流式细胞仪分析技术及应用(1)PPT

波长 • 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 • 透镜组：形成平行光，除去室内光 • 滤片：长通、短通、带通 • 光电倍增管：FS, SS（散射光），
FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
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光学系统示意图
Flow Tip
SS and FL Detector
FS Detector
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液流系统示意图
鞘液
喷嘴
Fluorescence signals
Focused laser beam
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FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
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（2）光学系统
• 激光光源：气冷式氩离子激光器 • 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长
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流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成
细胞功能
大小 粒度 DNA, RNA含量 蛋白质含量 钙离子, PH值, 膜电位
细胞表面/胞浆/核--特异性抗原ห้องสมุดไป่ตู้细胞活性 胞内细胞因子 激素结合位点 酶活性
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一、工作原理
➢采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发 效率； ➢利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检 测的灵敏度和特异性； ➢用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数 信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确 性。
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二、散射光的测定
细胞在液柱中与激光束相交时 向周围360°立体角方向散射的光线 信号，它的强弱与细胞的大小、形 状、胞内颗粒折射等有关，主要分
为前向散射光和侧向散射光。

血小板功能研究
利用流式细胞仪检测血小板表面的活化标志物，可以研究血小板在血 栓形成、止血等过程中的功能变化。
生物学研究
细胞周期分析
流式细胞仪可以通过检测细胞内DNA含量变化，分析细胞的周期 分布，研究细胞增殖和凋亡过程。
细胞表面标志物分析
利用流式细胞仪可以检测细胞表面的各类标志物，研究细胞的分化 、成熟和功能。
将处理好的样品加载到流式细胞仪中，注 意加载量应适中，避免过多或过少影响实 验结果。
实验操作
安全注意事项
根据实验需求设置流式细胞仪的参数，如 荧光染料激发波长、检测灵敏度等，并启 动实验程序进行实验。
在实验过程中，需要注意安全，如佩戴防 护眼镜、避免接触有毒有害试剂等。
数据处理与分析
数据收集
实验结束后，将实验结果数据进 行收集，通常数据包括细胞荧光
在白血病治疗过程中，流式细胞仪 可以检测患者体内微小残留病灶的 数量和变化，帮助评估治疗效果和 预后。
免疫治疗方案指导
白血病的免疫分型结果可以为免疫 治疗方案的选择提供参考，帮助制 定个体化的治疗方案。
淋巴瘤诊断与分型
淋巴瘤细胞表型分析
01
流式细胞仪可以检测淋巴瘤细胞表面的免疫表型标记，帮助诊
断和分型不同类型的淋巴瘤。
流式细胞仪原理及 应用通用课件
目录
• 流式细胞仪概述 • 流式细胞仪在生物医学研究中的应用 • 流式细胞仪在临床医学诊断与治疗中的应
用 • 流式细胞仪实验操作与数据分析
01
流式细胞仪概述
定义与发展历史
定义
流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速 检测细胞特性的技术，可实现对单个细胞的多参数、高通量 分析。

6 在器官移植中的作用
FCM通过检测受者血清中抗供者的抗HLA的抗体，根据 抗体的种型、效价、靶抗原和器官移植的类型不同， 抗体介导的排斥反应也有所不同，FCM比传统方法更 灵敏、操作时间更短并可同时检测细胞亚型、分辨出 IgG和IgM抗体。巨细胞病毒（CMV）能在白细胞内繁 殖并合成CMV特异性蛋白，通过FCM检测CMV特异性抗 原及其抗原分泌量，这种技术用于CMV感染检测时感 染后4h便可检出T淋巴母细胞中CMV-DNA，从而可快速、 准确地反映CMV在移植受者中的早期感染状况，对预 防和减少感染具有重要意义 ［8］ 。以FCM监测肾移 植受体CD8 + 、CD38 + 、T细胞亚群的变化也可监测 CMV感染 ［9］ 。
T淋巴细胞检测
CD8+Ts淋巴细胞检测
B淋巴细胞检测
NK细胞检测
3 白细胞分类分析
利用FCM的体积测定和细胞结构测定来检测 每个白细胞的光散色强度，它与细胞体积、 细胞膜结构、细胞核形状、细胞质性状等 多种因素有关，经过分析可得到中性粒细 胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞 的检测结果。这种方法应用于血细胞计数 速度快、结果准确，大大提高了临床实验 室的工作效率 ［5］ 。
9 在肿瘤诊断中的作用
通过DNA含量分析的细胞周期分布，可反映 肿瘤细胞的增殖状态，对治疗及预后有十 分重要的意义。近年来，流式细胞测量法 DNA分析越来越多地应用于实体瘤患者。 DNA非整倍体的出现率和癌变与不典型增生 程度密切相关。DNA非整倍体可能是癌前病 变发生早期癌变的一个早期指标 ［12］ 。
8 在白血病诊断中的作用
白血病是白细胞在分化到某个阶段受阻后 异常增殖的结果，利用白细胞分化不同阶 段出现的细胞表面标志可以对白血病进行 免疫分型。过去对造血细胞和免疫细胞分 类主要是依据细胞形态学和细胞免疫化学 染色来进行的，现在将多种检测手段相结 合，可为临床诊断、治疗监测和预后提供 更多、更有力的依据。通过FCM检测各种急 性白血病细胞表面抗原的表达，对临床诊 断尤为重要 ［11］ 。

