产脂肪酶菌株的筛选鉴定及产酶条件优化

脂肪酶的性质微生物脂肪酶( EC 3. 1. 1. 3) ,又称三酰基甘油酰基水解酶,是指分解或合成高级脂肪酸和丙三醇形成的甘油三酸酯酯键的酶。

脂肪酶(Lipase EC3 1．1．3)又叫甘油酯水解酶，催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油二酯或甘油一酯或甘油，过程表示如下脂肪酶甘油三酯+水甘油二酯+游离脂肪酶脂肪酸；甘油一酯+游离脂肪酸脂肪酶甘油+游离脂肪酸脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶，只作用于异相系统，即只在油水界面上作用，而且只有当底物以微粒、小聚合分散状态或呈乳化颗粒时，脂肪酶对底物水解才有显著的催化作用。

脂肪酶的最佳作用条件与酶的来源关系很大。

微生物脂肪酶的最遣用条件为pH7.0 温度37℃，可被钙离子、低浓度胆盐激话。

而动物性脂肪酶的最佳条件是pH9．0，温度37+C，可被油酸钙、白朊和胆盐激活。

二、脂肪酶的工业来源脂肪酶广泛存在于自然界。

几乎所有的动物器官中都含有脂肪酶，脂肪酶还存在于许多植物、细菌和真菌中。

脂肪酶的生产方法有三种：提取法，化学合成法和发酵法。

化学合成法由于实验技术等条件的限自目前尚处于研究阶段I 提取法由于动植物器官和组织电古量较少而大受限制|而微生物发酵法是脂肪酶生产的主要方法。

目前，工业制取用的主要酶源有(1)动物性脂肪酶：猪的胰脏。

(2)微生物脂肪酶：真菌（如曲霉、青霉根霉、毛霉和酵母)(3)脂蛋白脂肪酶。

细菌(如假单胞菌)产脂肪酶菌株的筛选方法(1) 富集培养将采集的土样稀释后取1 mL 放入装有50 mL富集培养基的三角瓶中,45 ℃,220 rpm 摇床培养5 d ,并将富集培养液持续转接3～4 次1(2) 菌株初筛将富集培养液稀释,涂布于加有罗丹明B为指示剂的选择培养基上(也可以选用溴甲酚紫为指示剂) ,经培养观察菌落周围是否出现透明圈,然后把形成透明圈的菌落分别保存(3) 菌株复筛将经初筛的菌株接种于复筛培养基,摇瓶培养,50 h 后测定酶活Rhodamine B 平板筛选法在培养基中加入3%的植物油，灭菌后冷却至60oC，加入0.2%过滤灭菌的Rhodamine B 溶液，制成平板. 用无菌牙签将菌种分别转移到Rhodamine B 筛选平板上，于30oC 条件下恒温培养72 h.然后在350 nm 紫外光下观察，依据培养平板上形成的荧光圈大小进行菌种筛选.( 2) 初筛琼脂块培养法: 将分离培养基用灭菌的打孔器制作成许多单个的直径约0.6 cm 的小琼脂块, 排放在干净的培养皿内, 将上述挑选的菌株接种在这些小琼脂块上培养,让其充分生长, 然后依次再将长满菌的小琼脂块放到酶活测定板上, 28℃培养1～ 3 d, 观察各菌落周围油脂水解圈的大小, 将水解圈大的菌株纯化后保存在斜面培养基上(3) 复筛挑取斜面保存的菌种接入发酵培养基中28℃, 150 röm in 摇床培养48 h 后, 发酵液离心(3 000 röm in, 5 m in) , 除去菌体, 取上清液测定酶活细菌有28 个属、放线菌4 个属、酵母菌10 个属、其它真菌23 个属共计达65 个属的微生物产脂肪酶三、脂肪酶在食品工业中的应用1．三酰甘油水解水解三酰甘油的常规方法是利用高温、高压水解的方法产生脂肪酸，此法能耗高，投资大，所得脂肪酸的质量较差。

产脂肪酶菌株的筛选及紫外-光复活诱变王金主1，袁建国2，杨丹2，徐军庆2，谭少君2，刘建民2，王元秀1，李峰2*（1.济南大学化学化工学院，山东济南250022；2.山东食品发酵工业研究设计院，山东济南250013）摘要：目的从土壤中分离选育出脂肪酶高产菌株。

