6讲第1节-植物细胞生物制药

将单个细胞接种于滤纸上， 再置于愈伤组织之上培养。 优点是：简便、成功率高。 缺点是不能在显微镜下直接 观察。


饲养层培养（Feeder layer culture） 把处理过的（如X射线处理）无分裂能力或分裂很 慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生 长。
致谢：看护与饲养层培养图片引自华中农业大学细胞工程学课程网站
1.化学提取：树皮、嫩芽中含量最高，一般为0.005% 左右。 生产1kg紫杉醇需要砍伐60年生大树3000-4000棵。 2.化学合成：结构复杂，全合成需要几十步合成步骤，总得 率仅4-5%。
主要问题：产量低，价格昂贵。99%纯度的1700-2000元/克。
有效途径：红豆杉细胞培养制备紫杉醇
1.从树叶获取细胞，利于资源保护（红豆杉属于濒危保护植 物）。
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第二部分 植物细胞固定化培养 培养工艺
一 植物细胞固定化培养
问题：植物细胞固定化培养有什么优点？
（一）定义 细胞固定化培养（Cell immobilization culture）是指将游离的细胞包埋在支持物内部 或表面进行培养的一门技术。 在20世纪70年代的酶固定化催化技术基础上发展 起来。
2.细胞培养不受地理环境影响：地理环境、病虫害和季节等 因素的影响，可以保证产物无限、连续、均匀地生产。 3.利用生物技术提高目标产物含量，实现大规模培养制备。 （1）可以通过进行红豆杉细胞的筛选，获得超过原植株紫 杉醇含量的细胞。 （2）易于在生物反应器中满足最佳条件，进行大规模、高 密度地培养。 （3）可以进行红豆杉细胞紫杉醇代谢途径研究，利用代谢 调控使细胞定向合成有用次生代谢物。
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第四篇 生物制品生产 第6讲 植物代谢产物 第1节 植物细胞培养技术
《生物产业发展规划》
中国政府网3月6日：国务院明确到2020年把生物产业发 展成为国民经济支柱产业等目标。未来三年生物产业产 值年均增速将保持在20%以上。
美国癌症协会（ American Cancer Society，简称ACS） 统计报告 在美国，癌症是第二 大致死因素，仅次于 心血管疾病。 美国肝癌男性患者每 年以3.6%增长。 胰腺癌五年存活率只 有5%。
1979年，布洛德利斯（Brodelius）首次成功利 用固定化的毛地黄、长春花细胞制备次级代谢产 物。
（二）优点
1.细胞经包埋后使所受的剪切力损伤减小，维持了细胞 的稳定性，适合脆弱的植物细胞的培养，同时也利于采 用传统生物反应器大规模培养。 2.悬浮细胞培养体系中细胞密度比较高时会因粘度增加 引起传质困难。固定化细胞培养系统中细胞密度远高于 悬浮培养，但并不会改变培养液流体性质，利于传质。 3.大多数植物次级代谢产物合成在生长停止后才大量合 成。采用固定化培养可以将细胞生长与产物合成分成两 个阶段。




2.气升式生物反应器(Air-lift bioreactor) 由气升室、气降室、除气室和 底部四部分组成。 培养液循环的动力来自于气升 室、气降室中因含气量不同而 在底部产生的压力差，因而比 鼓泡型有更均一的流动形式。 根据反应器内部结构与气体分 布器的位置不同可分为内环流 和外环流两种。

改良搅拌形式的生物反应器 离心桨生物反应器采用三叶 螺旋桨，同时采用微孔金属 丝网作为空气分布器，能提 供良好的混合状态，具有比 机械搅拌桨底的剪切力。
4.其它类型生物反应器
转鼓式生物反应器 (Rotating drum bioreactor) 因为转子的转动带动培养 罐转动，促进了气体交换 与营养物质的吸收，具有 悬浮系统均一、低剪切力 、防止细胞粘附在壁上的 优点，适合于高密度植物 悬浮细胞的培养，已用于 长春花、紫草的细胞悬浮 培养。
内容安排： I：植物细胞培养技术 II：植物细胞培生产次级代谢产物的应用举例 分析与讨论 III：植物组织培养及应用举例分析
本节主要内容：
1.植物细胞小规模培养、生物反应器
2.植物细胞固定化培养、培养工艺
本节关键问题：
1.植物细胞培养的生物反应器：悬浮培养、固定 化培养
2.细胞培养的操作方式及各自特点：分批、流加 、半连续、连续、灌注培养
植物细胞培养生产代谢产物的意义
例子1：紫杉醇（Taxol） 从红豆杉属植物中分离得到的一种 双萜类化合物化。C47H51NO14， 分子 量：853.90 具有良好的抗癌活性，尤其对晚期 、转移性卵巢癌、乳腺癌、肺癌有 十分显著的疗效。 制备途径： 1.直接从红豆杉中提取 2.化学全合成；化学半合成 3.植物细胞培养 4.内生真菌培养

3.鼓泡式生物反应器(Bubble column bioreactor) 又称为鼓泡 塔式反应器，是最简单的气动式 生物反应器。
气体分布器一般位于底部中央， 气体从底部通过喷嘴或孔盘进入 反应器。它不含转动部分，整个 系统密闭，易于无菌操作。不同 于气升式生物反应器，液体在反 应器内部呈无规律的湍流状态。 培养过程中没有机械能消耗，适 合于培养对剪切力敏感的细胞。 然而对高密度及粘度较大的培养 物，反应器的混合效率会降低。