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71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
流式细胞仪分析技术及应用
11、获得的成功越大，就越令人高兴 。野心 是使人 勤奋的 原因， 节制使 人枯萎 。 12、不问收获，只问耕耘。如同种树 ，先有 根茎， 再有枝 叶，尔 后花实 ，好好 劳动， 不要想 太多， 那样只 会使人 胆孝懒 惰，因 为不实 践，甚 至不接 触社会 ，难道 你是野 人。(名 言网) 13、不怕，不悔(虽然只有四个字，但 常看常 新。 14、我在心里默默地为每一个人祝福 。我爱 自己， 我用清 洁与节 制来珍 惜我的 身体， 我用智 慧和知 识充实 我的头 脑。 15、这世上的一切都借希望而完成。 农夫不 会播下 一粒玉 米，如 果他不 曾希望 它长成 种籽； 单身汉 不会娶 妻，如 果他不 曾希望 有小孩 ；商人 或手艺 人不会 工作， 如果他 不曾希 望因此 而有收 益。-- 马钉路 德。

流式细胞术是20世纪70年代发展起来的一种技术，有人将流式细胞仪比喻成高级的荧光显微镜。 HLA-B27: 强直性脊柱炎 细胞功能检测：细胞周期、凋亡
Flow Sorting 直方图适用于：单参数分析
SORTING（细胞分选） CD16+56 NK细胞 可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
巨血小板
• 细胞凋亡与坏死的区别 一般只测一个参数、不能分选
5、DNA含量分析法（晚晚期）
2F时LO必W需C停Y用TO免M疫E抑TR制Y剂。虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但
凋亡检测
每一步都有检测它试剂盒们的过程与表现却有很大差别。
光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握,适合
坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理 流式细胞分析在人类基因组计划中发挥了重要作用，流式细胞技术的应用也适用于植物，目前这个技术应用范围包括流式核型分析，
目前，该技术以广泛用于生物及医 学基础研究与临床检测，在分子生物学、 免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学等领 域内发挥着重要作用。
流式细胞仪
荧光显微镜
Flow Cytometry
控制 一般只测一个参数、不能分选
电脑
人脑
其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。
可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
• 空白对照：ALL 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。
随着白细胞分化抗原意义的确认以及单克隆抗体技术的发展，随着人们创新意识的加强，结合计算机技术和其他技术，流式细胞仪的 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。 坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。

何形成单个细胞流）
免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。
易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性
光束成形器：两十字交叉放置的透镜
前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0. 乙醇或甲醇保存法（2周）
区阈（region, R）与门(gate, G ) 是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。 D3 CD4- /CD3-
• 多参数分析 免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入
二维等高图 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
流式细胞仪常检测的细胞特性 （二）免疫荧光染色的质控
假三维等高图 假三维等高图
由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。 三、免疫胶乳颗粒技术的应用
• 三参数直方图 同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。
同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照，可使荧光标记单抗的信号保持其特异性。 流式细胞仪的基本结构：
• 双参数直方图:点图 光束成形器：两十字交叉放置的透镜
流式细胞仪分析中前向散射光、侧向散射光和荧光的检测意义。 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。

• 荧光染料/荧光化合物 PI、7-AAD等插入核酸链中； CFSE和蛋白质共价结合；
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
ppt课件
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常用荧光素
ppt课件
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常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
ppt课件
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• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
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粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
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• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
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细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
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三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体

