IgH基因克隆重排在B细胞非霍奇金淋巴瘤中的的诊断价值

2022套细胞淋巴瘤诊断与治疗中国指南（完整版）套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma, MCL）是一种起源于成熟B 细胞的非霍奇金淋巴瘤亚类，占非霍奇金淋巴瘤（NHL）的6%~8%。

自《套细胞淋巴瘤诊断与治疗中国专家共识（2016年版）》发布以来，极大地促进了我国医务工作者对该病的认识，并规范了临床诊疗。

近年来，MCL的基础转化研究与临床治疗均取得重大进展。

为进一步提高我国医药工作者对该病的认识，推广规范诊疗，中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会、中华医学会血液学分会与中国临床肿瘤学会淋巴瘤专家委员会共同组织国内相关专家经过多次讨论，制订本版指南。

一、定义MCL是一种具有特定免疫表型和重现性遗传学异常的小至中等大小、单形性成熟B细胞肿瘤，通常表达CD5和SOX11，95%以上患者伴有CCND1基因重排并导致Cyclin D1蛋白细胞核内高表达；患者以老年男性为主，常侵犯结外部位，兼具侵袭性淋巴瘤疾病进展迅速和惰性淋巴瘤不可治愈的特点。

二、诊断、鉴别诊断、分期和预后（一）诊断1．临床特点：中位发病年龄约60岁，男女比例为2~4∶1。

诊断时80%以上患者处于疾病晚期（Ann Arbor Ⅲ~Ⅳ期），表现为淋巴结肿大、脾肿大及骨髓或外周血受累，其他常见的结外受累部位为胃肠道和韦氏环。

2．组织形态学特点：MCL多呈弥漫性、结节状或套区型生长。

典型的MCL常由形态单一、小到中等大小淋巴细胞构成，核轻度不规则，染色质浓聚、核仁不明显，细胞质较少。

部分病例可出现单核样B细胞或浆细胞性分化。

病灶微环境中多有滤泡树突细胞增生及T细胞浸润，玻璃样变性小血管增生和上皮样组织细胞增生也很常见。

不同病例的核分裂数差异较大。

10%~15%的MCL细胞形态呈"侵袭性变型"，侵袭性变型又可分为母细胞变型和多形性变型，瘤细胞体积大，且通常具有较高的增殖活性。

这些患者临床侵袭性较高，预后差。

3．免疫表型特点：肿瘤细胞应为单克隆性成熟B淋巴细胞，典型的免疫表型为CD5、CD19、CD20阳性，CD23和CD200阴性或弱阳性，BCL2、CD43常阳性，强表达sIgM或IgD，CD10和BCL6偶有阳性。

