌太多水；5）在盆底灌水后，待植物吸收完水后，可以将盆底多余的水分倒出来；6）拟南芥受到胁迫判断标准：叶柄发紫，叶片发黄，开花期提前等；7）如果做生理实验，植物一旦受到胁迫，需要把植物丢弃，重新种植，以免实验数据不准确。

培养基上点种子：1.种子处理1.1 种子消毒处理在培养基中点样前，必须对种子进行消毒，防止感菌，具体方法为：先将种子倒在干净的纸上，挑去大的杂质，再将种子倒入EP管中，加入1mL70%酒精，振荡10min，将种子放在超净台中吹干。

1.2 点样将消毒处理后的种子，可以利用牙签点到培养基上，每次仅点一粒种子，根据培养皿的大小，确定一个里面能够点多少个种子，每个90mm培养皿上大约种30粒种子，防止植株长大后影响根与子叶的发育。

1.3 春化种子点样完毕后，将培养基密封，置于4℃冰箱里放置72h后，放回温室。

土培法：1.种种子前，要将营养土用自来水混匀后，121℃灭菌30min，待土冷却后，装入种植拟南芥的方盒中，再将方盒放入红色托盘中。

2.将要点的种子平铺在称量纸上，用牙签蘸取一粒种子点在营养土上,每点一个小盒时都用牙签做标记，以免遗种某个盒子。

（每个小盒子种5粒种子，每个大方盒子种9粒种子）3.将点了拟南芥种子的托盘置于22℃温室，并用一个干净的托盘盖在上面，大约两天后就可以打开上面的托盘，待植物长出4片叶子时，可以根据自己的实验需求对植物的幼苗进行取舍。

4.植株生长条件的控制幼苗移植后将花盆置于温室内，保证温室温度恒定在22℃，空气湿度70—80%，光照强度100—150μmol/m2/s，每天浇两次纯净水，上午9点左右一次，下午5点左右一次；一周浇一次营养液（1平匙溶于1L水中），营养液要灌在盆底。

浇水注意事项：1）水不可以浇的过多或过少，用手捏起一些土能挤出水来说明就有点太湿；2）水要浇均匀，托盘四个角的方向如果喷壶喷不到，可以用挤瓶均匀地喷一些水；3）用喷壶浇水时，喷壶的水柱不可以太大，以免把植物连根拔起；4）当植株出现花芽时，一定要保证水分的供应，促进果实的发育。

当植株结有豆荚时，可以适当的减少供水量，每两三天浇一次水便可，以利于种子的成熟。

开花后的植物不能再用喷壶浇水，要从盆底灌水，但不可以一次性灌太多水；5）在盆底灌水后，待植物吸收完水后，可以将盆底多余的水分倒出来；6）拟南芥受到胁迫判断标准：叶柄发紫，叶片发黄，开花期提前等；7）如果做生理实验，植物一旦受到胁迫，需要把植物丢弃，重新种植，以免实验数据不准确。

