Miller培养基

甜瓜作为葫芦科植物中的一种重要的园艺作物，是全世界普遍栽培的重要水果，具有较高的商品价值和经济价值。

随着植物细胞工程和基因工程技术的迅速发展，应用组织培养、基因转化等技术手段进行甜瓜品质改良、提高抗逆性、创造新种质，已成为甜瓜育种快速有效的新方法。

甜瓜基因工程是利用分子克隆技术，分离、提取或人工合成具有抗病、抗虫、提高品质等某一特性的基因片段，并利用根癌农杆菌介导或基因枪等技术转入甜瓜植株，可获得前所未有的甜瓜新种质，这是进行甜瓜遗传育种、品种改良，拓宽种质资源范围的一条有效途径。

目前，转基因甜瓜研究主要集中在抗病、抗虫与提高果实品质和控制果实成热等方面，现就上述研究做一综述。

1 甜瓜组织培养研究进展随着基因工程技术在农作物育种中的研究与应用，甜瓜组织培养技术的开展为分子育种奠定了良好的基础。

建立高效的甜瓜再生体系是甜瓜基因工程中的关键性基础工作。

甜瓜组织培养工作起步较晚，自唐定台等首次报道了植物激素在甜瓜再生过程起作用之后，有关甜瓜的组织培养的报道相继出现。

Dirks等通过真叶、侯喜林等通过下胚轴、马国斌等通过生长点、尹俊等通过胚、钟俐等通过子叶节、于喜艳等通过子叶等多种外植体方式获得甜瓜再生植株。

甜瓜组织培养过程中受到的影响因素很多，主要如下。

1.1 外植体基因型基因型对甜瓜不定芽发生和植株再生具有决定性作用，选择不同甜瓜品种进行组织培养研究，外植体基因型差异对再生率影响明显，繁殖系数差异较大。

主要表现在不同品种间不定芽的发生和植株再生能力的不同。

于为常等研究证明，S-24和网纹香两甜瓜品种各种外植体中内源IAA含量很高，超过一般植物的数倍，并以胚轴中含量最高而且愈伤组织中的IAA的含量超过各种外植体，这可能是导致不同品种甜瓜外植体不定芽诱导效果不同及愈伤组织不易分化的缘故。

根据资料显示，甜瓜组织培养过程中不定芽发生能力是一种受基因型控制的数量性状，并有可能存在基因间的互补作用。

蔡润等对引进杂交种和农家品种进行的子叶培养结果表明，杂交种的不定芽诱导率高于当地品种。

BD培养基⽬录BD培养基BD培养基⽬录BD培养基-分⼦⽣物学⽤YNB⽆氨基酸酵母氮源BD291920-2kg3,868.00YNB⽆氨基酸酵母氮源BD291920-500g1,280.00YNB⽆氨基酸酵母氮源BD291920-100g350 Yeast Nitrogen Base酵母氮源BD239210-100g546 Yeast Extract TechnicalBD288610-10kg4,591.00Yeast Extract Technical BD288620-500g511Yeast Extract酵母粉BD BD212720-2kg2,011.00如果您对上述产品感兴趣，请致电183********或QQ：3259632176，上海⾦畔⽣物科技有限公司进⼀步了解详情。

Yeast Extract酵母粉BD BD212750-500g591 Tryptose Broth胰蛋⽩⽰⾁汤BD262200-500g848Tryptose胰蛋⽩⽰BD BD211713-500g1,574.00Tryptone胰蛋⽩胨BD BD211699-2kg3,381.00Tryptone胰蛋⽩胨BD BD211705-500g955 Tryptic Soy Broth(TSB)胰酶⼤⾖⾁汤BD BD211822-2kg2,076.00Tryptic Soy Broth(TSB)胰酶⼤⾖⾁汤BD BD211825-500g495Tryptic Soy Agar（TSA）胰酶⼤⾖琼脂BD236920-2kg2,634.00Tryptic Soy Agar（TSA）胰酶⼤⾖琼脂BD236940-100g601 Tetrathionate Broth Base BD210430-500g421TAT Broth Base BD298410-500g1,008.00 Sabouraud Dextrose agar沙⽒葡糖琼脂BD BD211661-2kg1,850.00 Sabouraud Dextrose agar沙⽒葡糖琼脂BD210950-500g531R2A Agar R2A琼脂BD218261-2kg4,323.00如果您对上述产品感兴趣，请致电183********或QQ：3259632176，上海⾦畔⽣物科技有限公司进⼀步了解详情。