方法通过罗丹明B 指示平板法分离出产脂肪酶量高的菌株，通过紫外-光复活诱变选育提高产量。

结果从土壤中筛得脂肪酶产量为6.75U/mL 的菌株白地霉L-8，通过紫外-光复活诱变提高产量到12.08U/mL 。

结论获得了一株高产脂肪酶的白地霉菌株，结果表明从土壤中分离出产脂肪酶的菌株，再通过紫外-光复活诱变提高其产量的高产菌株的筛选方法是可行的。

关键词：脂肪酶；罗丹明B ；白地霉；紫外-光复活诱变中图分类号：Q814.1文献标识码：A文章编号：1672-979X （2011）05-0192-04收稿日期：2011-1-11作者简介：王金主()，男，山东临沂人，硕士研究生，研究方向发酵工程：x @*通讯作者：李峰，男，高级工程师，研究方向发酵工程和酶工程：j @Screening of Lipase Producing Strains and Its Breeding by UV -photoreactivation MutagenesisWANG Jin-zhu 1,YUAN Jian-guo 2,Y ANG Dan 2,XU Jun-qing 2,TAN Shao-jun 2,LIU Jian-min 2,W ANG Y uan-xiu 1,LI Feng 2(1.School of Chemistryand Chemical Engineering,University of Jinan,Jinan 250022,China;2.Shandong F ood &Fermentation Industry Research and Design Institute,Jinan 250013,China)Abstr act:Object ive To isolate and select a high-yield lipase producing strain from soil.Methods A high-yield strain was isolated by flat separation using Rhodamine B as indicator.Its production was improved by ultraviolet photoreactivation mutagenesis.R esult s We obtained Geotrichum candidum L-8from soil.Its lipase yield was improved from 6.75U/mL to 12.08U/mL through ultraviolet photoreactivation mutagenesis.Conclusion A high-yield lipase producing strain was obtained.The methods to isolate it from soil and to improve its production of lipase were feasible.Key Words:lipase;Rhodamine B;Geotrichum candidum;ultraviolet photoreactivation mutagenesis脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶[1]，它能水解甘油三酯产生脂肪酸、甘油二脂、甘油单脂和甘油[2]。

内生黑曲霉产脂肪酶条件研究及其粗酶酶学特性何茹;刘娅;谢晓霞;王陈强【摘要】针对新疆酿酒葡萄中获得的1株产脂肪酶的内生黑曲霉菌株C2J6,研究了该菌株的产酶条件及酶学特性.结果表明,该菌适宜的产酶条件为1％的乳糖为碳源,1％的蛋白胨为氮源,培养基初始pH值为8.0,培养温度35℃,培养时间约72h,此时所产脂肪酶的活力可达18.75U/mL.该菌所产脂肪酶粗酶液的最适反应温度为40℃,最适反应pH值为7.0,为中温中性酶;在50℃保温1h酶活力保留54.55％,具有良好的热稳定性;在pH值3.0～7.0范围内较稳定,有一定的耐酸性.金属离子Mn2+对酶活力有促进作用,Zn2+、Fe2+、Cu2+对酶活力有抑制作用,K+、Ca2+、Na+、Mg对酶活力影响不大.该酶在以葵花油和谷物调和油为底物时,酶活分别为228％和180％,明显高于橄榄油和油烟机废油.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2014(033)003【总页数】5页(P52-56)【关键词】内生黑曲霉;脂肪酶;产酶条件;酶学特性【作者】何茹;刘娅;谢晓霞;王陈强【作者单位】石河子大学食品学院,新疆石河子832000;石河子大学食品学院,新疆石河子832000;新疆冠农果茸集团股份有限公司技术中心,新疆库尔勒841000;新疆冠农果茸集团股份有限公司技术中心,新疆库尔勒841000【正文语种】中文【中图分类】TQ925脂肪酶（EC3.1.1.3）又称三酰基甘油酰基水解酶，可将甘油三酯分解成脂肪酸和甘油或进行其逆反应，在油-水界面及非水介质中催化酯的水解和合成，酯交换，催化生物表面活性剂、高聚合物、多肽和手性药物的有机合成反应等[1]。

目前，脂肪酶已广泛应用于食品、香料、医药、化妆品、洗涤剂、皮革、药物合成、有机合成等领域[2-4]。

微生物脂肪酶因其具有较动植物脂肪酶更好的稳定性、选择性、底物特异性、更广的作用pH值和温度范围，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，便于工业化大生产和获得高纯度样品，因此成为工业脂肪酶的最重要来源。

大庆师范学院本科生毕业论文蛋白酶产生菌培养条件的条件优化院(部)、专业生命科学学院生物技术研究方向微生物学学生姓名朱琳学号200901122598指导教师姓名张亦婷2013年06月01日摘要采用大庆师范学院生命科学学院花园附近土壤、农田土壤及体育场附近土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。

通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃。

关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化AbstractThe sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: carbon source is sucrose 15g/L; nitrogen source is Yeast extract 20g/L, the pH is 6.5; fermentation temperature is 35℃.Key words：Screening；Identified；Protease；Conditions optimization目录摘要 (1)Abstract (2)1 引言 ...........................................................................................................................................................2 材料与方法 (3)2.2.2 实验材料 (3)2.2.1 菌株筛选 (3)3.1 菌株筛选 (6)3.1.1 菌株的分离筛选 (6)2.3 条件优化 (7)2.3.1 不同碳源对产酶的影响 (7)2.3.3不同氮源对产酶的影响 (8)2.3.4 培养基不同初始pH值对产酶的影响 (9)2.3.5 不同温度对产酶的影响 (10)4 结论 (10)11 引言蛋白酶是催化蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。

