13859-生物-植物-染色-植物气孔保卫细胞GUS染色法

植物生理学实验指导目录植物材料的采集、处理与保存..................................... 实验一拟南芥种植和形态观察................................... 实验二植物细胞的活体染色和死活的鉴定......................... 实验三植物原生质体的分离和融合............................... 实验四植物叶面积测定原理、方法和步骤......................... 实验五植物细胞渗透势的测定（质壁分离法）..................... 实验六植物组织水势的测定（小液流法）......................... 实验七植物根系活力的测定（TTC法）............................ 实验八根系总吸收面积和活跃吸收面积的测定..................... 实验九离体叶绿体的制备以及完整度的测定....................... 实验十叶绿体色素的提取、分离和理化性质....................... 实验十一植物叶片光合速率的测定（改良半叶法）................. 实验十二氧电极法测定植物组织的光合与呼吸速率................. 实验十三小篮子法（广口瓶法）测定植物的呼吸速率. (37)实验十四谷物淀粉含量的测定（旋光法）......................... 实验十五类似生长素对种子萌发的影响........................... 实验十六赤霉素对α-淀粉酶的诱导形成........ 错误！未指定书签。

实验十七植物种子生活力快速测定............................... 实验十八植物光周期现象的观察................................. 实验十九植物抗逆性的测定（电导仪法）....... 错误！未指定书签。

含GUS报告基因的转GUS染色一、原理Gus (b-glucuronidase)基因作为一种报告基因，在植物遗传转化研究中有广泛的用途。

Gus基因来自于大肠杆菌，编码b,葡聚糖苷酶(一种水解酶)，可催化底物5,溴,4,氯,3,吲哚葡聚糖醛酸苷(5,bromo-4-chloro-3-indolyl-glucronide，缩写为X,Gluc)分解，产生肉眼可见的深兰色化合物，借此用来观察转基因植物中外源基因的表达情况，鉴定转基因植株。

二、目的了解转基因植物中基因表达的器官、组织和细胞的特异性，掌握Gus报告基因表达的组织化学定位的方法。

三、材料与试剂1、转基因植物的组织、器官、种胚或幼苗。

t2、同种非转化植物的组织、器官、种胚或幼苗。

3、50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)。

4、染色液:100mM K3[Fe(CN)6], 100mM K4[Fe(CN)6] 10mMNa2EDTA, 0.001% (v/v) triton X-100, 20%甲醇，0.5mg/ml X-Gluc, 磷酸缓冲液(50mM, pH 7.0)。

5、70,乙醇。

四、操作步骤1、将准备好的材料冲洗干净，用吸水纸吸干，浸在上述染色液中37?恒温条件下保温过夜。

2、转入70,乙醇中脱色2,3次，去除叶绿素，至阴性对照材料呈白色时为止。

3、肉眼或显微镜下观察，白色背景上的兰小点即为Gus基因表达的位点。

4、83,、95,、100,乙醇中脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。

5、常规石蜡切片法切片，番红染色。

6、显微镜下观察、拍照。

五、说明1、要设立严格的阴性对照，即用同样的未转化的材料按相同的方法同时进行染色。

如阴性对照显示兰色，其原因可能是:A)材料和试剂被细菌感染;B)保温时间过长。

2、染色液中的甲醇可抑制细菌生长，长时间染色可加入0.02% NaN3或100mg/ml的氯霉素，短时间染色也可以不加。

3、叶绿体含量高的材料染色后要进行脱色。

DAPI 和Calcoflour染色
1.用牙签挑取适量新鲜的分生孢子于1ml液体培养基的离心管中振
匀。

2.将振匀的孢子悬液吸取到带有无菌盖玻片的小培养皿中，一定温
度(37℃)下培养一段时间，吸去培养基，用4%多聚甲醛（现配现用，用PBS对16%的多聚甲醛直接稀释到使用所需量）固定1h 以上，然后用PBS溶液洗去甲醛（避免直接冲盖玻片把菌丝冲掉），晾干。

