地黄连作障碍机理及其控制技术 1. 地黄连作障碍 1.1 地黄的药用价值及连作障碍现状 地黄(Rehmannia glutinosa Libosch)为玄参科药用草本植物，广泛种植于河南、山西、山东、安徽、吉林等地。地黄的药用价值早在我国最早的药学专著《神农本草经》中就有记述，现代研究认为地黄具有降血糖、保肝、止血、利尿、抗炎、抗真菌等作用。其块根及其加工品分别作为鲜地黄、生地黄和熟地黄入药，属大宗常用中药材(温学森等2002)。目前有近1/4 的中成药中含有地黄，其中包括广为人知的“六味地黄丸”， 这些药物的生产与销售给我国一些制药企业带来非常可观的经济效益，仅“六味地黄丸” 全国就有250多家企业在生产，年销售总额达到40 亿人民币(张中朋2005)。
地黄忌连作，这已是几百年来公认的事实。早在十六世纪明朝卢之颐的《本草乘雅半偈》中就提到地黄连作“种植之后，其土便苦，次年止可种牛漆。再二年，可种山药。足十年，土味转甜，始可复种地黄，否则味苦形瘦，不堪入药也”。该问题至今依然存在，如果连作会导致出苗及生长等方面的问题，如出苗率低、植株弱小，须根增多，不能正常膨大形成具有商品价值的块茎等，严重时导致80%的减产(刘红彦等2006)。由于受到连作障碍的严重威胁，地黄产区不得不逐年易地种植地黄，使得其栽培地越来越远离其最适宜种植地区，质量也因此而受到影响(刘长河等2001)。
1.2 地黄连作障碍机理的研究现状及存在问题 连作障碍普遍存在于小麦、大豆等粮食作物，烟草、棉花和花生等经济作物，辣椒和黄瓜等蔬菜以及占栽培品种60%的根类药用植物如人参、三七、地黄、丹参、贝母、桔梗等(吴连举等2008；赵真真等2008)。虽然对连作障碍已进行过多方面的研究，但都未从根本上揭示连作障碍的产生机制，对连作障碍机理的研究，依然是现代农业可持续发展的热点课题之一。
目前国内外对导致植物连作障碍的原因普遍认为主要有三个方面：①土壤营养元素失衡和理化性质改变(马云华和魏珉2004)。同一种作物长期连作，必然造成土壤中一些元素的亏缺和土壤理化性质如颗粒结构、pH值等的改变，进而影响下茬作物的正常生长，引起植株的抗逆能力下降，病害发生严重。②土壤微生态失调(Benizri et al. 2005；王学翠等2007；喻景权和杜尧舜2000)和病原微生物数量的增加(Baca et al. 2003；解红娥等2007)。长期连作同一作物将改变土壤中微生物的种群结构和数量，有益细菌(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)减少，而有害根际细菌(deleterious rhizobacteria, DRB)或病原真菌数量增加(Baca et al.2003；王金龙2000；吴连举等2008)， 从而影响植物正常生长甚至发病死亡。③化感作用或自毒作用(Yu et al. 2003；张晓玲等2007)。化感作用是指一种植物或微生物(供体)向环境释放某些化学物质(化感物质或化感效应分子)从而影响自身和其他有机体(受体)的生长和发育的化学生态学现象(Rice 1984)。有的化感物质进入土壤会对同茬或下茬植物的生长产生抑制作用(Singh et al. 1999)，当供体与受体属于同一物种时，就称这种抑制作用为自毒作用，而当属于不同的物种时则称为他感作用。