根霉在发酵工业与环境科学中的研究进展刘金梅;张凤英【摘要】根霉是自然界中广泛存在的一类真菌,千百年来一直是我国数种传统发酵食品的重要优势菌.近年来又发现根霉可利用不同的原料在特定的条件下发酵和代谢生产人们所需的各种产物,如L-乳酸、L-苹果酸、富马酸和脂肪酶等,其代谢产物广泛用于食品、医药及环保等行业.随着根霉菌特殊代谢产物的不断发现,相关产品的研发也越来越受到重视.主要介绍根霉在发酵工业与环境科学中的研究进展.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2013(000)011【总页数】8页(P26-33)【关键词】根霉;酸味剂;酶;平台化合物;安全性农业【作者】刘金梅;张凤英【作者单位】江西农业大学食品科学与工程学院,南昌330045;江西农业大学食品科学与工程学院,南昌330045【正文语种】中文根霉菌属藻菌纲（Phycomcetes）、毛霉目（Mucorales）、毛霉科（Mucoraceae）、根霉属（Rhizopus Ehrenberg），根霉种（Rhizopus spp.），是自然界中广泛存在的一类真菌，千百年来一直是我国数种传统发酵食品的重要发酵菌［1］。

发酵工业中应用的根霉纯种主要是从自然发酵食品和传统酒曲中筛选获得。

根霉属包括米根霉、华根霉和少孢根霉等种。

目前中国工业微生物保藏中心保藏的根霉种主要有14种：雪白根霉（Rhizopus niveus）、少根根霉（Rhizopus arrhizus）、爪哇根霉（Rhizopus javanicus）、米根霉（Rhizopus oryzae）、戴尔根霉（Rhizopus delemar）、华根霉（Rhizopus chinensis）及小孢根霉（Rhizopus microsporus）等。

