斑马鱼整体原位杂交的技术改良

一种快速有效的基因分型斑马鱼的方法为了促进斑马鱼的高通量的基因分型，我们开发了一种新的技术——用高通量熔解分析（HRMA）区分野生、杂合、纯合突变。

这种耗时一个小时的技术不需要进行限制性内切酶酶切和琼脂糖凝胶电泳的操作。

此技术生成的熔解图的敏感性高，可以检测不明确的PCR产物。

我们可以对斑马鱼的三种类型的突变进行可靠的基因分型，包括apc hu745（apc mcr）和p53zy7（p531166T ），小的缺失突变（bap28y75）及逆转录病毒的插入突变（wdr43hi821a）。

这种技术可对单个斑马鱼胚胎及个体进行基因分型并适用于其它类型的生物体。

Developmental Dynamics 238:3168-3174，2009©2009 Wiley-Liss，Inc。

关键词：熔解曲线斑马鱼基因分型 SNP 点突变插入突变简介斑马鱼作为有机体遗传模型正在成熟。

考虑到比较容易维持大量的突变线，且大量的鱼位于每个突变线，大规模的基因分型需要有效的高通量的基因分型技术。

突变的多种类型导致斑马鱼突变，增加了基因分型的复杂性。

ENU诱变剂——诱导斑马鱼突变的主要物质，经常导致单个碱基的突变，小的缺失插入也会发生。

第二种比较普遍的方式是插入诱变，用逆转录病毒插入或转座因子插入破坏基因。

因此，有效的基因分型这些突变类型的方法是必须的。

提供一种更快、有效、令人满意的基因分型方法，有100%的精确度。

寻找高通量的技术/方法，去除掉比较浪费时间的步骤。

随着扩增基因组DNA 的PCR技术的出现，典型的基因分型技术包括Southern印迹法和放射性方法（RFLP和SSCP）已经逐渐被淘汰。

一些基于PCR 的方法用于偶然产生或消除限制性内切点的突变。

大多数方法，除了测序方法之外，需要用PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳。

当数百个或成千上万个样品需要基因分型时，这项工作就变得浪费时间且费用较高。

对于产生或消除一个特殊的限制性位点的突变而言，以PCR为基础的限制性片段长度多态性（RFLP）是一种有用的技术。

斑马鱼两种转基因方法的比较柳晓瑜;王豪博;仇雪梅;于旭蓉;刘洋;王秀利【摘要】对斑马鱼(Danio rerio)的两种转基因方法进行比较,分别采用显微注射和电脉冲导入法将携带有GFP报告基因的表达载体质粒导入斑马鱼受精卵,得出电脉冲最佳导入条件为最适电压125 V/cm,电阻50 Ω,最佳导入时期为1-2细胞期(40-50 min),以及最佳外源基因浓度为300 ng/μL.利用两种方法均得到转GFP基因的斑马鱼,而两种方法对比的结果表明,显微注射法耗时费力,但转基因阳性率高；电脉冲法一次可以处理大批量受精卵,但转基因阳性率远低于显微注射法.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)012【总页数】5页(P205-209)【关键词】斑马鱼;显微注射;电脉冲导入法;转基因效率【作者】柳晓瑜;王豪博;仇雪梅;于旭蓉;刘洋;王秀利【作者单位】大连海洋大学生命科学与技术学院,大连116023;大连海洋大学生命科学与技术学院,大连116023;大连海洋大学生命科学与技术学院,大连116023;大连海洋大学生命科学与技术学院,大连116023;大连海洋大学生命科学与技术学院,大连116023;大连海洋大学生命科学与技术学院,大连116023【正文语种】中文自20世纪80年代首批转基因鱼诞生以来［1］，世界范围内掀起了转基因鱼研究的热潮，很多实验室都进行了一系列的转基因鱼的研究［2］。

目前，已有多种转基因技术应用于转基因鱼的培育和品种改良。

其中显微注射应用的最为广泛，1984年，我国科学家朱作言［1］应用显微注射的方法将人的生长激素基因注射到了鱼的受精卵原核，获得了生长速度快的转基因鱼。

之后显微注射技术被广泛应用，并日益改进和完善。

其次，电脉冲基因导入法和精子介导法在鱼类转基因的研究中也被大量使用。

Aliye等［3］应用电脉冲基因导入法将Cecropins基因导入青鳉受精卵中，得到了少量的转基因个体，但检测结果显示，这些阳性个体的抗菌活性明显高于对照组。

斑马鱼人工繁殖、受精和胚胎发育一、实验目的了解斑马鱼的生活和繁殖习性，掌握斑马鱼人工繁殖技术，了解斑马鱼受精、胚胎发育过程和形态模式形成的特点。

二、斑马鱼的生活和繁殖习性斑马鱼（Danio rerio）为热带鱼类，可在一年内多次产卵。

在合适的养殖条件下，4月龄的斑马鱼即性成熟；性成熟后每1-2周可以产卵一次，一条雌鱼一次可以产出数百颗卵子。

斑马鱼产卵受温度和光照长度的调节。

最适产卵水温为28.5℃，产卵的光调节周期为光照14小时，黑暗10小时。

为防止自然产卵，性成熟的雌、雄斑马鱼必须分开养殖。

斑马鱼具有下列特点：1、繁殖周期短，不受季节限制，容易获得所需要的精子、卵子和胚胎材料。

2、小型鱼类，可在实验室高密度养殖，饲养成本低。

3、是脊椎动物，具有和人类相似的器官和组织。

4、体外受精、体外发育，胚胎培养条件简单。

5、胚胎透明，可以在活体上直接观察器官的发育。

6、发育周期短，在28.5℃温度下培养，受精后24小时即可以形成个体的基本结构。

因此，斑马鱼现在选择作为发育生物学研究的模式动物。

三、实验器材和材料斑马鱼养殖系统，大塑料盆（直径约58cm）两个，塑料筛框（直径约36cm）一个，中号塑料盆（直径约36cm）1个，加热棒，加气泵，12cm培养皿若干，9cm培养皿若干，数个胶头滴管。

曝气水10L。

性成熟雌、雄性斑马鱼。

四、实验内容和程序实验前一天的准备：1、在实验前一天的早上向2个大塑料盆中放大半盆干净的自来水，放入气泵和加热棒，将加热棒温度调整至28℃（每个加热棒都有差异，需要放入温度计，根据温度计指示的实际温度调节和校准温度计），以供斑马鱼催产繁殖时使用。

2、曝气水将干净的自来水烧开后冷却，将气泵放入其中进行曝气，以为培养胚胎之用。

3、斑马鱼的选取和催产雌雄鱼的鉴别：性成熟的雄鱼体型修长，腹部较小，而雌鱼腹部较大。

选鱼的时间在实验前一天的晚上，在选取斑马鱼之前需要喂食红虫，喂食后1小时才开始选鱼。