《基因工程》课程综合实验转基因斑马鱼的构建

《基因工程》实验指导湖南师范大学生命科学学院遗传与发育生物学系2009年5月基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建一、实验目的本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。

在基因工程理论课程的讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的训练和教育，重在素质和能力的培养。

二、实验原理转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。

转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。

转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。

同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。

转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。

三、材料限制性内切酶：Eco R I、Sal I、Age I、Not I、Bam H I；T4 DNA聚合酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连TaKaRa公司产品；3. 2菌株及细胞系DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃；3. 3 质粒与表达载体系统3. 3.1 pEGFP-N1载体pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP的N端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。

含有人类巨细胞病毒（CMV）启图1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的pEGFP-N1质粒动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因，见图1。

转基因斑马鱼胚胎养殖技巧引言：转基因技术是现代生物技术的重要组成部分，通过改变生物体的基因组，使其具有新的特性或功能。

斑马鱼作为一种常见的实验动物模型，被广泛应用于生物学研究中。

本文将介绍转基因斑马鱼胚胎养殖技巧，帮助研究者顺利进行相关实验。

一、斑马鱼胚胎的获取斑马鱼胚胎的获取是进行转基因实验的第一步。

通常情况下，斑马鱼胚胎可以通过自然产卵或人工授精获得。

为了提高产卵的效率，可以将斑马鱼置于特定的环境条件下，如适宜的水温和光照条件。

此外，还可以使用药物刺激促进斑马鱼产卵。

对于人工授精，可以将雄性和雌性斑马鱼分别放入相同的容器中，利用它们的自然产卵和受精过程来获得胚胎。

二、胚胎的培养获得斑马鱼胚胎后，需要进行胚胎的培养。

首先，将胚胎转移到培养皿中，添加适宜的培养液，如E3培养液。

E3培养液中含有必需的营养物质，可以为斑马鱼胚胎提供所需的营养。

同时，保持培养皿中的水温和光照条件也非常重要，通常将其保持在28-30摄氏度，并提供适量的光照。

三、转基因技术的应用在斑马鱼胚胎培养的基础上，可以进行转基因技术的应用。

目前，常用的转基因技术包括转基因敲除和转基因过表达。

转基因敲除是通过将外源基因导入斑马鱼胚胎，使其失去特定基因的功能。

而转基因过表达是将外源基因导入斑马鱼胚胎，使其在特定生理条件下过度表达。

这些转基因技术可以帮助研究者研究特定基因的功能和调控机制。

四、转基因斑马鱼胚胎的鉴定进行转基因实验后，需要对转基因斑马鱼胚胎进行鉴定。

常用的鉴定方法包括PCR、荧光显微镜观察和基因测序等。

PCR是一种常用的分子生物学技术，可以通过检测特定基因的存在来鉴定转基因斑马鱼胚胎。

荧光显微镜观察则是通过检测转基因斑马鱼是否发出特定颜色的荧光来鉴定。

基因测序则可以直接确定转基因斑马鱼胚胎中特定基因的序列，从而进行准确的鉴定。

五、转基因斑马鱼胚胎的进一步研究鉴定转基因斑马鱼胚胎后，可以进行进一步的研究。

例如，可以观察转基因斑马鱼胚胎在不同生理条件下的表型变化。

转基因斑马鱼构建技术
斑马鱼是一种近年来发展非常迅速的模式动物，在生物医学研究领域有越来越多的应用。

斑马鱼和人类的基因同源性85%以上，疾病信号转导通路高度保守，某些疾病相关基因与人类基因保守性高达99%，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，利用高效的ToI2转座酶系统可构建转基因斑马鱼。

斑马鱼作为模式动物，还具有以下的优点：
1、与人类同属于脊椎动物
2、个体较小，因此养殖需要的场地空间较小
3、繁殖力强，可进行高通量筛选
4、体外受精，便于繁育
5、药物用量小
6、早期透明，早期发育迅速，受精后24h主要器官已建成，受精后七天内部器官清晰可见，可以活体进行荧光观察斑马鱼可以用于研究基因表达调控、基因功能域发育、分化、形态发生的关系，也可以用于研究发病机理，也可以用于药物筛选。