弥漫性大B细胞淋巴瘤bcl蒋会勇，陈愉，张三泉，朱梅刚，赵彤【关键词】弥漫Correlation between bcl2/IgH gene rearrangement and GCB molecular subtype in diffuse large Bcell lymphoma【Abstract】AIM: To explore the correlation between bcl2/IgH gene rearrangement and germinal center Bcelllike (GCB) molecular subtype in diffuse large Bcell lymphoma (DLBCL). METHODS: Selfdesigned heminested PCR was used to detect bcl2/IgH gene rearrangement in 60 cases of DLBCL. Positive PCR products were cloned and sequenced. The tissue microarray of 60 specimens of DLBCL was prepared and the expressions of CD20, CD10, Bcl6 and MUM1 were investigated by immunohistochemical SP method. GCB and nongerminal center Bcelllike (nonGCB) were subclassified. RESULTS: Six of the 60 DLBCL were bcl2/IgH positive by conventional PCR method. Selfdesigned heminested PCR was used to amplify 6 positive cases again and bcl2/IgH gene was verified rearrangement in 5 cases by cloning and sequencing and 1 had the gene segment of BAC331191 of human chromosome 19. CD20 waspositive in the 60 DLBCL cases. Positive expression rates of CD10, Bcl6 and MUM1 were %, % and % respectively. 32 %) were GCB and 28 %) were nonGCB. Bcl2/IgH gene rearrangementpositive cases were all GCB subtypes, which were significantly correlated with the expression of CD10 (P= and not with Bcl6 and MUM1. CONCLUSION: Selfdesigned heminested PCR can improve the detection accuracy of bcl2/IgH gene rearrangement. Bcl2/IgH gene rearrangement detection helps the DLBCL determination of GCB subtypes.【Keywords】 lymphoma, Bcell, diffuse large；bcl2; gene rearrangement【摘要】目的: 探讨弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）bcl2/IgH 基因重排与分子亚型生发中心样（GCB）的相关性. 方式:采纳自行设计的半巢式PCR对60例DLBCL的bcl2/IgH基因重排进行了检测，并对阳性产物进行克隆、测序. 同时采纳免疫组化SP法在组织微阵列上同步观测CD20，CD10，Bcl6，黑色素瘤相关抗原（突变体）1 (MUM1)的表达,进行GCB和非生发中心样(nonGCB)分子分类. 结果: 常常规法扩增bcl2/IgH，有6/60例DLBCL bcl2/IgH阳性；在6例阳性样本中,采纳本组设计的半巢式PCR扩增，经克隆及测序证明5例bcl2/IgH 基因重排阳性，1例为人类第19号染色体BAC 331191基因的片段. 60例DLBCL CD20表达全数阳性；CD10，Bcl6， MUM1的阳性表达率别离为%，%，%；GCB 32（%）例，nonGCB 28（%）例. bcl2/IgH基因重排阳性的病例均属GCB分子亚型, 且与CD10表达有显著性相关（P=），而与Bcl6及MUM1表达无相关性. 结论:利用本组设计的半巢式PCR 可提高bcl2/IgH基因重排检测的准确性. bcl2/IgH基因重排的检测可协助确信部份GCB分子亚型的DLBCL.【关键词】弥漫性大B细胞淋巴瘤； bcl2; 基因重排0引言弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large Bcell lymphoma, DLBCL）是最多见、高度恶性的非霍奇金淋巴瘤，但新近cDNA芯片的研究结果显示，该瘤存在生发中心样（germinal center Bcelllike，GCB）和非生发中心样（non germinal center Bcelllike, nonGCB）两种分子亚型，GCB的预后明显好于nonGCB类型［1-2］. Hans等［3］以cDNA 芯片为参照标准，发觉利用“套餐”式免疫标记物CD10，Bcl6，黑色素瘤相关抗原（突变体）1 ［melanoma associated antigen(mutated)1, MUM1］也能够对DLBCL进行分子分类. bcl2/IgH基因重排是人类恶性淋巴瘤最多见的染色体异样，存在bcl2基因重排的病例有较好的生存率. 