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第一部分 植物细胞悬浮培养 生物反应器
一 培养基

植物细胞培养的培养基主要由碳源、氮源、无机盐 、维生素、植物生长激素、有机酸和一些复合物质 组成。目前应用广泛的基础培养基有MS、B5、N6等 ，具体内容参见5.2.2一节。P312-313 无机盐：大量元素N\S\P\K\Ca\Mg等、微量元素 有机物：糖类、氨基酸、维生素等 调节物质：激素 与微生物培养基相比：需要大量无机盐；多种维生 素和激素；一般采用无机氮源；一般以蔗糖为碳源。

问题：与传统微生物发酵罐相比，植物细 胞培养的生物反应器有什么特点？

由于植物细胞与微生物细胞形态结构不同，具有不同的生 长特性，例如：较微生物细胞大，对氧的要求相对微生物 要低，周期长，易团聚等。因此微生物反应器并不完全适 合于植物细胞生长与生产，需要进行改造。 例如： 对剪切力耐受性差：搅拌桨改造 需要光照：外光源、内光源，透明材料。 易粘附：结构尽量简单。
三 植物细胞培养历史


20世纪50年代，泰尔克（Talecke）和尼克尔（ Nickell）证实植物细胞可生长在悬浮培养液中。 随后，人们发现离体培养的植物细胞具有合成代 谢产物的能力。1956年，尼克尔（Nickell）和卢 荻（Routin）申请了以植物细胞培养作为工业合 成天然产物的一条途径的专利（在20L的玻璃瓶中 建立了第一个植物细胞大量培养系统，并放大到 30L和 134L的不锈钢发酵罐）。 20世纪80年代后期，紫草宁等细胞培养生产次获 得了产业化（紫草宁可以用作创伤、烧伤以及痔 疮的治疗药）。
四 植物细胞悬浮培养


细胞悬浮培养（Cell suspension culture）是 将细胞接种于液体培养基中并保持良好的分散状 态的培养方式。 植物细胞悬浮培养主要在摇床和生物反应器中进 行，培养方法与微生物类似。

优点：
1.可以增加细胞与培养液的接触，促进营养的吸 收。 2.保证良好的混合状态，从而获得良好的气体传 递效果。 3.可以达到较高的细胞浓度，容易放大培养。
一 植物细胞培养的定义

植物细胞培养（Plant cell c 获得大量细胞群体的一种技术。
获得的细胞群体可以作为制备有价值代谢产物的 原料，也可以作为基础研究的材料。


同时植物细胞培养技术也是人工种子、原生质体 培养、花药培养等的支撑技术。
还原、氧化、重排
青蒿酸
青蒿素
3.植物细胞（组织）培养、生物合成
利用细胞培养、毛状根培养生产青蒿素，产量达 到1-2%（天然青蒿素含量 0.6-1%）。 利用生物合成、代谢工程等技术生产青蒿素的研 究也已取得大的进展。
其它例子
紫草宁：为植物色素之一种（萘 醌）。存在紫草植物中。抗癌、 抗炎、抗菌等。日本在1983年用 大规模紫草细胞培养来生产紫草 宁。 灵芝酸：是灵芝中除多糖外另一 类具有广泛生理活性的物质，三 萜；被证明具有止痛、镇静、抑 制组织胺释放、解毒、保肝、抗 肿瘤等活性。 人参皂苷：四环三萜类衍生物； 对人体神经系统、循环系统、血 液系统等具有广泛的生物活性。
黄花蒿(Artemisa annua)
2.化学合成：上海交通大学张万斌教授领衔的科研团队经过7 年的探索和努力，实现了青蒿素高效人工合成。 使用一种特定催化剂，将青蒿酸还原后所得到的二氢青蒿素 再次转化，以接近60%的高收率得到青蒿素（专利申请号： CN201210181561.7；名称：一种由青蒿酸制备青蒿素的方法 ） 1吨黄花蒿可提取约6-8公斤的青蒿素，每公斤青蒿素40006000元。化学合成使青蒿素的制造成本将降低50%以上。

植物细胞培养时搅拌桨选择

搅拌罐中产生的剪切力大，容易损伤细胞，直接影响细胞 的生长和代谢，特别对于次级产物生成影响极大。需要对 搅拌罐进行改进，包括改变搅拌形式、叶轮结构与类型、 空气分布器等，力求减少产生的剪切力，同时满足供氧与 混合的要求。

不同叶轮产生剪切力大小顺序为： 涡轮状叶轮＞平叶轮＞折叶浆＞螺旋状叶轮



二 植物单细胞分离

植物细胞培养首先需要从植物样品制备单细胞 1.酶解法：选择专一性水解酶在温和的条件下将 植物细胞壁物质（纤维素、果胶、多糖）降解， 从而使细胞彼此分开，这种方法称为酶解法。 经常采用的生物酶包括：纤维素酶、果胶酶、琼 脂酶等。


生物酶 植物组织
悬浮分散、离心 植物细胞
例子2：青蒿素(Artemisinin)
2011年9月，中国女药学家屠呦呦因 创制新型抗疟药———青蒿素的贡 献，获得拉斯克奖。 1.化学提取：主要从青蒿中直接提 取；或提取青蒿中含量较高的青蒿 酸，然后半合成制备。