[宝典]转基因斑马鱼构建与果蝇幼虫荧光基因的瞬时表达打印版转基因斑马鱼构建与果蝇幼虫荧光基因的瞬时表达蒋驭天(生命科学学院 2008级生物技术 2008300113)同组人:王诗婕吕晓霞刘楚怡一.摘要:本实验对斑马鱼和果蝇幼虫分别导入含EGFP和DFP的质粒，观察其在2中动物体内的表达情况，在斑马鱼体内，绿色荧光蛋白从原肠胚到出苗期均能在荧光显微镜下观察的绿色荧光;在果蝇幼虫体内，才3-4小时时也能观察到红色荧光蛋白基因的瞬时表达。

关键字:转基因斑马鱼果蝇幼虫二.实验器材与试剂:仪器:试管、试管架、可调式微量加样器、电泳仪、电泳槽、染色缸;42?恒温水浴箱、冰浴、恒温振荡箱，超净工作台、手动显微注射器、体式显微镜，硼硅酸玻璃毛细管、倒置显微镜、摄像系统(CCD)、自动水循环系统一套，孵化水槽、培养皿、解剖镜、小规模质粒提取试剂盒。

试剂:EGFP绿色荧光蛋白基因 DFP红色荧光蛋白基因 pEGFP-N2载体 E coli三.实验步骤:转基因斑马鱼构建:1.转染细菌的培养(1)培养基的制备:称取胰蛋白胨3 g，酵母提取物1.5g，NaCl 3g，于一500 mL的三角瓶中，加入蒸馏水至300 mL溶解.若配制固体培养基，则需加入4.5 g 琼脂(1.5%)，然后用NaOH调pH至7.5。

分装于3个250 mL的三角瓶中，加塞，包扎。

(2)培养基的灭菌与消毒: 在灭菌锅中，加入适当的水，放入已包扎好的培养基，盖好盖子，加热。

当压力升至0.05 MPa时，打开放汽阀，排除冷空气，当压力回到0时，关闭放汽阀，当压力升至1.034 MPa时保持15-30分钟后，停止加热，压力降为0时，打开放汽阀排汽取物。

(3)含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60?左右，加入Amp(氨苄青霉素)储存液,使终浓度为50 μg/mL,摇匀后铺板。

(4)接种加甘油保存的分别含质粒的E coli.，每管接种体积为10 微升(5)37 ?摇床过夜培养24h.2.质粒的小量提取提取步骤:(1). 样本处理:收集已培养12,16 小时的菌液13ml，12000rpm 离心1 分钟，尽量吸除上清。