3.吸取大约100ul DAPI (0.8μg/ml的工作液) 染料(SIGMA)滴到盖玻
片上对核进行染色，室温避光放置至少5min。

PBS洗去DAPI染液。

晾干。

4.吸取大约100ul Calcofluor(配制2，2.5，3，3.5，4μg/ml不同浓度
的工作液摸浓度，对于构巢曲霉以及烟曲霉野生型，核隔共染所需染液浓度大概为2μg/ml) 染料(SIGMA)滴到盖玻片上对隔膜进行染色，室温避光放置至少5min。

PBS洗去Calcofluor染液。

5.在载玻片上滴20 ul无菌水，盖上盖玻片，洗去多余的水，压片，
指甲油封片在3-4小时内用显微镜对菌丝进行荧光显微观察（或在载玻片上滴一滴mounting medium，封片后可防止荧光淬灭长期保存。

DAPI和Calcofluor：母液1mg/ml -20℃避光保存，工作液4℃避光保存。

经过固定的片子可以在4℃冰箱保存数月以供观察，染色效果很好的片子可以-20℃冰箱保存一年。

GUS报告基因范文GUS报告基因是一种用于筛选转基因植物的报告基因。

它在植物细胞内表达的酵素β-葡萄糖苷酶（β-Glucuronidase，GUS），能够将葡萄糖醛酸（X-Gluc）转化为蓝色产物。

通过观察和分析植物组织的GUS活性，可以判断是否发生了基因转化。

下面将详细介绍GUS报告基因的特点、应用以及实验方法。

1.GUS报告基因的特点（1）GUS基因来自于大肠杆菌，它很少在真核生物中表达，因此不会对植物正常生长发育产生影响。

（2）GUS基因编码的酵素活性能够方便、快速地用染色剂标记出来，实验结果直观可见。

（3）转GUS基因的步骤相对简单，转化率较高，且不需要使用昂贵的设备。

2.GUS报告基因的应用（1）植物转基因筛选：通过观察和分析转基因植物的GUS活性，可以确定哪些植株成功地转化了外源基因。

（2）基因调控研究：GUS报告基因可以用来研究目的基因的表达调控机制，例如在转基因植物中瞬时表达GUS基因，观察其在各种组织和发育阶段的表达情况，可以推测目的基因的启动子活性。

（3）信号传导途径研究：通过构建GUS基因的操纵，可以研究植物信号传导途径中特定基因的表达情况，进而了解信号传导途径的效率和调节机制。

3.实验方法以下是GUS报告基因实验的一般步骤：（1）构建GUS载体：将GUS基因与适合的植物表达载体进行连接，形成GUS转化载体。

（2）遗传转化：将GUS转化载体导入要进行转基因植物研究的植物细胞中，使用适当的生物技术方法（如冲击法、农杆菌介导法）实现遗传转化。

（3）植物筛选：选择经过转化的植株进行分析，通常可以通过PCR、Southern blot、Western blot等技术检测GUS基因的存在。

（4）组织切片染色：收集不同部位的植物组织，例如叶片、根、花等，制作切片。

使用X-Gluc作为底物加入切片中，观察蓝色染色产物的形成。

（5）定量分析：通过测定GUS活性，使用亲合素、含有底物的液体培养基等方法，可以 quantitatively 地测定GUS酶活性。

植物叶片染色方法
植物叶片染色是一种常见的实验方法，它可以用于观察植物叶片的细胞结构和染色体形态等。

下面介绍一种简单易行的植物叶片染色方法。

材料：植物叶片、甲醛、酒精、苏木精、碘化钾、甲基绿、蒸馏水。

步骤：
1.取新鲜植物叶片，用剪刀将其切成适当大小的片段，放入甲醛中浸泡10-15分钟。

2.从甲醛中取出叶片，用酒精进行脱水处理，分别浸泡70%、80%、95%和100%的酒精中，每次浸泡5-10分钟，最后用100%酒精浸泡30分钟。

3.将叶片放入苏木精中浸泡30分钟。

4.将叶片放入碘化钾中浸泡2-3分钟，然后用蒸馏水冲洗干净。

5.将叶片放入甲基绿溶液中浸泡5-10分钟。

6.将叶片用蒸馏水冲洗干净，用滤纸吸干水分，然后放在载玻片上，加一滴蒸馏水，用镜片盖好。

7.用显微镜观察叶片细胞的染色质和细胞结构。

以上就是一种简单易行的植物叶片染色方法，可以用于初学者的实验操作。

但需要注意的是，在操作过程中需要注意安全，避免对人体和环境造成危害。

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转基因烟草的方法 1.接种单菌落于加有KAN,RIF和STR的3ML液体YEB培养基中，28度培养2天，转接与20ML YEB液体培养基中，28度继续培养至OD600=0.6-0.8。