咱们利用组织微阵列(tissue microarray, TMA)技术对60例DLBCL进行分子分类, 采纳PCR技术检测bcl2/IgH基因重排，探讨bcl2/IgH基因重排与分子亚型的相关性，旨在为临床判定DLBCL的预后提供更多的信息.1材料和方式1．1材料1999/2003年诊断明确资料齐全的DLBCL 60（男29，女31）例，中位年龄（16~91）岁，所有标本均为40 g/L中性甲醛固定, 常规石蜡切片HE染色. 由3名专门从事淋巴瘤研究的医师按新的WHO分类方式进行诊断. SP试剂盒购自北京中山生物技术; CD20购于福州Maxim公司；CD10购于美国Zymed公司；Bcl6购于美国Neomarker 公司； MUM1 mAb由意大利Perugia大学血液病研究所Dr. Falini馈赠.1．2方式1．IgH基因重排的检测DNA提取采纳我室成立的石蜡切片刮片法，每例切片1张，厚 3 μm，常规脱蜡、干燥. 用无菌刀片刮入Eppendorf管，加入50 μL消化液(10 mmol/L , 1 mmol/L EDTA, 200 mL/L Tween 20)，同时加入蛋白酶K（终浓度为200 mg/L），56℃水浴孵育留宿，充分消化后，98℃, 10 min灭活蛋白酶K，12 000 g离心10 min，分装上清液，用分光光度计检测DNA的浓度，将浓度调整至200～400 μg/L，-20℃保留备用.1．2．2半巢式PCR检测bcl2/IgH基因重排bcl2/IgH 基因重排的检测采纳半巢式PCR. 第一次扩增PCR引物为：上游:MBR 5′TTAGAGAGTTGCTTTACGTGGCCTG3′; 下游JH1: 5′ACCTGAGGAGACGGTGACC3′. 该对引物为检测bcl2/IgH 基因重排经常使用引物［4］. 利用专业的引物设计软件Primer premier, 咱们在MBR下游设计了第二重引物: Mbr1 5′CAACACAGACCCACCCAGAG3′与原下游引物JH1组成半巢式PCR反映的第二对引物. 反映体系为:10×PCR 缓冲液2 μL, 25 mmol/L MgCl2 μL, 10 mmol/L dNTP μL,上下游引物各μL,Taq DNA聚合酶μL，模板1 μL(浓度200~500 mg/L),三蒸水μL,总反映体系为20 μL. 半巢式PCR的反映体系为10×PCR缓冲液2 μL, 25 mmol/L MgCl2 μL, 10 mmol/L dNTP μL,上下游引物各1 μL, Taq DNA聚合酶μL，模板1 μL,三蒸水μ℃变性5 min，94℃变性30 s，57℃退火45 s, 72℃延伸45 s, 共35个循环，然后，72℃终末延伸10 min，4℃保留30 min. 半巢式PCR 模板为一步法的产物稀释100倍. 产物以20 g/L琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭（EB）μL染色. 所有PCR操作进程中严格按PCR操作规程进行. 阳性对照采纳经测序证明为基因重排阳性的DNA，阴性对照为双蒸水. PCR阳性产物经TA克隆连于T载体，送上海博亚公司进行测序. 测序采纳3730测序仪，DNA测序技术要紧依据Sanger双脱氧链终止法. 测序结果在基因库中进行比对，以明确是不是为 bcl2/IgH 基因重排片段.制作第一对60例DLBCL蜡块组织的苏木精-伊红染色切片作形态学观看，选择有代表性的肿瘤区域，在相应位置进行标记；然后利用组织微阵列仪（Beecher Instruments, MTA1）制作受体蜡块并打孔，依照原有切片的标记部位，用供体针在蜡块相应部位取样，所用组织芯直径为 mm，将供体组织芯放入受体蜡块. 每例标本在标记区域内随机取2~4条组织芯. 在组织样本填入蜡孔时记录每一个样本在二维阵列中的具体位置，并在必然位置上标记出TMA的方位.免疫组化染色采纳SP法进行免疫组化染色. 以CD20染色来判定每一个组织点的肿瘤细胞数，每例标本以肿瘤细胞数最多的点作分析. 抗体的阳性判定标准为：CD20，CD10阳性定位于细胞膜，Bcl6，MUM1阳性定位于细胞核, >20%的肿瘤细胞染色判为阳性［3］. 采纳CD10， Bcl6和MUM1 3种抗体对DLBCL进行分类［3］. CD10， Bcl6作为生发中心细胞的标志物，CD10+或CD10+/Bcl6+为GCB类；CD10-/Bcl6-为nonGCB类；MUM1作为后生发中心细胞来源的标志物，假设CD10-/Bcl6+，那么用MUM1来分类：MUM1+为nonGCB类，MUM1-为GCB类.统计学处置: 利用SPSS 软件,对数据进行Fisher精准查验. 2结果2．1组织学分型依照WHO新分类方式对DLBCL进行分型，中心母细胞型(centroblastic，CB) 53例%)，免疫母细胞型（immunoblastic，IB）3例%)，间变性大B细胞型（anaplastic，AP) 2例%)，未分型2例%).2．2蛋白表达60例DLBCL患者的组织切片CD20表达全数阳性. CD10， Bcl6， MUM1的阳性表达率别离为%， %， %，其中CD10+ Bcl6+ 14例， CD10+/MUM1+ 13例，Bcl6+/MUM1+ 16例，CD10+/Bcl6+/MUM1+ 8例（图1）. 经统计学分析，年龄性别等因素与CD20, CD10, Bcl6表达无关（表1）.2．3DLBCL TMA分子分类60例DLBCL中， 32例（%）GCB，28例（%）nonGCB. 在32例GCB类中， 26例（%）CD10+，18例（%）Bcl6+，14例（%） CD10+/Bcl6+， 6例%) CD10-/Bcl6+. 在28例nonGCB类中，24例（%）MUM1+，8例（%） MUM1+/Bcl6+.A：细胞膜CD20+ ×100; B：细胞核Bcl6+ ×100; C: 细胞膜CD10+ ×200; D: 细胞核MUM1+ ×100.图1弥漫性大B细胞淋巴瘤免疫组化染色SP2．4基因重排检测因bcl2/IgH基因断裂在不同病例略有不同，因此扩增出的片段为100～300 bp(图2). 