过表达Baff转基因斑马鱼的构建张力;谢英;刘树锋【摘要】Objective To construct pEGFP-Cl-baff, pEGFP-N1 -baff, and pIRES2-EGFP-baff recombinant plasmids, and establish a SLE disease model of Baff overexpressed zebrafish by microinjection and fluorescence screening . The aim is to evaluate the meaning of Baff over expression zebrafish in study of SLE mechanism and drug selection . Methods We cloned baff full length cDNA encoded by 807 bp nuclear acid using spleens RNA of zebrafish by RT-PCR and constructed 3 types of baff overexpression plasmids : pEGFP-Cl -baff, pEGFP-N1-baff- and pIRES2-EGFP-baff. Baff protein expression was estimated by in -vitro cell transfection and Western blotting. Results 3 types of baff overexpression plasmids were examined by agarose gel electrophoresis . Western blotting and in-vitro transfection confirmed the expression of Baff-GFP fusion protein. We also obtained the baff over expression zebrafish by microinjection and fluorescence screening. Conclusion All the plasmid we constructed in our research have been estimated and could be used to generate the disease model of baff overexpression zebrafish which can be manipulated for immune -disease research.%目的体外克隆斑马鱼baff基因并分别构建pEGFP-C1-baff、pEGFP-N1-baff、pIRES2-EGFP-baff重组质粒,通过胚胎显微注射获得过表达baff的转基因斑马鱼,以探讨其作为人类SLE模型和用于SLE药物筛选的意义.方法通过RT-PCR法由斑马鱼脾脏克隆出斑马鱼baff基因全长807 bp蛋白编码区域,分别构建baff过表达载体pEGFP-C1-baff,pEGFP-N1-baff 及 pIRES2-EGFP-baff重组质粒,体外细胞转染并通过免疫印迹法验证蛋白表达后,通过胚胎显微注射过表达载体,GFP荧光跟踪并筛选阳性鱼.结果通过体外细胞转染实验与免疫印迹法验证了pEGFP-C1-baff,pEGFP-N1-baff转染后细胞Baff-GFP融合蛋白的成功表达,通过胚胎显微注射与GFP荧光筛选,成功获得过表达baff的转基因斑马鱼.结论本研究所构建pEGFP-C1-baff、pEGFP-N1-baff、pIRES2-EGFP-baff重组质粒均可通过显微注射获得过表达baff的阳性转基因斑马鱼,为进一步探讨其作为人类SLE疾病模型的意义及Baff拮抗药物的筛选奠定基础.【期刊名称】《中国比较医学杂志》【年(卷),期】2012(022)011【总页数】5页(P46-49,后插4)【关键词】系统性红斑狼疮;B细胞活化因子;斑马鱼;转基因【作者】张力;谢英;刘树锋【作者单位】河北医科大学,河北省实验动物重点实验室,石家庄,050017;河北医科大学,河北省实验动物重点实验室,石家庄,050017;河北医科大学,河北省实验动物重点实验室,石家庄,050017【正文语种】中文【中图分类】R332斑马鱼具有繁殖能力强、体外受精和发育、胚胎透明、性成熟周期短、个体小易养殖，可针对治疗药物进行高通量筛选等诸多特点，使其成为后基因组时代生命科学研究中重要的模式脊椎动物之一［1，2］。

激光生物学报ACTA　LASER　BIOLOGY　SINICA Vol. 30 No. 3 Jun. 2021第30卷第3期2021年6月斑马鱼myo7ab基因敲除品系的构建谢缤灵1，2，邓慧玲1，2，付贵芳1，2，王金福5，谢鼎华4*，谢华平1，2，3*（1. 湖南师范大学动物肠道功能调控湖南省重点实验室，长沙 410081；2. 湖南师范大学动物营养与人体健康实验室，长沙 410081；3. 湖南师范大学淡水鱼类发育生物学国家重点实验室，长沙 410081；4. 中南大学湘雅二医院耳鼻咽喉科，长沙 410011；5. 浙江大学生命科学学院细胞与发育生物学研究所，杭州 310058）摘　要：MYO7A是人类Usher综合征（US）的致病基因。

由MYO7A突变导致的Usher综合征病例占Usher综合征1型病例的29%～55%。

研究发现人类MYO7A突变能够导致Usher综合征1B型（USH1B），包括感觉神经性听力损伤及年龄依赖性视网膜色素变性（RP），但其分子机制尚不清楚。

为了研究该基因在内耳及视网膜发育中的具体分子作用机制，利用Cloning free CRISPR/Cas9基因编辑技术构建斑马鱼myo7ab基因敲除品系。

首先，通过分析软件筛选出该基因的敲除位点，利用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增该基因的向导DNA（gDNA），再以gDNA为模板转录得到向导RNA（gRNA），将gRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼1细胞期胚胎中；随后，进行基因编辑的有效性检测。