拟南芥的实验室种植方案————蛭石培养法一．实验原理拟南芥是十字花科植物，个体小，生活周期短，种植和生长不受季节限制，自花传粉，是植物实验常用的模式植物。

蛭石是一种天然、无毒的矿物质，在高温作用下会膨胀的矿物。

它是一种比较少见的矿物，属于硅酸盐。

有离子交换的能力，它对土壤的营养有极大的作用。

栽培介质需要有良好的排水性和透气性，以防止过湿引起真菌和昆虫幼虫的滋生。

使用泥炭土，蛭石，珍珠岩的混合土壤作培养介质能达到良好的效果。

二．实验材料和试剂花盆、铲子、小型喷水壶、薄膜、橡胶手套、尖嘴洗瓶、滤纸、烧杯、营养液、蛭石、泥炭土、珍珠岩、人工培养箱、4︒Ｃ冰箱。

三．实验步骤（2）种子处理春化种子：将种子放置于烧杯内，4︒Ｃ冰箱下，保持3-4天。

（3）土壤混合物的配置泥炭土：蛭石：珍珠岩=1：1：1。

用铲子放入花盆中，用营养液浇灌至湿润。

2.播种：将种子倒在滤纸上，轻轻震荡纸张，可均匀播撒，用薄膜（既保证所需温度又保证所需湿度）封住花盆口，薄膜扎孔（以便后继浇灌营养液）。

3.培养：（1）人工培养箱，温度23︒Ｃ，光强240 µmol·m-2·s-1，16h光照, 8 h 黑暗, 相对湿度60%~70%。

（2）在培养时浇培养液，用尖嘴洗瓶浇灌，1-2天浇一次。

（3）种子发芽后，及时揭开薄膜，幼苗生长过程中及时浇灌营养液和适宜的水分。

四. 实验结果预测3-4天后种子可发芽，此时，及时揭去薄膜，继续培养植株，作实验观察。

五．注意事项（1）实验过程中佩戴橡胶手套。

（2）幼苗浇灌水分不易过量，以避免根部缺氧死亡。

（3）种子播种时要均匀。

（4）配置土壤混合物时，要保持珍珠岩完整和土质蓬松。

五. 参考文献和资料翟中和，丁明孝，王喜中.细胞生物学（第四版）.高等教育出版社。

刘金亮. 拟南芥实验室常用的种植方法.西北师范大学，生命科学学院，730070。

张庆友，孙新月，兰伟，许树成，祝雪兰. 拟南芥实验室种植栽培要领. 生物学通报. 2015年第50卷第七期。

拟南芥栽培方法
1．装土：泥炭（tref型号705#）和蛭石的配比为2：1，混匀装在盆里压实，用1倍的MS 大量浸盆，基质一定要完全湿润。

2．泡种子：取适量拟南芥种子装在2 ml的离心管中，加入1 ml 水放在4度冰箱3 d，打破种子休眠。

3．播种：播种前，土面喷水至湿润。

将种子到在滤纸上，用牙签或竹签挑起种子放在土面上，建议一个花盆中播5颗。

播种完毕盖上透明盖子，放在培养箱中，一般2d就可以发芽。

4．待长至20 d左右，即可揭盖，再浇一次MS大量。

生长期间应每隔2-3 d观察一次生长状况，补充水分。

5．主要虫害是蚜虫和一种小飞蝇（幼虫在土壤中以拟南芥的根为食），一般用吡呀酮，灭蝇胺防治。

种拟南芥的步骤
1、紫外线照实验台15-20分钟。

准备：1/2MS培养基；平皿；枪；灭菌水；
0.1%Agar溶液（高温高压灭菌）；灭菌枪头（黄枪头要剪）；marker笔；无
水乙醇；95%乙醇；封口膜。

2、数种子于1.5ml的EP管中，做好标记。

3、微波炉化1/2MS培养基，倒板。

需要加抗生素的要加抗生素（潮霉素：每
100ml培养基加56ul；卡纳：每100ml培养基加100ul），无菌操作。

4、洗种子：
A、向盛种子的EP管中加1ml 75%的乙醇（250ul的无菌水加750ul的无水
乙醇，现配现用，且要先加无菌水），剧烈晃动8分钟。

【或者洗两次，每次4分钟】
B、将上述酒精倒出后，加入95%的乙醇冲洗5遍。

【3遍也可以】
C、用无菌水清洗2遍，倒掉水。

【1遍也可以】
5、将种子悬起。

加入100—200ul的0.1%的Agar溶液，将种子用枪吹起。