经一步法扩增，发觉6例阳性，对阳性样本进行半巢式PCR扩增时发觉5例基因重排阳性，考虑一步法扩增有假阳性，经克隆及测序证明为人类第19号染色体BAC331191基因的片段，其序列为: TTAGAGAGTTGCTTTACGTGGCCTGCCTCTCTCACCTCCCAGGTGAACGGTGTGGACATGAAGCTGCCCGTGGTGCTGGCCAACGGCCAGATCCGTGCCTCCCAGCATGGTTCAGATGTTGTGATTGAGACCGACTTCGGCCTGCGTGTGGCCTACGACCTTGTGTACTATGTGCGGGTCACCGTCTCCTCAGGT, 因此bcl2/IgH基因重排为5例. 基因重排阳性的5例病例均为GCB亚类. CD10阳性及阴性病例bcl2/IgH基因重排的发生率别离为%(5/26)及0%(0/34)，有统计学不同（P=）(表1).表1弥漫性大B细胞淋巴瘤免疫组化与临床资料及bcl2/IgH基因重排关系(略)图2PCR检测bcl2/IgH重排3讨论本组60例DLBCL，CD10的阳性率高于西方Hans等［3］的28%和Colomo等［4］的21%, 可能与本组选用的病例多为CB变型的B细胞淋巴瘤有关. CD10诊断GCB的灵敏性较低，经CD10和Bcl6联合应用，在GCB类中发觉了6例CD10阴性、Bcl6阳性，说明联合应用CD10及Bcl6可提高GCB亚类的检出率. 本组检测MUM1阳性率与文献报导（50%~77%）相近［5-6］. 咱们利用传统引物进行bcl2/IgH基因重排检测发觉的阳性样本，采纳本组设计的半巢式PCR扩增及克隆、测序证明有1例为人类第19号染色体BAC 331191基因的片段，该片段的上下游别离有9个碱基能与传统引物互补配对，因此进行PCR时可能将其扩增出来，而非真正的基因重排. 这可能是传统引物检测重排发生假阳性的分子生物学基础. 结果显示采纳咱们所设计的半巢式PCR 引物检测bcl2/IgH基因重排可有效的幸免假阳性的发生. 在咱们的研究中，所有存在bcl2基因重排的病例均表达CD10，统计学资料说明二者存在相关性，因此通过对bcl2基因重排的检测可确信部份GCB 类的DLBCL. 这部份DLBCL与其它类型的DLBCL相较可能有不同的发病机制，属不同的疾病亚型［7-8］. 正确的检测方式对这种疾病的正确诊断有着重要意义，咱们利用的半巢式PCR提高了诊断重排的准确性.本研究在进行免疫组化进程中，咱们采纳了TMA技术，由于所有标本均在一张切片上进行免疫组化染色，人为误差少，一致性更强，有助于在同一水平进行观看分析和比较研究，因此本研究的免疫组织化学染色结果是靠得住的.【参考文献】［1］ Rosenwald A, Wright G, Chan WC, et al. The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse largeBcell lymphoma［J］. N Engl J Med,2002,346(25):1937-1947.［2］ Shipp MA, Ross KN, Tamayo P, et al. Diffuse large Bcell lymphoma outcome prediction by geneexpression profiling and supervised machine learning ［J］. Nat Med, 2002,8(1):68-74.［3］Hans CP, Weisenburger DD, Greiner TC, et al. Confirmation of the molecular classification of diffuse large Bcell lymphoma by immunohistochemistry using a tissue microarray ［J］. Blood, 2004,103(1):275-282.［4］ Colomo L, LopezGuillermo A, Perales M, et al. Clinical impact of the differentiation profile assessed by immunophenotyping in patients with diffuse large Bcell lymphoma ［J］. Blood, 2003,101(1):78-84.［5］Tsuboi K, Iida S, Inagaki H, et al. MUM1/IRF4 expression as a frequent event in mature lymphoid malignancies ［J］. Leukemia, 2000,14(3):449-456.［6］ Natkunam Y, Warnke RA, Montgomery K, et al. Analysis of MUM1/IRF4 protein expression using tissue microarrays and immunohistochemistry ［J］. Mod Pathol, 2001,14(7):686-694.［7］ Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE, et al. Distinct types of diffuse large Bcell lymphoma identified by gene expression profiling ［J］. Nature, 2000,403(6769):503-511.［8］ Huang JZ, Sanger WG, Greiner TC, et al. The t(14,18)defines a unique subset of diffuse large Bcell lymphoma with a germinal center Bcell gene expression profile ［J］. Blood, 2002,99(7):2285-2290.。