其中，米根霉（Rhizopus oryzae）是经美国FDA认证的安全菌株，所需营养源简单，是根霉菌种中被研究最多得菌种之一。

根霉的代谢产物如乳酸、富马酸、L-苹果酸及消化酶等有重要的经济价值［2-4］，广泛用于食品、医药及饲料等行业。

一株脂肪酶产生菌的筛选王冬梅;黎志崇;卿圆圆;邱石桥;成子江【摘要】从生活污水取样，以大豆油为惟一碳源，通过富集驯化培养、中性红油脂平板初筛得到29株菌株。

经透明圈法筛选，得到7株透明圈直径（D）与菌落直径（d）比值大于或等于2的菌株．测定各菌株发酵液的脂肪酶活性进行复筛，得到一株高效产脂肪酶菌株X2，其脂肪酶活性为41．7U／mL，所产脂肪酶稳定性较好．根据其形态学及生理生化特征，初步鉴定该菌株为产碱假单胞菌．%Using bean oil as the sole carbon source, 29 lipase - producing strains were isolated from wastewater through enrichment and domesticating method. Seven strains out of the 29 isolates were selected which showed the D/d ratio≥2 by the larger transparent zone. Strains was cultured in fermentation culture medium in which the mass concentration of bean oil was 20g/L. Among the 7 strains. Strain X2 showed the highest lipase activity of 41.7 U/mL and better lipase stability. Based on morphological, physiological and biochemical characteristics, strain X2 was identified as Pseudomonas alcaligenes.【期刊名称】《西北民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(033)003【总页数】4页(P66-69)【关键词】脂肪酶产生菌;分离筛选;酶活【作者】王冬梅;黎志崇;卿圆圆;邱石桥;成子江【作者单位】西北民族大学实验中心,甘肃兰州730030;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730030;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730030;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730030;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730030【正文语种】中文【中图分类】Q939.139脂肪酶(EC3.1.1.3,甘油酯水解酶)是一类酯键水解酶,能够分解油和脂肪产生甘油和脂肪酸,在乳品工业、造纸、化工、新型生物能源等诸多领域有着广泛的应用[1～3].脂肪酶主要是通过产脂肪酶的微生物发酵来生产.脂肪酶在微生物界分布很广,约有65个属的微生物能够产生脂肪酶[3],但进行深入研究的不是太多.分离筛选具有新特性和高活力的脂肪酶生产菌株是一项非常有意义的工作.脂肪酶的生产菌株主要从自然环境中筛选和诱变获得.本文以食用大豆油为惟一限制碳源,对生活污水中微生物群体进行富集驯化培养,通过平板初筛和酶活复筛,以期筛选获得高效的产脂肪酶菌株.1 材料和方法1.1 材料1.1.1 试样来源生活污水.1.1.2 培养基富集培养基(g/L):酵母膏2 g,大豆油5 g,K2 HPO4 1 g,M gSO4·7H2O 0.lg,(NH4)2SO4 1 g,NaCl 0.5 g,pH 7.5.驯化培养基(g/L):酵母膏1.0 g,(NH4)2SO4 5.0 g,K2 HPO42.0 g,NaH2 PO4 2.0 g,大豆油1.0 g,p H7.0.中性红油脂培养基(g/L):蛋白胨10.0 g,牛肉膏5.0 g,NaCl 5.0 g,大豆油10.0 g,1.6%中性红水溶液1 mL,琼脂20 g,pH7.5,121℃灭菌30 min.选择性平板培养基(g/L):(NH4)2 SO4 0.5,K2 HPO4 0.3,NaCl 0.5,MgSO4·7H2O 0.2,酵母粉0.5,琼脂20.0,pH7.2.将上述溶液灭菌冷却至60℃左右加入均质后的2%的三丁酸甘油脂溶液(V三丁酸甘油酯∶V 2%聚乙烯醇=1∶3),用紫外灯照射灭菌30 min以上备用.种子培养基(g/L):大豆油10.0 g,(NH4)2SO4 5.0 g,K2HPO4 5.0 g,MgSO4·7H2O 1.0 g,葡萄糖20.0 g.发酵培养基(g/L):蛋白胨20.0 g,蔗糖 5.0 g,大豆油5.0g,(NH4)2SO4 1.0 g,M gSO4·7H2O 1.0 g,K2 HPO4 1.0 g.1.1.3 仪器设备全温度振荡培养箱、全自动高压灭菌器、干热灭菌箱、冰箱、离心机等.1.2 方法1.2.1 富集驯化培养取1 m L样品加入99 m L富集培养液中,37℃,160 r/min培养3 d.同法二次富集.取二次富集培养液2 mL,加入98 mL驯化培养液,37℃,160 r/min培养3 d.驯化培养两次.1.2.2 初筛将驯化后的菌悬液用无菌生理盐水适当的梯度稀释,选取10-10、10-12、10-14三个稀释度的菌液各0.2 m L,涂布于中性红油脂平板上,37℃培养48 h.挑选平板上显示红色的菌落,经反复划线分离纯化获得纯菌落后,点种于选择性平板上,测量透明圈直径(D)与菌落直径(d),选取D/d比值大于2的菌株,接种至斜面,冰箱保藏待用. 1.2.3 复筛将初筛的菌株接种于30 m L种子培养基中,37℃、160 r/m in培养24 h制成种子液.按3%的接种量,将种子液转接至100 mL发酵培养基中,于37℃、160 r/min培养3 d.取出,将发酵液离心,取上清液测脂肪酶酶活.1.2.4 脂肪酶活性测定[9]发酵液中脂肪酶活性测定采用秦华明改良方法[3].酶活单位定义:37℃下,10 min油脂水解反应,每产生1μmol脂肪酸的脂肪酶量定义为一个脂肪酶国际单位(U/mL).1.2.5 菌株脂肪酶稳定性的测定将发酵液室温放置5个月,测定其酶活,观察各菌株所产脂肪酶的稳定性.2 结果与分析2.1 脂肪酶产生菌的筛选经富集驯化培养、中性红油脂平板初筛,从生活污水试样中分离出29株红色菌株,纯化后点种选择性平板,筛出7株D/d比值≥2的产脂肪酶菌株,结果见表1.表1 菌株的透明圈直径(D)与菌落直径(d)菌株透明圈直径(D/mm)菌落直径(d/mm) D/d值菌株透明圈直径(D/mm)菌落直径(d/mm) D/d值X1 13 6.5 2 X10 6 3 2 X2 8.5 3.2 2.7 X11 8 3.2 2.5 X4 12 6 2 X12 8 3.8 2.1 X5 12.5 6 2.1 X13 不明显 2.2 X7 4 2.8 1.4 X14 不明显 2 X8 12 5.3 2.32.2 复筛菌株脂肪酶活性测定采用酸碱滴定法来测定复筛菌株发酵液中的脂肪酶活性,发酵液室温放置5个月后再次测定其酶活.两次酶活结果见图1.从图中可以看出,各菌株的发酵液经长时间室温保藏后,酶活性均有不同程度的下降.X2菌株的两次酶活均最高,分别达41.7U/mL和34.8 U/mL,所产脂肪酶在室温条件下保存5个月,仍具有83.5%的残余酶活,说明其酶活的稳定性较好.X8菌株首次酶活也较高,达41.3 U/mL,但酶活稳定性差,相对酶活仅70%.经复筛筛选出高效产脂肪酶菌株X2,作为进一步研究的对象. 图1 酶活测定结果2.3 菌株X2的初步鉴定2.3.1 菌株的菌落及菌体形态特征形态图2 X2的菌落形态图3 X2的菌体形态X2菌株的菌落淡黄色圆形,直径3.5 mm,边缘整齐,表面光滑(图2).菌体形态为革兰氏阴性杆菌,大小为2.1×0.12μm(图3).2.3.2 菌株X2的生理生化试验对菌株X2的部分生理生化特征进行了研究,实验结果见表2.表2 菌株X2的生理生化试验结果注:“+”呈阳性;“-”呈阴性.生化试验结果生化试验结果生化试验结果生化试验结果甘露醇 - 蔗糖 - 乳糖 - 卫矛醇 -甘露糖 - 葡萄糖 - 棉籽糖 - 水杨苷 -尿素酶 + 吲哚产生 - 半乳糖 - V-P +H2 S + 麦芽糖 - 海藻糖 - 甲基红 -精氨酸双水解酶 + 山梨醇 - 鸟氨酸脱羧酶 + 赖氨酸脱羧酶 -枸橼酸盐 + 山梨糖 - 阿拉伯糖 - 蕈糖 -结合菌株形态学特征和一系列生理生化实验,对照第八版《伯杰细菌鉴定手册》,初步确定高效产脂肪酶菌株X2属于产碱假单胞菌属.3 讨论在产脂肪酶菌株的筛选中,有些在中性红油脂平板上呈现出红色的菌株,在选择性平板上并不产生透明圈,这些菌株可能为不产脂肪酶的菌株,它们在代谢过程产生的酸性代谢产物,使中性红油脂平板也呈现红色,出现了初筛的假阳性现象.透明圈的大小与菌株产酶能力有一定关系,应用透明圈法可将产酶菌株选出.菌株的筛选最好联用几种方法,提高筛选的准确性.脂肪酶酶活测定是在油脂乳化液体系下,通过酸碱滴定方法检测反应释放的脂肪酸或甘油来间接检测酶活力.在采用同样酶活测定方法的条件下,文献报道筛选到的产脂肪酶菌株的酶活力多集中在15.5 U/mL至200 U/mL之间[4～6],本实验筛选到的菌株X2酶活达41.7 U/m L,酶活力相对较高,表明该菌株具有一定的应用开发潜力.菌株X2的筛选为后续的诱变育种及脂肪酶基因的克隆等奠定了基础.参考文献:[1]马歌丽,高建奇,张志刚,等.根霉脂肪酶产生菌筛选及发酵培养基研究[J].食品工业科技,2006,27(22):12-13.[2]肖春玲.微生物脂肪酶的研究与应用[J].微生物学杂志,1997,17(4):47-51.[3]秦华明.高效油脂降解菌的筛选及其对油脂废水的强化处理研究[D].广州.华南理工大学食品与生物工程学院生物工程系,2003,40-41.[4]曾璐,林亲录,王伟.脂肪酶产生菌产酶条件的研究[J].现代食品科技,2007,23(7):15-21.[5]张博,杨江科,苏华武,等.脂肪酶产生菌的筛选、鉴定及其产酶条件优化[J].生物技术,2007,17(1):23-26.[6]BAPIRAJU K,SUJATHA P,ELLA IA H P,etal.Sequentialparametricoptimization of lipasep roduction by amutant strain Rhizopus sp[J].Journal of Basic M icrobiology,2005,45(4):257-273.。

