年月日姓名：专业年级：同组者
科目：发育生物学实验题目：斑马鱼性腺促熟及早期发育模式
一【目的要求】
1、通过实验操作掌握斑马鱼性腺促熟和产卵调控技术
2、通过斑马鱼早期发育的观察，巩固对硬骨鱼胚胎发生的认识
二【实验材料】
（一）器材
培养缸、控温棒、解剖镜、显微镜
(二)试剂
经太阳晒过至少一天的自来水
（三）动物
斑马鱼（Danio sp.）
三【实验内容】
（一）亲鱼培育和性腺促熟
挑选体长大于4厘米的斑马鱼放养于鱼缸中，水温保持在28℃左右，放养数量根据鱼缸中水体体积而定，密度5尾\L左右。
饲喂亲鱼用的饲料有活性饲料和配合饲料两种，直接购自于观赏鱼市场，要求每天投喂4次，及时清除残饵，隔天换水，快到繁殖季节时将雌雄分养，加强管理。
（三）繁殖
繁殖前一天中午，将雌雄合养于繁殖缸里，要求雌雄比例为2:1。
由于斑马鱼有食卵的习性，为防止亲鱼吞噬鱼卵，可用网孔为2-3毫米的网将亲鱼限制在繁殖缸的上半部活动，以防止亲鱼吞吃鱼卵。
一般次日凌晨到中午可以产卵和受精，受精卵便沉降于缸底，将繁殖后的亲鱼及时转移至别的培养缸中，吸取缸底受精卵，剔除异物以及眼观有白色小斑点、畸形异常卵。
（三）斑马鱼胚胎发育模式
孵化期间，培养用水温度控制在25-28℃，每天要及时清除败育卵，并换水1-2次。
按时观察记录斑马鱼胚胎的早期发育过程，绘制斑马鱼的胚胎发育模式图。
1、受精卵：斑马鱼的卵呈圆球形，橙黄色、微透明，直径0.8-0.9 mm。
在水中，受精卵卵膜(壳膜)迅速膨胀，出现透明的卵周隙，在壳膜上可以看到呈漏斗状的卵膜孔。
2、卵裂：卵子受精后，细胞质迅速向动物极流动，并集中形成帽状的胚盘。
卵裂即在胚盘范围内进行，卵裂属于不全裂，盘状卵裂。
第一次分裂为经裂，分裂沟自上而下，但不到达底部，结果分为两个相等的不完整分裂球。
第二次分裂仍为经裂，分裂面与第一次垂直，仍是不完全分裂，于是分成大小相似的四个分裂球。
第三次分裂亦为经裂，两个分裂面在第一次分裂面两侧，并与第一次分裂面平行，形成两排，每排四个，共八个分裂球。
第四次分裂仍为经裂，两个分裂面在第二次分裂面的两侧，并与第二次分裂面平行，分裂为四排每排有四个分裂球，共形成十六个分裂球。
第五次分裂，有经裂也有纬裂，分裂面己不整齐，分裂球大小也不一致。
以后几次分裂，分裂球愈分愈小。
3、囊胚期：由于细胞不断分裂，数目增多，细胞体积逐渐变小，分裂球层次增加，同时在胚盘与卵黄之间产生一空腔，即为胚盘下腔，此时称囊胚期，又分为囊胚早期、中期和晚期，也称高囊胚、中囊胚和低囊胚。
4、原肠胚期：囊胚晚期后，细胞逐渐向植物半球下包，胚盘变扁，开始进入原肠期。
当胚盘下包到卵黄的一半时，胚环最大，背唇呈新月状，此即胚盾开始，即原肠早期。
胚盘继续下包到胚胎的三分之二时，由于细胞不断集中于胚环的一处，致使该处呈一盾状隆起即
胚盾，此时称原肠中期。
胚盘继续下包到整个胚胎的四分之三时，胚盾更为明显，胚体将在胚盾处建成，此时为原肠晚期。
5、观察由神经胚直至出膜期的形态变化：当胚盘下包到整个胚胎的五分之四时，神经板已经形成，胚体已转为侧卧，此时为神经胚期。
随着胚盘下包，胚孔逐渐变小，直到胚孔关闭，前端膨大成脑。
胚体中部有1-2对体节出现，即为胚孔封闭期。
胚体的头部越来越明显，前脑两侧膨大成视泡，脑己分化。
尾端粗钝，胚体中部出现3-5对体节，此为视泡期。
后脑两侧有椭圆型淡色结构，即是听板。
此时已有15-16对体节，称为听板形成期。
在前脑的前方，可见一对嗅窝，胚体此时出现17-19对体节，即为嗅窝形成期。