CBA反响微球探针复合体构造方式 图
(如可溶性血清蛋白分子的CBA 检测〕
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Thanks for your attention!
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三、流式细胞术运用的新进展
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高速度：分析细胞数：1000个/s→60000个/s 高灵敏度：荧光分子数/细胞：3000→100个FITC； 高准确度：区分两个细胞：参数：相差5% →1%；
高精度：CV值：7% →< 1%; 多参数：荧光：1个 →12个参数； 高纯度：分选细胞：80-90% →99.9%; 其 它：荧光信号：线性检测→对数检测 光谱重叠：补偿修饰剔除联体细胞及碎片
电子程序化单细胞分选仪——Electronically programmable individual cell sorter, EPICS (Coulter公司〕
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BD FACSCalibur型 FCM 〔单L，3F〕
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Coulter EPICS XL/XL-MCL 〔单L，4F〕
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BD FACSVantage SE 〔14F， four-way sorting〕
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1、 Quantitative FCM (QFCM)
定量流式细胞术〔Quantitative FCM, QFCM〕 是用流式细胞仪对特定细胞外表抗原进展绝对 定量。其根本原理是采用某种规范物质获得一 条规范曲线或线性方程，然后获得待测抗原绝 对分子数。
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2、cytometric bead array (CBA)
FCM是诸如生物学、生物技术、计算机科学、流膂力学、激光技术、高等 数学、临床医学、分子生物学、有机化学和生物物理学等到学科知识综 合运用的结晶。
现代流式细胞术，更是由于结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学和定量 荧光细胞化学的运用，使其在生物学、临床医学、药物学等等众多研讨 领域的运用有了更加突飞猛进的开展

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流式细胞仪基本结构 流动室与液流系统
光源与光学系统 信号收集与信号转换系统
计算机与分析系统
分选系统
5
流式细胞仪的液流系统
6
流式细胞仪的光学系统
光电转换器件
流动室
检测点Biblioteka 激光器7流式细胞仪的光信号
1. 散色光信号
前向角散色（Forward Scatter，FSC）
小角散色，与细胞直径成近似直线关系。
荧光染料 激发波长/nm 发射波长/nm
颜色
FITC
488
525
绿色
PE
488
575
橙黄色
PerCP
488
677
深红色
APC
633
660
红色
11
12
四种激光器 355nm 405nm 488nm 633nm
可进行多达10色以 上的多色荧光分析
BD LSR Ⅱ
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流式细胞术的应用
❖ 细胞表面分子 ❖ 细胞内或细胞核内抗原 ❖ 细胞凋亡 ❖ DNA含量检测与细胞周期的分析 ❖ 细胞增殖 ❖ 细胞毒的检测与分析 ❖ 可溶性蛋白分子 ❖ 报告基因 ❖ 其它
流式细胞术基本原理及应用
漆冬梅
1
❖流式细胞仪（flow cytometer）
是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的新型高科技仪器。
大型机、科研型
台式机、临床型
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目前最新型流式仪
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❖流式细胞术（flow cytometry）
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列 细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定性、定量分 析或分选的技术。

抑制免疫反应/杀伤异源细胞
CD3+CD8+CD28CD3+CD4+CD29-
CD3+CD4+CD8+
抑制性T细胞(Ts) 杀伤性T细胞(Tc)
活化的T细胞
抑制细胞和体液免疫 细胞毒性T细胞 在T细胞恶性增生时升高
CD3+CD4-CD8CD4+/CD8+比值 CD45RA+CD45RO-
表达 / T细胞受体(TCR / )
设定阴性、阳性范围
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第二部分
流式细胞术在临床检测和科研中的应用
一、免疫学检测和科研应用
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1、细胞表面分子标记
（以淋巴细胞亚群检测为例）
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原理
人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可 分为三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤 细胞。
T淋巴细胞特异性标志为CD3，包括CD4＋和CD8＋T细胞 两个亚群；
幼稚的/静止的T淋巴细胞
当免疫系统没有能力更新辅助性或抑 制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此 细胞亚群较低
CD45RA-CD45RO+
记忆性T淋巴细胞
病菌感染时升高, 但在慢性病毒感染, 如HIV患者中降低
CD45RA+CD45RO+
活化的T细胞, 感染时升高 感染时升高
CD4+CD25+CD127- 调节性T细胞（Treg-)
T淋巴细胞
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淋巴细胞亚群及功能
T淋巴细胞(CD3+) CD3+CD4+
名称
功能
辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti) 辅助和诱导细胞免疫和体液免疫