2.菌液经4000RPM离心10分钟，倒掉上清液，用MS液体培养基重悬菌体，调OD600=0.6-0.8 3.取无菌烟草叶片，去除边缘，主叶脉，剪成大小约1CM*1CM的小块，浸泡在菌体悬浮液中，2-3分钟，期间不断轻轻摇晃。

4.取出叶片，用灭菌滤纸吸取表面菌液，将叶片至于共培养培养基上（MS+6-BA 1MG/L,NAA 0.1MG/L）28度黑暗共培养2-3天。

5.将共培养后的叶片在无菌水和加入羧苄青霉素的无菌水中清洗一遍，灭菌滤纸吸取多余水分，然后转到分化选择培养基上（MS+6-BA 1MG/L,NAA 0.1MG/L，潮霉素10-60MG/L,CARB 500MG/L）25度光照培养，每两周更换一次培养基，直至分化出愈伤组织，进而分化出不定芽。

6.将长至2CM以上的不定芽切下并转移到生根培养基上（1/2MS+NAA 0.1MG/L，潮霉素20-100MG/L,CARB 500MG/L）诱导生根。

7.将一次生根的再生苗切取根尖，接种到新的生根培养基上，诱导生根，不能生根的芽丢掉。

叶盘法转基因烟草技术一．实验目的：学习并了解叶盘法转基因烟草的技术流程。

二. 实验原理：土壤中的农杆菌是一种革兰氏阴性菌，能够感染植物的受伤部位。

农杆菌中有一种环形的Ti质粒，Ti质粒最重要的两个区域为T-DNA区和毒性区，T-DNA是Ti质粒上唯一能够整合到植物染色体上的序列，而毒性区上一系列则帮助T-DNA区整合到植物的染色体上。

土壤农杆菌转化植物的常用方法是叶盘法。

这种转基因方法十分简单，一般是将植物的叶片切成小圆片，用农杆菌感染后共培养2-4天，而后转移到加有选择压的分化培养基上分化出芽，在MS培养基上生根后，再生出完整的植株。

转基因植物中报告基因GUS组织化学定位检测转基因植物中报告基因GUS组织化学定位检测一、实验目的1、掌握基因GUS的表达的检测方法2、了解GUS基因的应用二、实验原理GUS基因就是转β-葡糖醛酸酶基因，它存在于E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。

β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其分解产物呈蓝色。

由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中。

根据地gus基因检测所用的底物不同，可以选择三种检测方法：组织化学法、分光光度法和荧光法（灵感度为分光光度检测法最高），其中最为常用的是组织化学法。

组织化学法检测：以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）作为反应底物。

将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡，若组织细胞被转入了GUS基因，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产物经氧化二聚作用于形成的靛蓝染料，它使具Gus活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。

因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。

三、实验材料、试剂拟南芥AK12-pro、GUS工作液四、实验步骤1、取2支1.5ml离心管，各加入0.3ml 1mol/L GUS染色液；2、用镊子夹取转基因和野生型拟南芥幼苗各1根，分别放入上述离心管中；3、37℃浸泡过夜。

4、倒掉染色液，加入75%乙醇脱色；30min后换一次75%乙醇脱色；肉眼下观察染色情况；拍照。

如果有GUS基因表达产物，则出现蓝色。

五、实验结果从上述照片中科一看出，将野生型和转基因型拟南芥用含有底物的缓冲液浸泡，转β-葡糖醛酸酶基因将X-Gluc 水解生成蓝色产物，说明组织细胞被转入了GUS 基因，并表达出GUS ，这是由其初始产物经氧化二聚作用于形成的靛蓝染料，在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus 活性，图中拉瑟比较深，说明Gus 活性相对较高。