研究结果表明，CRISPR/Cas9系统对该基因的敲除有效。

对其进行进一步筛选，成功获得斑马鱼myo7ab 基因敲除突变品系，这为研究该基因在内耳及视网膜发育过程中的作用奠定了基础。

关键词：斑马鱼；CRISPR/Cas9；myo7ab基因；内耳及视网膜发育中图分类号：Q78 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2021.03.004The Establishment of the Zebrafish myo7ab Knockout LinesXIE Binling1, 2, DENG Huiling1, 2, FU Guifang1, 2, WANG Jinfu5, XIE Dinghua4*, XIE Huaping1, 2, 3*(1. Hunan Provincial Key Laboratory of Animal Intestinal Function and Regulation, Hunan Normal University, Changsha410081, China; 2. Animal Nutrition and Human Health Laboratory, Hunan Normal University, Changsha 410081, China;3. State Key Laboratory of Developmental Biology of Freshwater Fish, Hunan Normal University, Changsha 410081, China;4. Otorhinolaryngology of Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410011, China;5. Institute of Cell and Development Biology, College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China) Abstract:MYO7A is the causative gene of human Usher syndrome (US). Usher syndrome cases caused by MYO7A muta-tion account for 29% to 55% of Usher syndrome type 1 cases. It has been reported that MYO7A mutations can cause Usher syn-drome type 1B (USH1B), including sensorineural hearing impairment and age-dependent retinitis pigmentosa (RP), whereas the molecular mechanism is still unclear. In order to elucidate the molecular mechanism of this gene in inner ear and retina devel-opment, we used cloning free CRISPR/Cas9 gene editing technology to establish the zebrafish myo7ab knockout lines. Firstly, two knockout sites of the gene were screened by bioinformatics analysis. Next, the template guide DNA of this gene were ampli-fied by polymerase chain reaction (PCR). Then, the template guide DNA were transcribed into the guide RNA. Finally, the guide收稿日期：2020-12-30；修回日期：2021-03-09。

转基因系构建斑马鱼胰岛β-细胞发育模型夏铭;潘雪;王和生;邓敏;金怡;陈漪;李敏燕;孔德明【期刊名称】《贵阳中医学院学报》【年(卷),期】2009(031)005【摘要】目的:斑马鱼的发育周期短和胚胎透明等特点使其已经迅速成为研究脊椎动物器官发育和人类痰病的模式生物之一.为研究斑马鱼的胰岛β细胞的发育,构建了胰岛素生殖系转基因斑马鱼系.方法:构建了斑马鱼胰岛素(insulin,INS)启动子与增强型绿色荧光蛋白(eGFP)组成的表达栽体,命名为INS:eGFP.通过显微注射的方法将INS:eGFP注射到斑马鱼1-细胞期内的细胞质中,荧光筛选获得生殖系胰岛素转基因斑马鱼,并稳定表达传代.结果:建立生殖系胰岛素转基因斑马鱼,活体动态研究胰岛β细胞发育,原位杂交证实eGFP对胰岛β细胞可靠的示踪性.结论:通过胰岛素转基因斑马鱼的构建.可以直观判断胰岛的发育情况,为研究胰岛的损伤和修复提供了一个简便和直观的新型工具.【总页数】5页(P18-22)【作者】夏铭;潘雪;王和生;邓敏;金怡;陈漪;李敏燕;孔德明【作者单位】贵阳中医学院,贵州贵阳,550001;贵阳中医学院,贵州贵阳,550001;贵阳中医学院,贵州贵阳,550001;上海健康科学研究所;上海瑞金医院血液学研究所,上海,200025;上海瑞金医院血液学研究所,上海,200025;贵阳中医学院,贵州贵阳,550001;贵阳中医学院,贵州贵阳,550001【正文语种】中文【中图分类】R965.8;Q578【相关文献】1.新型的动物模型-可示踪胰岛β细胞发育的转基因斑马鱼 [J], 夏铭;潘雪;邓敏;金怡;陈漪;王和生;孔德明2.构建甲硝唑诱导转基因斑马鱼胰岛β细胞的破坏模型 [J], 孔德明;秦帅;李珊珊3.转基因斑马鱼分析胰岛β-细胞发育情况 [J], 夏铭;潘雪;李敏燕;邓敏;张勇;金怡;陈漪;王和生;孔德明4.斑马鱼胰岛α细胞细胞核特异表达mCherry转基因模型的构建 [J], 林春雨; 郏建新; 康琪; 吴志强; 李明玉5.斑马鱼胰岛α细胞细胞核特异表达mCherry转基因模型的构建 [J], 林春雨;郏建新;康琪;吴志强;李明玉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