1、愈伤组织：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。

2、植物细胞全能性：任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植珠所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。

3、胚状体：是指在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的具有双极性的胚状结构。

4、体细胞杂交：完全不经过有性过程，只通过体细胞融合制造杂种的方法称为体细胞杂交。

快速繁殖(微繁殖)：用组织培养的方法，使植物的部分器官、组织迅速扩大培养，并移到温室或农田繁殖出大量幼苗的繁殖方法。

6、再分化：愈伤组织形成不定芽或不定根或胚状体。

7、原生质体融合（体细胞杂交）：就是使分离下来的不同亲本的原生质体，在离体条件下通过诱导发生的质膜融合进而细胞核融合，像性细胞受精作用那样互相融合成一体的现象。

8、脱毒苗：是指不含该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物内的存在表现阴性反应的苗木。

9、愈伤组织培养:是指将母体植株上的外植体，接种到无菌的培养基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术。

10、外植体：在植物组织培养过程中，由植物体上切取的根、茎、叶、花、果、种子等器官以及各种组织、细胞或原生质体等统称为外植体。

11、热处理脱毒：利用病毒和植物细胞对高温忍耐性不同，选择适当的高温处理染病植株，使植株体内的病毒部分或全部失活，而植株本身仍然存活。

12、平板培养法：是把单细胞悬浮液与融化的琼脂培养基均匀混合，平铺一薄层在培养基底上的培养方法。

13、消毒：指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。

14、玻璃化现象：在长期的离体培养繁殖时，有些试管苗的嫩茎、叶片呈现半透明水渍状，这种现象称为玻璃化。

15、初代培养基：是指用来第一次接种外植体的培养基。

16、脱分化：一个已停止分裂的成熟细胞转变为分生状态，并形成未分化的愈伤组织的现象。

17、液体培养：指在进行培养时，培养基中不加琼脂等凝固剂，一般需要通过振荡等方法解决培养基的通气情况。

β-半乳糖苷酶活性测定（β-galactosidase assays）1、将过夜培养的菌液按1%接种量到新鲜培养基中培养，待OD600至0.6时取出，放置于冰上；（或可检测不同OD600时，菌的酶活性）2、取50-100μl 菌液至1.5 ml 的离心管中，加370-420μl Z buffer；3、加20 μl 氯仿和10 μl 0.1% SDS，振荡混匀，裂解细胞，放置于冰上30分钟；4、向离心管中加入100 μl 浓度4 mg/ml 的ONPG，混匀后立即置于30℃反应30-60分钟；5、待颜色变黄后，加入250 μl 1 M Na2CO3中止反应，准确记录变色反应的时间；6、取200μl上清，测定420 nm 和550 nm 处的吸光度；7、计算β-半乳糖苷酶酶活力：Miller Units = 1,000×[(OD420－1.75×OD550)] / (t×V×OD600)，其中，OD420和OD550----显色后的反应液读数；OD600----用于显色分析的培养液的细菌密度；t ----显色反应时间(单位min)；V ----用于显色分析的培养液体积(单位ml)。

Z buffer (总体积100 ml)：Na2HPO4·12H2O 100mM 3.5814 gNaH2PO4·H2O 40mM 0.624gKCl 10mM 0.07455gMgSO4·7H2O1mM 0.0246gβ-mercaptoethanol 5.4μl / ml 540μl加水到总体积90 ml，待试剂溶解后调pH 至7.0，最后定容到100 ml，4℃储存。

Substrate solution(总体积10ml)----现用现配Na2HPO4·12H2O 60mM 0.215 gNaH2PO4·H2O 40mM 0.0624gONPG 4mg/ml 0.04g终止液（100ml）：Na2CO3 1M 10.6g。

植物组织培养发展历程1、理论准备阶段（探索阶段）（20世纪30年代前）①1667年，虎克（R. Hooke）发现细胞；1756年，Duhamel 发现了愈伤组织形成。