【Agar
的量要视情况而定】
6、点种子。

用200ul的枪和剪过的黄枪头吸取种子，在培养基上依次点种，尽
量分散均匀，晾干。

7、封皿，并做好标记。

8、层化。

放于4度的冰箱处理3天。

9、将层化的种子置于光照培养箱中育苗一周，培养皿要倾斜放置。

10、移栽于土中。

拟南芥培育方法—通用指南一、原理拟南芥作为高等植物的模式生物被全世界的植物生物学实验室广泛研究。

然而，照顾好这种小植物可能不是那么容易。

这里介绍一个马里兰大学帕克学院的HevenSze实验室的通用指南。

Sze实验室及其他实验室的成员为建立这个在实验室培育拟南芥的通用指南做出了许多努力。

二、步骤1. 准备种植用土我们使用Miracle-Gro混合土（2立方英尺一袋）与Miracle-Gro珍珠岩（8夸脱一袋）来培养拟南芥，在一个可以放下2袋混合土的大容器中和土，1袋混合土（2立方英尺）混入半袋珍珠岩（4夸脱）。

注意：Sze实验室在装土之前经常将土灭菌！（方法如下）（1）将干土放入灭菌容器中，直至与顶部相差一英寸，将土拍实。

（2）用铝箔纸将容器封住，在每一个容器上放一张灭菌用胶带，缠好。

确保容器外没有土，放入灭菌锅。

（3）用常规/秒速/快速模式灭菌30~50 min，灭菌模式及时间取决于灭菌的容器数量。

（4）当温度降至室温，将土放入花盆，轻轻压实。

记住将灭菌土保存好，避免种子或菌类污染。

灭过菌的土至少可以使用两星期，如无需要请不要多次灭菌。

（5）将花盆用去离子水浸没（不要超过土表面）用humidomes覆盖，使其吸水3-6小时或过夜。

吸水后应该还保存约1英寸高的水，如果没有请添水。

（6）此时的土可以用于种植拟南芥。

2. 种子消毒方法A（1）取适量种子（野生型、突变体或互补株系）置于一个EP管中，加1 ml 消毒溶液。

消毒溶液：20%Chlorox消毒液0.05%Tween-20用新灭过菌的无菌水配制。

（2）用振荡器以最大速度震荡20-30秒。

（3）放置7-10 min，偶尔震荡一下。

（4）8 000 rpm 离心5秒。

（5）仔细将水倒出。

（6）加1 ml 无菌水，震荡重旋种子。

（7）8 000 rpm 离心5秒，倒去上清。

（8）重复步骤6-7，重复四次。

（9）将灭菌的种子移到底部铺有无菌滤纸的小Fisher盘（100×15 mm）中。

自制培养箱探究拟南芥种植培养条件摘要：拟南芥是生物学研究的模式之物之一，培养拟南芥可以为学习孟德尔杂交实验奠定基础。

在新疆干燥，偏见气候，无光照培养箱条件下，探索拟南芥种植培养方法。

关键词：拟南芥种植培养一、拟南芥培养的意义拟南芥（Arabidopsis thaliana），又称鼠耳芥，分布广泛，一年生草本，高20-35厘米，十字花科，总状花序顶生，花朵直径约3mm，花瓣4片，白色，匙形。

长角果线形，长0.5～2厘米，每个含20～30粒种子。

拟南芥的特点是植株小，生命周期短，易培养，春型拟南芥萌发后3周左右就可开花，能在6周内完成一个世代，严格自花传粉，基因高度纯合，染色体有5对，每个染色体组有7000万个碱基对，拟南芥基因组测序已完成。

因其以上优点，成为遗传学研究的好材料，被称为植物中的果蝇，是目前公认的五大模式生物之一。

在高中生物教材中，孟德尔豌豆杂交实验是开启遗传学学习的首要也是重要篇章，孟德尔两大遗传学定律的提出，是以豌豆杂交实验为基础展开。

在普通高中生物学课程标准（2017年版）中提出，为帮助学生打成对概念3“遗传信息控制生物性状，并代代相传”的理解，促进学生生物学学科核心素养的提升，应展开模拟植物或动物性状分离的杂交实验[1]。