基因工程课程综合实验转基因斑马鱼的构建基因工程是一项对生物的基因进行精确调整的技术。

通过使用基因工程技术，人们可以设计出更加优良的生命体，并为生命体的研究提供更加有力的工具。

此前，学生们在课堂上只是通过书本等介质来学习基因工程的相关知识，而课程实验则更多的停留在理论层面，无法给学生们带来更加深刻的印象。

针对以上问题，一些高校开设了基因工程课程综合实验。

通过此课程，学生们可以在实验室中亲手操作各种基因工程实验，并更好的掌握相关的基因工程实验技术。

本文以某高校为例，介绍一项基因工程课程综合实验——转基因斑马鱼的构建，并从实验的背景、实验步骤和实验意义三个方面来进行详细剖析。

一、实验背景斑马鱼是一种热带淡水鱼，其生长发育周期短，幼鱼透明，移植简便等优点使它成为了许多生物学门类研究的模型生物。

斑马鱼表层神经细胞活动强烈，非常适合用来研究感知、运动和认知的神经环路。

因此，斑马鱼成为神经科学研究、药物筛选、疾病诊断等领域的重要模型生物。

转基因斑马鱼的构建是一项基因工程研究中的重要课题。

通过向斑马鱼中植入人类基因或与斑马鱼有关的基因，可以使得斑马鱼显示出人类疾病的症状，从而更好的研究这些疾病的发生和发展机制。

例如，植入人类神经退行性疾病相关基因的斑马鱼，可以展现出某些神经退行症的症状，可以更好地研究这些疾病的病理涅槃。

二、实验步骤1、设计转基因构和转基因斑马鱼的构建需要进行基因克隆，制备转基因构建质粒。

课程设计中的实验制备的是pPtre-3xFlag-Nf1（Nf1:神经母细胞瘤），这是一种携带3xFlag标签的神经母细胞瘤基因，可用于斑马鱼的转基因实验。

2、制备大量转基因质粒使用大肠杆菌进行转基因质粒大量制备，获得足够多的质粒进行后续操作。

Ptre-3xFlag-Nf1质粒用水切割得到15Kb和6.3Kb的两个DNA段，经过凝胶电泳后得到目标DNA。

3、定量测序分析对转基因质粒进行定量测序分析，保证重要区域为正确序列。

Construction of Red Fluorescence Protein Transgenic Zebrafish JIAN Qing, BAI Jun-jie, YE Xing, XIA Shi-ling, LAO Hai-hua, LUO Jian-ren（Key Laboratory of Tropical & Subtropical Fish Breeding & Cultivation, CAFS. Pearl River Fishery Research Institute,CAFS. Guangzhou 510380,China）Abstract The cloned myosin light chain 2 promoter was modified by PCR method and was inserted into the vector(pDSRed2) to construct the red fluorescence protein expression vector. The linlinearized expression vector was delivered into one or two cells stage embryo zebrafish by micro-injection. Under fluorescence microscope, red fluorescence had been observed in muscle tissue as early as embryo blood-circling stage, and red fluorescence intends to increase with the growth of the fish. After hatching, almost all the trunk of the red fluorescence transgenic zebrafish was covered with red fluorescence. Keywords: Danio rerio, red fluorescence protein, transgenic, myosin, promoter转红色荧光蛋白基因斑马鱼的构建简清*, 白俊杰, 叶星, 夏仕玲, 劳海华, 罗建仁（中国水产科学研究院珠江水产研究所，中国水产科学研究院热带亚热带鱼类选育与养殖重点开放实验室，广东广州510380）摘要: 采用PCR方法，改造肌球蛋白轻链2启动子，使其适合定向插入红色荧光蛋白载体的多克隆位点，构建成肌肉特异性表达的红色荧光载体。

转基因动物（transgenic animal）是指基因组中整合有外源基因的一类动物，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。

嵌合体动物（chimera mosaic animal）是只有部分组织细胞的基因组中整合有外源基因的动物，称为嵌合体动物（chimera mosaic animal）。

这类动物只有当外源基因整合入的“部分组织细胞”恰为生殖细胞时，才能将其携带的外源基因遗传给子代，一般用胚胎干细胞法或逆转录病毒载体法制备的第一代转基因动物均为嵌合体动物，而显微注射法得到的第一代转基因动物中，也有20％为嵌合体动物。