淋巴瘤相关基因的功能及临床意义张莹;甘润良【摘要】淋巴瘤的发生、发展和其他恶性肿瘤一样,有众多的基因参与其中.某些基因与淋巴瘤的发生有关,如间变性大细胞淋巴瘤中PRF1基因突变,套细胞淋巴瘤中SOCS3基因缺失及甲基化等与淋巴细胞的恶性增殖有关;某些基因与淋巴瘤的诊断有关,如检测BCL10基因突变、CDH1基因甲基化、MALT1基因重组等有助于淋巴瘤的临床诊断或者类型的鉴别;某些基因与淋巴瘤的治疗有关,如治疗前后PIG-3基因表达出现改变,IL-10基因的不同基因型患者对同种治疗的反应不同等;某些基因与淋巴瘤的预后有关,如P15启动子甲基化、CDKN2A缺失等与生存指标有关,可作为淋巴瘤的预后指标.【期刊名称】《医学研究杂志》【年(卷),期】2016(045)001【总页数】4页(P174-177)【关键词】淋巴瘤;基因;功能;临床意义【作者】张莹;甘润良【作者单位】421001 衡阳,南华大学肿瘤研究所;421001 衡阳,南华大学肿瘤研究所【正文语种】中文【中图分类】R73恶性淋巴瘤是原发于淋巴结和结外淋巴组织的恶性肿瘤，简称淋巴瘤。