②1838—1839， Schleiden(1838施莱登提出植物细胞学说) 和 Schwann（1839年施旺认为细胞学说也适用于动物）创立了细胞学说。

③1902年德国的Haberlandt(哈布兰特)：“植物离体细胞培养试验”。

提出了高等植物的器官和组织可以不断分割、直至单个细胞，并大胆提出在试管培育植物，预言离体细胞在生理、发育上有潜在的全能性。

2、发展时期（奠基阶段，30年代中至50年代末）组培的真正建立和发展，从1934年开始才算有了突破。

1943年，white出版了第一本专著《植物组织培养手册》《A Hand Book of Plant Tissue Culture》1945年F.Skoog和崔澄发现腺嘌呤促细胞分裂、组织成芽。

Skoog和催澄在烟草茎段和髓培养以及器官形成的研究中发现，腺嘌呤或腺苷可以解除生长素（IAA）对芽形成的抑制作用，而诱导形成芽。

1956年 Miller发现了激动素（Kinetion）其效果为腺嘌呤的3万倍。

1957 Skoog和Miller提出有关植物激素控制器官形成的概念细胞分裂素茎生长素根1958 Reiner and Steward，从胡萝卜愈伤组织和细胞培养中，诱导分化产生了体细胞胚，第一次科学证明了全能性理论。

White等的工作建立了植物组织培养的综合培养基，成为当今植物组织培养的技术基础（2）原生质体培养取得突破：1971 Takebe 在烟草上首次由原生质体获得了再生植株。

再次证实植物细胞的全能性。

原生质体培养为外源基因的导入提供了理想的受体，促进了体细胞融合技术的发展细胞水平→分子水平（3）花药培养取得显著成绩：1964 Guha 首次实现了花药的离体培养。

该技术主要用于遗传育种工作，可大大缩短育种周期，提效率。

第⼆章植物组织培养基本操作教学⽬的：了解植物组织培养培养的培养基种类、成分及其特点，学习植物组织培养基本操作，了解离体培养环境条件，以及炼苗移栽基本⽅法。

职业技能教学点：具有植物组织培养基本操作程序的认知。

能够识别各类培养基特点，熟悉MS培养基成分；具有制作培养基能⼒，具有选择外植体、表⾯灭菌、⽆菌接种等基本能⼒；具有植物组织培养条件控制基本能⼒；有进⾏组培苗驯化练苗的基本能⼒。

教学时间：10学时教学重点：各类培养基特点，固体培养基制作，外植体的选择及表⾯灭菌，外植体培养条件，组培苗驯化原则及常规移栽⽅法。

教学难点：各类培养基特点，培养基制作及⾼压灭菌操作，外植体的表⾯灭菌，外植体培养中易出现的问题及其解决办法，试管苗的特点。

教学内容：第⼀节培养基成分、种类及特点植物⽣长必需16种基本元素：N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、Mn、B、Cu、Zn、Mo、Cl、C、H、O。

离体培养条件下，各种元素主要从培养基中获得：H 和O来源于⽔，C来源于添加的糖类，其它矿质元素来源于组成培养基的⽆机盐。

培养基是根据植物⽣长所需营养成分，配制成的供植物⽣长的⼈⼯制作的营养物质。

⼀、培养基的成分不同植物组织器官所需要的营养条件不完全⼀样，培养基营养成分也有差异，但总的来说，培养基⼀般包括⽆机盐、有机化合物和⽣长调节剂三⼤基本组成成分。

1、⽆机盐类离体组织⽣长发育的基本成分，根据植物对必需元素需要的量，可以分为以下两类：⼤量元素—植物所需元素的使⽤量⼀般在每升⼏⼗-⼏千毫克，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。

微量元素—植物所需元素的浓度⼩于10-5～10-7mol/L，Fe、Cu、Zn、Mn、Mo、B、Cl。

除C、H、O外，其它矿质元素通常以⼀定浓度的⽆机化合物形式，按⼀定⽐例配制⽽成，溶于⽔中以离⼦态被吸收，N有硝态氮KNO3和铵态氮（NH4）2SO4两类提供。

2、有机化合物培养基中只有⽆机盐叫做基本培养基，为使培养物更好的⽣长，还需添加有机成分，常⽤有糖类、维⽣素、醇类、嘌呤、氨基酸等。