试验方案：
一、样品的取样
在青岛胶州市的正规超市购买5种酸奶，进行实验时均处于产品保质期内。
对这几种样品分别进行取样。
二、样品的稀释
在无菌工作台上用灭菌过的移液管直接从酸奶样品中吸取1mL装入9ml无菌生理盐水试管中，快速震荡试管，，使其呈1:10的均匀稀释液，同法继续稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释度，选取合适的三个稀释度（如：10-1、10-2、10-3）按此操作依次制备成A1-A2-A3、B1-B2-B3、C1-C2-C3、D1-D2-D3、E1-E2-E3的样品稀释液。
三、样品的分离鉴定
1、分别用移液枪吸取A-E的样品稀释液250μL置于MRS固体培养基（MRS培养基成分：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，K2HPO4 2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，（琼脂15～20g），蒸馏水1000mL）平板上，涂布均匀后置于37℃培养箱培养24h，观察培养结果及细菌的生长情况。
用接种环在各平板上挑取出现不同菌落形态大小的单一黄色菌落，分别在平板上划线，37℃倒置培养24h。
2、根据菌落的大小、颜色、光泽和透明程度等，从培养24h的每个平板中选取单菌落，在MRS固体平板上反复划线纯化，反复进行此操作步骤以使最终培养出的每个菌落都为单一菌种菌落，37℃培养24h。
然后依次进行菌体形态观察、过氧化氢酶试验、淀粉水解试验、明胶液化试验、乙酰甲基甲醇试验、产气试验、碳水化合物发酵试验、乳酸定性检测。
（1）菌体形态的观察
将划线平板上培养了24h的各菌株在载玻片上涂片及固定后，进行革兰氏染色。
先用草酸铵结晶紫初染色，1分钟后水洗载玻片，然后碘液媒染1分钟，水洗、吸干。
95%乙醇脱色直到滴加的酒精不出现紫色，接着水洗、吸干。
最后用0.5%的番红染色液再染色10-30秒，水洗，干燥，置于光学显微镜下观察其形态特点及染色结果。
选取油镜观察细胞呈杆状或球状，革兰氏阳性菌。
（2）过氧化氢酶测定实验
取一环接种的培养物，涂于干净的载玻片上，然后在其上滴加过氧化氢，有气泡
则为阳性反应，无气泡为阴性反应。
（3）淀粉水解试验
将固体淀粉培养基融化后冷却至50℃左右，无菌操作制成5个平板，将划线平板上培养了24h的各菌株分别在不同平板上划线接种。
将平板倒置37℃恒温箱中培养24h。
观察各种菌的生长状况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。
如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。
透明圈大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生细胞外淀粉酶活力的高低。
需要的试剂：H2SO4、HCl、MRS固体培养基（蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，K2HPO4 2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，
MgSO4•7H2O0.58g，MnSO4•4H2O0.25g，（琼脂15～20g），蒸馏水1000mL）卢戈氏碘液（碘 5g 碘化钾 10g 蒸馏水加至100ml）
需要的仪器：恒温箱
（4）明胶液化试验
将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于22℃培养7d，逐日观察结果。
若用35℃孵育，因明胶在此温度下自行液化，故在观察结果前，先置4℃冰箱内30min，再看结果。
结果：培养基呈液化状态为阳性。
需要的试剂：明胶培养基（NaCl5g，蛋白胨10g，牛肉膏3g，明胶120g，蒸馏水1000mL 在水浴锅中将上述成分溶化，不断搅拌。
溶化后调pH 7.2~7.4，
121°C 灭菌30min。
）
需要的仪器：电磁炉恒温箱
（5）乙酰甲基甲醇试验
用接种针将划线平板上培养了24h的各菌株分别穿刺接入5支葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37℃培养58h。
在试管培养液中直接加入10~20滴的40%KOH和5%α-萘酚乙醇溶液，用力振荡。
结果：如果出现红色，则为阳性；若仍呈黄色，则为阴性。
需要的试剂：蛋白胨水培养基（氯化钠0．5克，蛋白胨1克，水加至100ml）40%KOH 5%α-萘酚乙醇溶液）
需要的仪器：电磁炉恒温箱
（6）产气试验
用记号笔在各支试管外壁上分别标明发酵培养基的名称，取乳糖发酵培养基6支，分别接入划线平板上培养了24h的各菌株，第六支不接种，作为对照。
接种后，轻轻摇动试管使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。