关键 词 ：阴沟 杆 菌 ；酶 学 特 性 ；脂 肪 酶 提 取 ；酶 固定
中 图 分 类 号 ：Ｑ ８ １ ４ 文 献 标 识 码 ：Ａ
Ｏ 引
言
目前 ， 微 生物 已被 广泛 应 用 于工 业 发酵 ［ １ ］ ， 生产 乙醇 、 食 品及 各 种 酶 制剂 ， 还 被 用 于 降解 塑 料 ］ 、 处 理 废水 废 气 ］ ， 甚 至 用 于产 能 产 氢ｌ ＿ ７ 等 工程 ． 产 脂 肪 酶微 生 物 是 工业 用 脂 肪 酶 的重 要来 源 之 一 ＿ ｇ ］ ， 脂 肪
的 固定 效 率 ， 为脂肪 酶催 化 生产 生物 柴油 提供 新菌 种．
１ 实 验 部 分
１ ． １ 样 品 采 集
采集 天津 市某 肉联 加工 厂 区 内的富 油土壤 ． １ ． ２ 培 养基 和试剂 配 制
Ｉ ． ２ ． １ 富集 培 养基 ： 葡 萄糖 ２ ． Ｏ ， 蛋 白胨 １ ． Ｏ ， 酵母 浸膏 ０ ． ５ Ｖ ｏ ， 食 用 橄榄 油 ２ ． Ｏ ， 蒸 馏水 １ ０ ０ ｍＬ， １
收 稿 日期 ：２ ０ １ ２ － １ ２ １ ５ 基 金 项 目 ：中 央 高 校 基 本 科 研 业 务 费 项 目（ ６ ５ ０ １ ０ ４ ５ １ ）
ｓ ｈ ｅ ｎ ｂ ｘ ＠ｎ ａ ｎ ｋ ａ ｉ ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ｎ
作者简介 ： 唐雪娇 （ １ ９ ８ Ｏ 一） ， 女， 辽宁大连人 ， 讲师， 主 要 从 事 环 境 污 染 治 理 与 废 物 资 源 化 利 用 技 术 开发 研 究 ． 通讯作者 ： 沈伯雄 （ １ ９ ７ １ 一） ， 男， 福 建 莆 田人 ， 教授 ， 主 要 从 事 环 境 污 染 治 理 与 废 物 资 源 化利 用 技 术 开 发 研 究 ．ｅ ｍａ ｉ ｌ ：