转基因动物是指动物所有细胞均整合有外源基因，则具有将外源基因遗传给子代的能力，通常被称为转基因动物。

转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，而且随着转基因动物技术的发展，转基因产品将会广泛渗透到医疗、卫生、农产品和食品中。

转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。

转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。

同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。

转基因技术涉及外源基因的组建、载体、受体、基因导入技术、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等方面的内容。

鱼类是脊椎动物中最丰富多样性的类群，估计达30000 种。

这种多样性反映在诸如形态、行为、生殖、发育、世代时间和对环境的耐受等各种特征的广泛差异，从而使各种转基因鱼模型的常规制作既是挑战，又是机遇。

有的鱼类的卵是透明的，能直接对发育进行监察，有的情况下对活体内报告基因的表达进行判断。

有些鱼的种类还可能进行其他的遗传操作来诱导单倍体、三倍体和纯合子产雌品系。

尽管鱼的种类很多，但作研究用的却要少的多。

因为野生种群的持续减少，为帮助满足高质量蛋白质需要，水产养殖较常用鱼是鲶鱼、虹鳟鱼、罗非鱼、大西洋鲑和鲤鱼。

基因工程综合实验---转基因斑马鱼的构建一、实验目的本实验的教学目的是通过构建转基因斑马鱼的表达载体、利用显微注射法制备转基因斑马鱼及转基因个体的鉴定等实验让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，熟悉转基因动物的制备过程，培养学生利用基因工程的原理和技术进行生命科学基础理论和应用研究的基本思路和实验设计能力。

二、实验原理转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力。

转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学的基本问题提供了一个更有效的工具，成为探讨基因功能及其调控机理、致癌等疾病基因的作用机理与调控机制不可或缺的研究手段，转基因技术也是生物学领域最具应用价值的实用技术，已经渗透到医学、畜牧学、农业生产及工业生产等各个方面，同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。

转基因动物的制备涉及外源目的基因的获取、重组表达载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、外源目的基因导入、转基因个体的检测等方面的内容。

本次实验动物选取斑马鱼作为实验材料。

斑马鱼(Danio rerio)是属于辐鳍亚纲(Actinopterygii)鲤科(Cyprinidae) 短担尼鱼属(Danio)的一种硬骨鱼，产于印度东部、巴基斯坦、缅甸以及孟加拉国的小溪、稻田及恒河中游地区，是一种常见的热带观赏鱼，因其斑马鱼饲养所需空小、成本体侧具有像斑马一样纵向的暗蓝与银色相间的条纹而得名。

間低，且斑马鱼生活史短，2-3 个月即性成熟，生活周期容易控制，每次可产卵100-200颗，胚胎透明且大，容易操作和观察，所以用斑马鱼制备转基因动物具有明显的优势。

三、实验内容与学时分配序号实验内容与名称实验类型与性质学时分配每组人数1 转基因质粒的转化专业技术实验 3 42 转基因质粒的大量提取专业技术实验3 43 重组表达质粒的酶切检测专业技术实验 3 4专业技术应用 3 44 受体系统鱼受精卵的获得及培养专业技术应用 6 45 用显微注射法制备转基因斑马鱼6 转基因斑马鱼的表型鉴定专业技术应用 3 4四、材料、试剂与设备4.1 菌株及斑马鱼DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃。