按病理组织学的不同，可分为两大类：霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。

目前发现大量的基因异常改变如突变、甲基化、缺失、易位、重组等，可能导致淋巴瘤的发生，并有助于淋巴瘤的临床诊断、治疗和提示预后。

认识这些基因的功能及其可能的临床意义，对于揭示淋巴瘤的发病机制以及临床诊疗、预后具有重要意义，本文就该领域的研究进行综述。

L20、 MAdCAM-1、CCR6基因：Takata等[1]研究十二指肠滤泡性淋巴瘤(DFL)的发生机制，用PCR和免疫组织化学分析72例组织样本，包括十二指肠滤泡淋巴瘤(DFL)，胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和淋巴结滤泡淋巴瘤(NFL)样本,3种类型淋巴瘤差异表达基因(DEG)的表达谱表明，十二指肠滤泡淋巴瘤和MALT淋巴瘤有共同的特点，CCL20和MAdCAM-1在DFL和MALT淋巴瘤中上调，但在NFL中下调，双重免疫荧光显示,CCL20和CCR6在DFL和MALT淋巴瘤中均共同表达，得出CCL20和MAdCAM-1的高表达和CCL20和CCR6的共同表达在十二指肠滤泡性淋巴瘤发生中起着重要作用。

血浆D-二聚体评估非霍奇金淋巴瘤疗效的价值血浆D-二聚体是一种血液中的蛋白质，通常通过血液检测来测定其浓度。

D-二聚体通常被用作诊断深静脉血栓和肺栓塞的指标，但近年来研究表明，在某些肿瘤中，血浆D-二聚体的升高也可能预示着疾病活动性和预后。

非霍奇金淋巴瘤（NHL）是一种由淋巴组织或白血病细胞分化而来的恶性肿瘤。

基于其细胞学、分子遗传学和临床表现的多样性，NHL被分为多个亚型。

治疗NHL的主要方法包括化疗、放疗、靶向治疗和造血干细胞移植。

然而，在实际治疗中，患者对不同治疗方案的反应和预后差异较大，因此需要寻找一些生物标志物来评估治疗反应和预后。

多项研究表明，血浆D-二聚体的浓度和NHL的临床表现和预后密切相关。

在一项研究中，研究人员分析了129例NHL患者的血浆D-二聚体浓度和治疗反应及预后的关系。

结果显示，在治疗前患者的血浆D-二聚体浓度升高与化疗反应不佳和预后较差密切相关。

值得注意的是，在治疗后，患者的血浆D-二聚体水平下降可以预示着疾病缓解或完全缓解，具有良好的治疗预后。

在实际临床应用中，血浆D-二聚体作为一种辅助指标可以帮助医生更好地评估NHL患者的治疗反应和预后，并指导治疗策略的制定。

另外，作为一种无创、经济的生物标志物，血浆D-二聚体的检测也具有一定的优势和应用前景。

总之，血浆D-二聚体浓度的升高与NHL患者治疗反应不佳和预后较差密切相关，作为一种辅助指标，可以帮助医生更好地评估患者的治疗反应和预后，指导治疗策略的制定。

对于NHL患者的临床管理和治疗，血浆D-二聚体的评估具有一定的价值和应用前景。

非霍奇金淋巴瘤的分类和化疗方案一、非霍奇金淋巴瘤的分类非霍奇金淋巴瘤（NHL）是一种较常见的恶性淋巴瘤，与霍奇金淋巴瘤相比，具有更多的亚型和分化程度。

根据细胞来源和形态学特点，非霍奇金淋巴瘤可以被分为多个亚型。

1. 弥漫大细胞B细胞淋巴瘤（DLBCL）弥漫大细胞B细胞淋巴瘤是最常见的非霍奇金淋巴瘤类型，约占所有非霍奇金淋巴瘤的30％。

该亚型通常表现为快速生长、侵袭性较强，并且具有异质性。

2. 滨红珊瑚样脾大细胞B细胞淋巴瘤（MCL）滨红珊瑚样脾大细胞B细胞淋巴瘤占所有非霍奇金淋巴瘤的5-8％。

它通常以多中心或弥漫性腹腔内组织和骨髓浸润为特点，并具有不良预后。

3. 弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）-凋亡抵抗（ABC）型和非GCB型弥漫性大B细胞淋巴瘤也可以根据基因表达谱分为两个子型：ABC型和非GCB型。

这两个亚型在治疗反应和生存率方面存在差异。

4. 浆细胞淋巴瘤/浆细胞性外周T细胞淋巴瘤浆细胞淋巴瘤是一种罕见的较恶性的B细胞性内皮系统和组织系统中的CD20阳性肿瘤，占所有非霍奇金淋巴瘤的1-2％。

5. 水蛭性流经Lymphoma（IVLBCL）水蛭性流经Lymphoma是一种少见但极具侵袭性的非霍奇金淋巴瘤，通常累及小血管内皮系统，在器官内形成微血管滲出及组织灶坏死。

二、非霍奇金淋巴瘤的化疗方案1. ACVBP方案（玛法司琼+环孢霉素+硼替佐米+长春新碱+补救治疗）ACVBP方案是一种针对非霍奇金淋巴瘤的常用化疗方案，主要使用了玛法司琼、环孢霉素、硼替佐米、长春新碱等药物。

这个方案可以提供较高的完全缓解率和无进展生存率，并且能够为患者提供良好的预后。

2. R-CHOP方案（利妥昔单抗+环孢霉素+奥沙利铂+长春新碱+强的松）R-CHOP方案是目前推荐用于弥漫大细胞B细胞淋巴瘤患者的一线化疗方案。

该方案包含了免疫调节剂利妥昔单抗和多种细胞毒性药物，如环孢霉素、奥沙利铂、长春新碱和强的松。

R-CHOP方案已广泛应用，并在改善预后和生存率方面取得了显著效果。