中实现表达。
五、脂肪酶的发酵生产及分离纯化
产脂肪酶发酵分两类: 固体发酵和液体发酵法。相对液体发酵法，固体发酵
生产脂肪酶具有简洁，经济的优点 。
影响菌株发酵产脂肪酶的因素有： 氮源、碳源、底物诱导剂、表面活性剂、矿物质、pH,
培养温度、摇床转速、培养时间、接种量等。
（1）发酵培养基
有机氮源:
大豆粉、大豆饼粉、大豆蛋白、业麻饼粉、奶粉、酪蛋白、蛋白陈、酵母膏、 牛肉膏、玉米浸汁和无机氮硫酸钱、硫代硫酸钱、氯化氨、磷酸氢氨、磷酸二 氢氨等
碳源
包括13种碳水化合物如葡萄糖、淀粉、麦芽糖、乳糖、甘露糖等和15种油 脂如荷荷芭油、玉米油、豆油、棕搁油、橄榄油、业麻油等
表面活性剂
包括吐温系列、Span系列、Triton x-405等
发酵培养基优化
由碳源、氮源诱导物及常见的无机盐等组成 。
速效碳源
如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等有利于细菌脂肪酶的形成，而缓效碳源如 玉米粉和小麦粉等则有利于真菌脂肪酶的形成。
(2)最适pH及pH稳定性
脂肪酶最适pH受多种因素影响，如来源、底物 种类和浓度、缓冲液种类和浓度等。来源不同脂肪 酶，在一定条件下都有其特定最适pH和pH稳定范 围。大多数细菌脂肪酶的最适pH值在中性或碱性 范围内，稳定范围一般在pH值为4.0-11.0。真菌脂 肪酶pH值稳定范围较宽，如红曲酶保持基本活力 的pH值范围在pH4.0-6.0，少根根霉脂肪酶的酶活 在pH值为6.0-8.0的范围内都较稳定毛根霉脂肪酶 的pH值稳定范围为7.0-10.0。
大豆粉大豆饼粉大豆蛋白业麻饼粉奶粉酪蛋白蛋白陈酵母膏牛肉膏玉米浸汁和无机氮硫酸钱硫代硫酸钱氯化氨磷酸氢氨磷酸二碳源包括13种碳水化合物如葡萄糖淀粉麦芽糖乳糖甘露糖等和15种油脂如荷荷芭油玉米油豆油棕搁油橄榄油业麻油等表面活性剂包括吐温系列span系列tritonx405等发酵培养基优化由碳源氮源诱导物及常见的无机盐等组成速效碳源如葡萄糖蔗糖麦芽糖等有利于细菌脂肪酶的形成而缓效碳源如玉米粉和小麦粉等则有利于真菌脂肪酶的形成

高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究研究目标本研究旨在筛选高产纤维素酶的菌株，并优化其产酶条件，以提高纤维素降解效率和产酶量。

方法1. 菌种收集与筛选1.收集土壤、水源等环境样品，分离出潜在的纤维素酶产生菌株。

2.通过平板培养和传代培养，筛选出具有纤维素酶活性的菌株。

2. 纤维素酶活性测定1.利用Congo Red染色法测定菌株的纤维素酶活性。

2.选择具有较高纤维素酶活性的菌株作为后续研究对象。

3. 优化产酶条件1.确定最适pH：在不同初始pH值下培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。

2.确定最适温度：在不同培养温度下培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。

3.确定最适碳源：使用不同碳源（如纤维素、木质素等）培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。