将接种过的6支试管均置于37℃培养基中培养24～48h。
观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。
结果：与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性。
表明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示：如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“+”表示。
培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌能产酸并产气，记录用（+）表示：如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用（－）表示。
需要的试剂：乳糖发酵培养基（其中含有哪些成分，需要用到的试剂？）
需要的仪器：杜氏小管恒温箱
（7）碳水化合物发酵试验
用记号笔在各支试管外壁上分别标明发酵培养基的名称，取葡萄糖发酵培养基6支，分别接入划线平板上培养了24h的各菌株，第六支不接种，作为对照。
接种后，轻轻摇动试管使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。
将接种过的6支试管均置于37℃培养基中培养24～48h。
观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。
结果:与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性表明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示：如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该均能分解该种糖产酸，记录用“+”表示。
培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌能产酸并产气，记录用（+）表示：如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用（—）表示。
需要的试剂：葡萄糖发酵培养基（其中含有哪些成分，需要用到的试剂？）
需要的仪器：杜氏小管恒温箱
（8）乳酸定性检测部分
用10%的硫酸1毫升，2%的高锰酸钾1毫升在10毫升发酵液中先将乳酸转化成乙醛，再以硝酸银溶液浸湿滤纸搭于试管口，加热试管中的发酵液，如果发酵液中有乳酸，与硫酸和高锰酸钾反应生成的乙醛在加热时就会挥发，在管口处遇硝酸银就会使试纸变黑。
三、乳酸菌的药敏性实验
利用纸片扩散法对分离自市售泡菜的乳酸菌进行10种左右抗生素包括卡那霉素、链霉素、庆大霉素、万古霉素、环丙沙星、氨苄西林、青霉素、四环素、氯霉素、头孢唑林等的药敏试验。
具体操作方法：
将鉴定出的乳酸菌分别在MRS液体培养基培养24h后，用生理盐水校正菌液浓度至与0.5麦氏比浊管相同。
用移液器吸取稀释好的菌液1ml，注入已灭菌的培养平皿中央位置，然后倾注15ml 40-50℃左右的或MRS固体培养基，充分摇匀。
待培养基凝固后贴上药敏纸片，用无菌镊子压一下纸片使其与培养棊表面贴牢。
每个100mm平板贴3-4张，纸片与其中心距离不得少于30mm，纸片中心与平皿壁间距不得少于15mm，标记抗生素名称。
经37℃培养后，用卡尺从平皿背面测量抑菌圈直径，记录结果。
抑菌环内有任何生长都判断为耐药。
附：麦氏比浊管配制方法:麦氏比浊管是McFarland发明的一种用于微生物比浊的不同浊度的标准浊度管。
具体的配制方法是根据硫酸和氯化钡的比例来定的，有表可查的.这样不同比例生成的硫酸钡沉淀的浓度不同,且都有定值. 做药物敏感实验采用MIC法，所需细菌浓度要稀释成0.5麦氏管，其菌液浓度为1.5×108个/ml。
配法举例：麦氏浊度标准（0.5号）
（1）将0.5mL 0.048mol/L的BaCL2 (1.175%w/v BaCL2·2H2O)加到99.5mL 0.18mol/L （0.36N）的H2SO4(1%v/v)中并不断搅动以维持混悬状态。
（2）按每管4-6mL将硫酸钡悬液分装于带悬盖的管子中，管子尺寸应与培养或稀释接种菌所用的管子一致。
（3）这些管子应密封并贮存于室温避光处。
（4）每次使用前，应将浊度标准管置于旋转混匀器上剧烈振动，目测其外观浊度应均匀一致。
若有大颗粒出现，此标准管应更换。
（5）使用前核实其正确浓度，每个月都应证实或更换。
浊度标准的正确浓度应使用分光光度计测定吸光度核实。
该分光光度计光径为1cm，并配有合适的比色杯。
0.5号麦氏标准管在625nm处的吸光度值应为0.08-0.10。
四、耐药性的判断
在37℃培养16-18小时后，各平扳形成了清晰地抑菌圈，测量其直径，记录数据，然后判断乳酸菌的耐药性。