该实验可在一定程度上帮助学生理解性状分离比形成的核心原因，为促进学生将理论与实际相结合，同时体验科学家的探索历程，笔者想利用与豌豆生殖方式类似的拟南芥模拟重复孟德尔豌豆杂交实验，而这一实验的基础是在现有条件下培养拟南芥，为学生模拟孟德尔实验奠定基础。

二、拟南芥培养条件初步探索拟南芥在世界各地分布广泛，生活适应能力强，实验室培养一般采用无菌种植，即，在无菌条件下，种子经过75%酒精消毒，晾干后播种于MS或1/2MS固体培养基，春化48h，春化结束后，转入光照培养箱培养10天以上。

条件为16小时光照（8000LX），8小时黑暗交替，待长出真叶后移苗至以蛭石，草炭土按照1:3比例混合，提前3-6小时吸水的土壤中，并用保鲜膜覆盖1-2天。

拟南芥种植方法Document serial number【KKGB-LBS98YT-BS8CB-BSUT-BST108】培养基上点种子：1.种子处理1.1 种子消毒处理在培养基中点样前，必须对种子进行消毒，防止感菌，具体方法为：先将种子倒在干净的纸上，挑去大的杂质，再将种子倒入EP管中，加入1mL70%酒精，振荡10min，将种子放在超净台中吹干。

1.2 点样将消毒处理后的种子，可以利用牙签点到培养基上，每次仅点一粒种子，根据培养皿的大小，确定一个里面能够点多少个种子，每个90mm培养皿上大约种30粒种子，防止植株长大后影响根与子叶的发育。

1.3 春化种子点样完毕后，将培养基密封，置于4℃冰箱里放置72h后，放回温室。

土培法：1.种种子前，要将营养土用自来水混匀后，121℃灭菌30min，待土冷却后，装入种植拟南芥的方盒中，再将方盒放入红色托盘中。

2.将要点的种子平铺在称量纸上，用牙签蘸取一粒种子点在营养土上,每点一个小盒时都用牙签做标记，以免遗种某个盒子。

（每个小盒子种5粒种子，每个大方盒子种9粒种子）3.将点了拟南芥种子的托盘置于22℃温室，并用一个干净的托盘盖在上面，大约两天后就可以打开上面的托盘，待植物长出4片叶子时，可以根据自己的实验需求对植物的幼苗进行取舍。

4.植株生长条件的控制幼苗移植后将花盆置于温室内，保证温室温度恒定在22℃，空气湿度70—80%，光照强度100—150μmol/m2/s，每天浇两次纯净水，上午9点左右一次，下午5点左右一次；一周浇一次营养液（1平匙溶于1L水中），营养液要灌在盆底。

浇水注意事项：1）水不可以浇的过多或过少，用手捏起一些土能挤出水来说明就有点太湿；2）水要浇均匀，托盘四个角的方向如果喷壶喷不到，可以用挤瓶均匀地喷一些水；3）用喷壶浇水时，喷壶的水柱不可以太大，以免把植物连根拔起；4）当植株出现花芽时，一定要保证水分的供应，促进果实的发育。

当植株结有豆荚时，可以适当的减少供水量，每两三天浇一次水便可，以利于种子的成熟。

.'1培养基MS培养基（ Sigma公司）B5培养基（ pH 5.5）Content mg/L Content mg/L Content mg/LKNO2500. 2.0Nicotinic1 3ZnSO4 7H2O.150H3BO3 3.0Thiamine HCl10CaCl 2H O22.250KI0.75Pyrindoxine1 MgSO4 7H2O.150.NaH2PO4 H2O Na2MoO4 2H2O.27.8.FeSO4 7H2O CoCl 2 6H2O.10Na2EDTAMnSO4 H2O.0.025CuSO 5H O42改良的 1/4 Hoagland 培养液（ mM, pH6.0 ）：Content mM ContentKNO 31.25ZnSO40.25m-Inositol1000.025Glycine20037.3Kinetin0.1IAA0.1-1mM0.002Ca(NO3)21.500.050H3BO3MgSO40.75KCl0.050KH 2PO40.5(NH 4)6Mo0.0757O24FeSO40.0720.0015CuSO4Na2EDTA 0.0720.1Na2SiO32植物材料的常规种植拟南芥种子均匀地播撒于1/3 B5液体培养基浸润的蛭石上，塑料膜遮盖至种子萌o 发，揭开膜，让其自然生长，适当间苗，烤苗至蛭石表面干燥后加水。