4.确定最适氮源：使用不同氮源（如蛋白质、尿素等）培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。

4. 鉴定菌株1.利用生化和分子生物学方法对优选出的菌株进行鉴定，确定其属于哪个科、属、种。

2.利用16S rRNA基因序列分析确定菌株的系统发育关系。

5. 产酶机制研究1.利用电镜观察菌株在不同培养条件下的形态结构变化。

2.利用基因组学方法分析纤维素酶基因在不同条件下的表达情况。

发现1.从环境样品中筛选出了多个具有纤维素酶活性的菌株，其中某一菌株表现出较高的纤维素酶活性。

2.最适pH为7.0，最适温度为50℃，最适碳源为纤维素，最适氮源为蛋白质。

3.经鉴定，该菌株属于纤维素酶产生菌属，并命名为XX菌株。

4.电镜观察发现，在最适产酶条件下，XX菌株的纤维素酶形态结构清晰可见。

5.通过基因组学方法分析，发现XX菌株在最适产酶条件下纤维素酶基因的表达水平较高。

结论1.通过本研究筛选出了一株高产纤维素酶的菌株XX。

2.最适产酶条件为pH 7.0、温度50℃、碳源为纤维素、氮源为蛋白质。

3.该菌株具有潜力应用于纤维素降解和生物质转化领域。

4.通过深入研究其产酶机制，可以进一步优化该菌株的产酶性能和应用前景。

微生物的发酵与产酶过程微生物的发酵与产酶过程是一种重要的生物技术，在食品工业、药品制造以及环境保护等领域扮演着重要角色。

微生物发酵通过利用微生物的代谢作用，将有机废弃物转变为有用的化合物，产酶则是指微生物在发酵过程中产生并分泌的特定酶类。

本文将从微生物发酵和产酶的定义、发酵与产酶的应用以及发酵与产酶的前景等方面来探讨微生物的发酵与产酶过程。

一、微生物发酵和产酶的定义微生物发酵是指在合适的条件下，利用微生物的代谢活动，通过控制发酵过程，获得所需产物的一种生物技术。

微生物发酵一般分为液态发酵和固态发酵两种形式。

液态发酵常用于大规模工业生产，而固态发酵则更适用于小规模生产和特定产品的制备。

产酶是微生物在发酵过程中分泌的特定酶类，这些酶能够催化特定底物的转化反应。

产酶的种类很多，包括脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶等。

这些酶在医药、食品、化工等行业中具有重要的应用价值。

二、发酵与产酶的应用1. 食品工业中的应用微生物发酵在食品工业中被广泛应用。

例如，嗜酸乳杆菌可以发酵牛奶，制成酸奶。

酸奶中的乳酸菌有助于改善肠道菌群，增强人体免疫能力。

此外，假丝酵母菌的发酵可以产生酵母、面包、啤酒等食品。

2. 药品制造中的应用微生物发酵在药品制造中也起到重要的作用。

通过微生物发酵，可以产生多种药用物质，如抗生素、肽类药物等。

其中，青霉素是一种广泛应用的抗生素，通过青霉菌的发酵生产得到。

3. 环境保护中的应用微生物发酵还可以应用于环境保护领域。

例如，利用微生物发酵处理有机废弃物，可以将废物转化为有机肥料或生物柴油。

这种方法不仅能减少废弃物对环境的污染，还能获得可再利用的资源。

三、发酵与产酶的前景微生物的发酵与产酶技术在许多领域都显示出广阔的应用前景。

随着科学技术的不断发展，微生物的发酵与产酶技术也在不断创新和改进。

以下是展望微生物发酵与产酶技术的几个发展方向。

1. 高效产酶菌株的筛选与改造在微生物发酵过程中，寻找和改造高产酶菌株是提高产酶效率的关键。

菌株生理生化鉴定实验方法菌株的生理生化鉴定是确定菌株的分类地位和特性的重要实验方法。

下面将介绍一种常用的菌株生理生化鉴定的实验方法，包括实验步骤和鉴定结果的解析。

实验步骤：1.菌株的预处理将菌株从培养基上取下，用生理盐水或无菌的蒸馏水洗净，放入灌装好的试管或培养皿中。

2.观察形态特征观察菌株在不同培养基上的形态特征，包括菌落形状、颜色和质地等。

也可以在显微镜下观察菌丝和孢子的形态特征。

3.生化特性鉴定（1）氧需求鉴定：将菌株接种到含有不同浓度的氧气的试管中，观察菌株在厌氧和需氧条件下的生长情况。

（2）温度需求鉴定：将菌株接种到不同温度的培养基上，观察菌株在不同温度下的生长情况和生长速率。

（3）酸碱度鉴定：将菌株接种到不同pH值的培养基上，观察菌株在不同酸碱度条件下的生长情况。

（4）氧化还原鉴定：通过添加不同氧化剂和还原剂来观察菌株的氧化还原反应能力。

（5）酶活性鉴定：利用不同底物和指示剂来检测菌株的酶活性，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等。

（6）碳源利用鉴定：将菌株接种到含有不同碳源的培养基上，观察菌株对不同碳源的利用情况。

4.生理特性鉴定（1）产酸和产气鉴定：将菌株接种到含有指示剂的管中，观察产酸和产气的情况。

（2）抗生素敏感性鉴定：通过将菌株接种到含有抗生素的培养基上，观察菌株对抗生素的敏感性。

（3）生长速率鉴定：观察菌株在不同培养基和条件下的生长速率，包括生长曲线的绘制和计算生长速率。

（4）生殖方式鉴定：通过观察菌丝和孢子的产生情况来确定菌株的生殖方式。

鉴定结果的解析：例如，菌株的形态特征观察结果可以用来确定菌株的属名，生化特性鉴定结果可以用来确定菌株的代谢途径和功能，生理特性鉴定结果可以用来确定菌株的环境适应能力和生长要求。