视杯中晶体开始形成，胚体有20-21对体节，并开始收缩，此即晶体形成期，在头部和卵黄囊之间，可见到管状的心脏开始搏动，并可见血细胞在血管内流动，此时为心跳期，已有25对体节。
在头部后端，背面两侧可见耳囊已呈小泡状，并可见耳囊中有一对暗色的耳石，视杯中出现色素，此时有26-27对体节出现。
心跳期后，尾略向背方举起，胚胎在膜内转动，尾部不断摆动，经一定时间，胚体破膜而出，即为孵化期。
、
四【作业】
1、电子版上交斑马鱼各主要发育阶段的照片。
高囊胚时期中囊胚
低囊胚50%下包
80%下包尾芽期
10—12体节心跳期
刚孵化斑马鱼
五【思考题】
1、鱼类生殖调控的机制。
答：鱼类能够按照环境条件的周期性综合调整它们的生理机能。
包括下丘脑-垂体-性腺中各种激素的分泌活动在鱼类生殖发育和调控的过程中发挥着关键作用。
鱼类的下丘脑能分泌促性腺激素释放激素（GnRH），刺激腺垂体分泌促性腺激素（GtH），从而促进性腺的发育。
而下丘脑视前隐窝区的前腹视前围脑室核（（NPP），多为多巴胺——抑制腺垂体分泌GtH。
在性腺发育的整个时期，GtH分泌活动都受到促性腺激素释放抑制因素（GRIF）的紧张性抑制。
排卵前，下丘脑会减少GRIF的分泌，由此带来两个效果：①GtH自动分泌增加；②GnRH促进GtH分泌作用更加显现。
在排卵前，会引起鱼血液中GtH 急剧升高。
同时性类固醇性激素对GtH分泌也有反馈作用。
在鱼类性腺发育期间，一般对GtH分泌有负反馈作用，在产卵期间尤为明显。
2、鱼类常见的性腺促熟和人工繁殖技术。
答：1)促使亲鱼成熟、产卵的方法，一般可分为生态法、生理法和生态生理结合法。
生态法是在鱼类繁殖的适温季节里，选择成熟的亲鱼进行雌雄配对，满足其产卵的生态条件，使亲鱼自行繁殖或进行人工采卵和受精。
此法适用于鲤、鲫、非鲫和虹鳟等。
生理法是在繁殖季节对某些无法满足其成熟产卵生态条件、而性腺发育良好的亲鱼注射催情剂，促其性成熟、产卵和排精，适用于草鱼、青鱼、鲢、鳙等养殖鱼类、印度鲤科鱼类、闪光鲟和鮻等。
生理生态法是将上述两法结合运用，既注射催情剂又提供合适的生态条件。
2)鱼类人工繁殖指的是：根据鱼类自然繁殖习性，在人为条件下控制鱼类发育、成熟、产卵和孵化的技术措施。
人工繁殖方法，按亲鱼来源于天然水域或人工培育，可分为半人工繁殖和全人工繁殖。
一般采用人工繁殖生理生态法，整个过程分亲鱼培育、催情、授精和孵化4个环节。
①亲鱼培育。
是将达到性成熟年龄的亲鱼培育至性腺发育成熟的过程。
在进行人工繁殖前约1个月，应适当减少投饵和施肥量，并每日冲注新水4～6次，促其性腺进一步发育。
性腺发育良好的雌鱼在外形上腹部膨大、下腹松软、泄殖孔红润，可选作催情用鱼；雄鱼当轻压下腹部时有入水即散开的乳白色精液流出，方可选用。
②催情。
对卵巢出现上述性状的亲鱼，须注射催情剂促其发情、产卵。
③授精。
有自然授精和人工授精两种。
自然授精是催情后的亲鱼在产卵池中自行产卵、排精、完成受精作用。
随后，待卵子吸水膨大、卵膜增厚时，开始收集受精卵，或使受精卵从产卵池自动流入孵化环道。
人工授精是在亲鱼发情高潮将要产卵时，进行采卵、采精，使成熟的精、卵在盛器内完成授精作用。
由于卵和精子在淡水中存活的时间很短，因此，人工授精应迅速进行。
④孵化。
将受精卵置于孵化环道、孵化桶等工具中进行。
在孵化环道和孵化桶内都应
形成循环不息的微流水，具有溶氧量高、容卵量大、孵化率高、劳动强度低和管理方便等优点。
不同鱼类的孵化时间和要求的水温不一。
草鱼、青鱼、鲢、鳙等孵化适温是22～28℃，时间为18～25小时。
虹鳟的孵化适温为6～13℃，时间为25～60天。