转基因斑马鱼胚胎养殖技巧引言：转基因技术是一种重要的生物技术手段，通过改变生物体的基因组，可以为人类提供很多益处。

斑马鱼作为一种常用的实验动物模型，其胚胎养殖技巧对于转基因研究具有重要意义。

本文将介绍转基因斑马鱼胚胎养殖的技巧，包括胚胎收集、胚胎培养和胚胎转染等方面。

一、胚胎收集在进行转基因斑马鱼胚胎养殖之前，首先需要从成年斑马鱼体内收集受精卵和早期胚胎。

收集受精卵的方法可以通过自然产卵或人工授精来实现。

自然产卵时，将雌雄斑马鱼放入产卵器中，提供适宜的环境条件，如温度和水质等，等待斑马鱼自行产卵。

人工授精时，将雄性斑马鱼和雌性斑马鱼分别收集到不同的容器中，然后用玻璃棒轻轻按压雄性斑马鱼的腹部，使其释放精子，再将精子加入雌性斑马鱼容器中进行授精。

收集到的受精卵可以放置在含有适宜培养液的培养皿中，继续进行后续的胚胎培养。

二、胚胎培养胚胎培养是转基因斑马鱼胚胎养殖的重要环节。

在胚胎培养过程中，需要控制适宜的温度、光照和培养液等因素，以促进斑马鱼胚胎的正常发育。

通常情况下，将受精卵或早期胚胎转移到含有适宜培养液的培养皿中，然后放置在恒温箱中进行孵化。

在孵化过程中，可以根据需要，调整温度和光照条件，以模拟自然环境。

此外，还可以添加适量的抗生素和抗菌剂，以防止细菌和真菌的污染。

胚胎培养的时间可以根据实验需要进行调整，通常为24小时至72小时不等。

三、胚胎转染胚胎转染是转基因斑马鱼胚胎养殖的关键步骤，通过该步骤可以将外源基因导入斑马鱼胚胎中，实现基因的转移和表达。

常用的转染方法包括注射法和电穿孔法。

注射法是将含有目标基因的DNA溶液注射到斑马鱼胚胎的细胞中，通常选取胚胎早期发育阶段进行注射，以确保外源基因的有效转染。

电穿孔法是通过应用电脉冲来增加细胞膜的通透性，使得外源基因能够更容易地进入斑马鱼胚胎细胞中。

无论采用哪种方法，转染后的斑马鱼胚胎需要经过进一步培养和筛选，才能确定是否成功转染和表达。

结论：转基因斑马鱼胚胎养殖技巧是进行转基因研究的重要环节。

基因敲除斑马鱼构建方法!一、基因敲除的设计方案1.1 基因的基本信息确认斑马鱼基因的基本信息，包括名称ID号等，一般会在NCBI 等查询。

1.2 分析基因结构、氨基酸序列等做生物学信息的分析1.3分析蛋白质的保守结构功能域通过综合考虑，设计最佳的KO靶点。

1.4 分析并设计CRISPR，分析其效率及脱靶的情况一般使用CCTOP，少数物种如没有可找其它专业网站。

二、CRISPR活性验证2.1 分析并确认基因组序列设计Genotyping引物，确认实际基因组序列与理论匹配情况，如CRISPR靶点验证与理论序列存在出入，需回到1.4重做。

该步骤还需要确认引物扩增条件，以备后用，如不能正常扩增需要重新设计，并且不能进行下一步操作。

2.2 合成sgRNA使用Thermo转录试剂盒转录，完成后需测定浓度（不得低于400 ng/μl）和OD值（260/280需在1.8~2.2）。

2.3 显微注射将上述合成好的sgRNA按照一定的比例与Cas9蛋白预混，使用显微注射技术将其注入斑马鱼早起胚胎中。

2.4 活性验证随机选取8~24 hpf的8枚注射后的胚胎通过PCR后将其产物送商业公司sanger测序，需要看到至少有一组在靶向位置存在Indel突变。

•如有，挑取存在Indel突变的亚克隆确认；•如没有，回到2.3或2.2或1.4（具体回到哪一步需要根据实际情况决定）三、突变体制备及确认3.1 F0饲养如2.4验证有活性，一般需要显微注射400~500枚胚胎作为F0（一般由胚胎发育至成体有10~20%），至少需要40尾以上的F0。

3.2 F0可遗传突变的确认将上述F0亲本与野生型杂交（或者自交），将所产胚胎随机选取8枚经测序确认，如存在Indel突变，则该F0亲本即为可遗传突变体。

以此方法至少鉴定出3尾可遗传的F0。

3.3 F1饲养将3.2至少3尾亲本经交配，每组一般15~25尾，一般总量需到达40~50尾。

3.4 F1确认将3.3的F1饲养至2~2.5月龄,获得其尾鳍基因组，通过PCR后测序确认其具体基因型（要求必须是移码突变或出现提前终止密码子的突变）。