综上所述，菌株的生理生化鉴定是一种全面了解菌株特性和分类地位的重要实验方法，通过观察形态特征、生化特性和生理特性，可以准确鉴定菌株的分类地位和特性。

真菌脂肪酶
真菌脂肪酶具有温度和pH 稳定性、底物特异性以及在有机
溶剂中具有高活性，且提取成本比较低等优点，因而发展迅
速。 商业化的真菌脂肪酶主要有: 黑曲霉, 米曲霉等。
三、脂肪酶的催化机理
• 脂肪酶的活性中心是丝氨酸（Ser）残基， Ser与天冬氨
酸（Asp）、组氨酸（His）组成的三元组催化中心，正常 情况下，该中心埋在一个或数个 –螺旋结构的“盖子”下 面，受 –螺旋的保护。“盖子”的疏水集团与这个三元组 的疏水区域相结合。这个带有色氨酸（Trp）的盖子具有 两亲性， Trp疏水表面与催化中心的疏水区域相结合，暴 露出的另一端则面向外，与水分子以氢键连接，此时脂肪 酶处于非活性构象。当脂肪酶与界面相接触时，覆盖活性 位点的螺旋结构打开，暴露疏水残基增加与脂类底物的亲 和力，暴露活性位点，同时该变化导致脂肪酶在Ser周围 产生一个亲电区域，可保护催化过程中过度中间产物稳定， 脂肪酶处于活性中心。
五 蜡脂的生产过程
• 利用固定化脂肪酶酶膜，使用价格低廉的大豆油为原料，
在无溶剂体系中催化大豆油和十六醇转酯化反应合成不饱 和的蜡脂。
六 影响蜡脂产率的因素
• 1固定化酶用量对产率的影响
随固定化酶用量增加，反应产率也逐渐 增加到一个极致保持稳定。
• 2底物摩尔比对产率的影响
蜡脂的产率随醇油摩尔比的增加而增加 达到一个最高值，当十六醇继续增加时蜡 脂的产率开始下降。分析主要是十六醇在 反应中的底物抑制作用导致的。
七未来趋势
• 以大豆油和十六醇为底物，固定化酶在无
溶剂体系中催化转酯化反应合成蜡脂。脂 肪酶作为催化剂节能环保使用的固定化酶 为实验室自制，生产成本低，可以考虑利 用此方法实现液态蜡脂的工业化生产。

微生物大实验报告产酶微生物的筛选微生物大实验报告：产酶微生物的筛选一、实验背景酶是一种具有高效催化作用的生物大分子，在生物体内参与各种代谢反应，对生命活动起着至关重要的作用。

在工业生产中，酶也被广泛应用于食品、制药、化工等领域。

然而，天然存在的酶往往不能满足工业生产的需求，因此筛选具有高活性、高稳定性和特异性的产酶微生物成为了获取优质酶的重要途径。

二、实验目的本实验旨在从环境中筛选出能够产生特定酶的微生物，并对其产酶能力进行初步评估，为后续的酶学研究和工业应用提供基础。

三、实验材料与方法（一）实验材料1、样品采集：从土壤、污水、腐烂的植物等不同环境中采集样品。

2、培养基：富集培养基：用于增加目标微生物的数量。

筛选培养基：含有特定底物，以筛选出能够产生目标酶的微生物。

鉴定培养基：用于微生物的种类鉴定。

3、试剂：包括显色剂、酸碱指示剂等。

（二）实验仪器1、恒温培养箱：用于培养微生物。

2、超净工作台：提供无菌操作环境。

3、显微镜：观察微生物形态。

4、离心机：分离微生物细胞和上清液。

（三）实验方法1、样品预处理：将采集的样品进行适当处理，如稀释、研磨等。

2、富集培养：将预处理后的样品接种到富集培养基中，在适宜条件下培养一段时间，使目标微生物得到增殖。

3、平板筛选：将富集培养后的菌液稀释后涂布在筛选培养基平板上，培养后观察平板上的菌落形态和颜色变化，筛选出可能的产酶菌株。

4、摇瓶发酵：将筛选得到的菌株接种到液体培养基中进行摇瓶发酵，培养一定时间后测定酶活。

5、菌株鉴定：通过形态观察、生理生化实验和分子生物学方法对产酶菌株进行鉴定。

四、实验结果与分析（一）筛选结果经过平板筛选，共获得了_____株具有产酶潜力的菌株。

这些菌株在筛选培养基上表现出了不同的特征，如菌落形态、颜色变化等。

（二）酶活测定结果对筛选得到的菌株进行摇瓶发酵后，测定其酶活。

结果发现，菌株_____的酶活最高，达到了_____U/ml，其次是菌株_____，酶活为_____U/ml。