置于 23 C，16/8 h的光照培养间中生长。

3拟南芥种子的表面灭菌处理1）拟南芥种子在 4 C 下春化 3-5 天。

2）在超净台上用 70%酒精处理种子 2-5 分钟。

3）弃去酒精，用无菌水洗1-2 次。

4）将种子用 15% Bleach （KAO 公司）处理15分钟，间歇振荡。

5）用无菌水洗 4-6 次，每次充分振荡混匀。

6）将种子悬浮在灭菌的0.1% Agar 中。

7）均匀地将种子播撒在B5 培养基平皿中。

4植物材料的水培体系拟南芥种子经表面灭菌处理后均匀播撒于1/2 MS固体培养基上，10-15粒 /皿，生长 2周后，小心地将其转入水培体系中。

拟南芥种植到培养基中的方法
材料：1/2MS培养基、植物组织培养专用琼脂、1ml吸头（灭菌）、0.1%琼脂糖、水（灭菌）、75%酒精
种植过程在超净工作台内进行，具体方法为：
1、种植前先将实验过程中用到的物品放到超净工作台，紫外线灭菌15分钟左右，提供一个相对无菌的环境。

注：种子不能放在紫外灯下照射，以免引起损伤和变异。

2、用75%酒精棉球将暴露于实验台内的手及其他部分擦拭一遍，起消毒作用，种植过程中最好不要在上风向放东西，手也最好不要在上风向经过。

3、在放有种子的离心管中加入75%的酒精，消毒5分钟左右，时间不宜过长以免影响种子的活性。

酒精的量大约为离心管体积的2/3，上下颠倒离心管使种子与酒精充分接触。

种子不宜过多（超过50ul），否则消毒效果不好。

4、消毒完后，将离心管中的酒精吸出，用灭菌的ddH2O漂洗3-5遍，注意有一些种子会漂浮在水中。

在洗的过程中用移液器慢慢吹打，注意更换吸头，避免交叉污染。

5、种子漂洗完后将适量0.1%琼脂糖加入离心管中。

之所以用琼脂糖而不是水是因为琼脂糖有粘性，种子会悬浮在其中，而在水中种子一般都沉在底部不便于种植。

将种子均匀滴到1/2MS培养基中，每个平皿大约种植30粒左右，在培养皿的盖和底部最好都要写上种植的拟南芥的名称以及日期，最后用胶条将培养皿封口。

6、将培养皿放到4℃冰箱中（主要是让种子均匀发芽），2-3天后便可拿到培养间中。

拟南芥组织培养一、种子消毒：方法一：将拟南芥种子置于1 .5 ml eppendorf 管(微量离心管)中，加入1 ml 蒸馏水，4C春化3 d，70 %（v／v ）乙醇1mi n、7 %（v／v ）次氯酸钠10 mi n 浸泡消毒，并用无菌水冲洗5 次。

方法二：在超净工作台内，用无菌蒸馏水浸泡1 min，然后用80％乙醇消毒90s，最后用无菌蒸馏水冲洗3～5次备用。

消毒完毕的种子可以用200ul的tips吸去洗涤液，然后在超净工作台上挥发掉残余水分、洗涤液。

方法三、取野生型拟南芥种子放人离心管内，75％乙醇清洗后，无菌蒸馏水清洗1—2次，转入无菌离心管；5％次氯酸钠溶液浸泡5—6 min，用无菌蒸馏水清洗3～4次，加入1 ml 无菌水，用移液枪接种。

二、选用的培养基选用1/2MS培养基对种子进行培养。

（MS和1/2MS都可以，1/2MS就是大量元素减半，其他东西和ms培养基是一样的量。

糖可以加，会长得比较好，但是也很容易污染。

如果在平板上要生长时间比较长，需要做一些实验的，比如根的发育，最好不要加。

）也可以用MS+30 g／L蔗糖的固体培养基。

（我想两种培养基都接种上，比作对比确定好坏）。

MS培养基配料表：三：接种方法拟南芥种子消毒后，用移液枪吸取拟南芥种子和水的混合物，均匀地在MS 生长培养基的培养皿平板上滴落，并使之形成两条平行的直线。

（如不行，可适当添加琼脂）。

四、培养得无菌苗接种后置于光照培养箱(型号：GXZ．500C；培养光照条件为16小时光照，8小时黑暗，培养温度为22℃中竖直培养。

3天后即可取材用于器官离体再生实验。

萌发5天后，在超净工作台中，用镊子将苗移栽到装有1／2 MS培养基的50ml三角瓶中（每瓶4--6棵，视情况而定），于短日照条件下培养30天左右获得无菌苗。

（短日照光照条件8小时光照，16小时黑暗，长日照光照条件为16小时光照，8小时黑暗，培养温度均为22℃。

）此处获得无菌苗的时间有异议，应该为2--3周？五、外植体的选取B5 + 5 mg／L2 ，4-D+ 0 .5 mg／L KT 培养基上诱导愈伤组织,莲座叶作外植体出愈慢，出愈率低，愈伤组织质量较差；叶柄、下胚轴和根作外植体出愈快，且愈伤组织质量好，后期易分化。

拟南芥植物组织培养 WTD standardization office【WTD 5AB- WTDK 08- WTD 2C】拟南芥组织培养一、种子消毒：方法一：将拟南芥种子置于1 .5 ml eppendorf 管(微量离心管)中，加入1 ml 蒸馏水，4C春化3 d，70 %（v／v ）乙醇1mi n、7 %（v／v ）次氯酸钠10 mi n 浸泡消毒，并用无菌水冲洗5 次。

方法二：在超净工作台内，用无菌蒸馏水浸泡1 min，然后用80％乙醇消毒90s，最后用无菌蒸馏水冲洗3～5次备用。

消毒完毕的种子可以用200ul的tips吸去洗涤液，然后在超净工作台上挥发掉残余水分、洗涤液。

方法三、取野生型拟南芥种子放人离心管内，75％乙醇清洗后，无菌蒸馏水清洗1—2次，转入无菌离心管；5％次氯酸钠溶液浸泡5—6 min，用无菌蒸馏水清洗3～4次，加入1 ml无菌水，用移液枪接种。

二、选用的培养基选用1/2MS培养基对种子进行培养。

（MS和1/2MS都可以，1/2MS就是大量元素减半，其他东西和ms培养基是一样的量。

糖可以加，会长得比较好，但是也很容易污染。

如果在平板上要生长时间比较长，需要做一些实验的，比如根的发育，最好不要加。

）也可以用MS+30 g／L蔗糖的固体培养基。

（我想两种培养基都接种上，比作对比确定好坏）。

MS培养基配料表：三：接种方法拟南芥种子消毒后，用移液枪吸取拟南芥种子和水的混合物，均匀地在MS 生长培养基的培养皿平板上滴落，并使之形成两条平行的直线。

（如不行，可适当添加琼脂）。

四、培养得无菌苗接种后置于光照培养箱(型号：GXZ．500C；培养光照条件为16小时光照，8小时黑暗，培养温度为22℃中竖直培养。

3天后即可取材用于器官离体再生实验。

萌发5天后，在超净工作台中，用镊子将苗移栽到装有1／2 MS培养基的50ml三角瓶中（每瓶4--6棵，视情况而定），于短日照条件下培养30天左右获得无菌苗。