地黄是连作障碍最严重的植物之一，但关于地黄连作障碍机理的研究报道却非常有限。刘红彦等(2006)认为地黄根系分泌物、地黄叶和块茎中的化感物质是造成地黄连作障碍的主要原因(自毒作用)，其中以根系分泌物的化感作用最突出，但未确定化感物质是什么。郝群辉等(2007)对怀地黄根际土壤水提物的GC-MS 分析鉴定了一些已报道的化感物质，也未指出哪些化感物质会抑制地黄生长。因此，关于影响地黄生长的化感物质的种类、来源、作用方式及其在土壤中的维持时间等至今还不清楚，现有研究结果也很难解释地黄栽培1年须间隔8-10年方可再种植的连作障碍现象。
陈慧(2007)和刘峰等(2007)认为根际微生态失调可能是地黄连作障碍的因素之一。其依据是土壤中不同细菌对地黄成分水苏糖和梓醇的利用能力存在差异，推测利用地黄成分能力强的细菌随着地黄连作而成为优势种群，而利用能力差的细菌种群数量将逐渐受到抑制。但地黄根际存在的“优势菌”是什么？是否存在对地黄有害的细菌？这些有害细菌对地黄生长有何影响以及这种影响与连作障碍之间有何关系等问题至今还都是谜。
刘伟(1990)和杨胜亚等(2002)用农药浸种的方法使地黄种苗的出苗率及成活率提高；刘红彦等(2006)对重茬土壤进行灭菌处理，发现灭菌处理后的地黄重茬土壤上栽培的地黄块茎产量显著高于未灭菌的对照；本课题组在07-08年也比较了高压蒸汽灭菌处理前后地黄连作土壤室内栽培地黄的效果，发现经灭菌处理后的地黄连作土壤上栽培的地黄生长良好，而未灭菌处理的地黄连作土壤上栽培的地黄却表现出出苗率下降、幼苗长势差的现象(图1)。由这些实验可以推论，连作土壤中存在着对地黄有害的微生物，且这些有害微生物可能与地黄连作障碍有关，抑制这些有害微生物有可能对克服地黄连作障碍有效。然而，截止目前，还没有人系统调査过地黄根际存在的对地黄有害的微生物种类及数量分布，更无人研究过它们与地黄栽培、地黄连作障碍发生之间的关系。
总之，关于地黄连作障碍的发生机制，尚有许多未解之谜，已有研究结果很难完全解释清楚地黄连作障碍危害严重、持续时间长的特殊现象。因此，有必要进一步寻找引起地黄连作障碍的因子，并了解其影响机理。
1.3 地黄连作障碍的控制 2. 研究结果 2.1 地黄连作障碍的原因 本课题组从2007年开始，和北京中龙创科技有限公司委托，研究地黄连作障碍的形成机理及防治技术，已从连作1-2年的地黄根际土壤和块根表面分离到19株细菌，采用盆栽接种土壤法和地黄植株叶片涂抹法，分别检测了这些细菌本身及其无菌培养液（培养液滤液）对地黄块根出苗以及地黄叶片的影响，主要结果及结论有如下几点：
①有2株细菌的培养液滤液对地黄出苗有抑制作用(15天)，并对叶片有毒害作用(24h)，而直接接种细菌细胞处理对地黄块根出苗以及叶片无任何影响(图2)，说明这两类细菌主要是通过分泌化感效应分子影响地黄生长，是典型的化感细菌；经形态学、生理生化反应以及16S rDNA序列分析，将这两株化感细菌鉴定并分别命名为Pseudomonas sp. DH9 (简称：DH9)和Enterobacter sp. DH13 (简称：DH13)。
②用DH9发酵液滤液浸种地黄块根与将DH9发酵液滤液直接灌入地黄栽培土壤两种处理的结果不同，前者(使用量较小)与空白对照相比幼苗生长势差，后者(使用量大)却不出苗、块根坏死(图3)；反映了发酵液滤液使用量大小和对地黄影响程度之间可能存在量效关系。
③刨出②中各组地黄的块根，发现空白对照块根下面已生出新根，而发酵液滤液浸种地黄块根及灌土均无新根萌发(图4)，说明发酵液滤液中的化感效应分子除了影响地黄出苗和幼苗生长外还影响地黄块根生根。
④向DH9液体培养基中添加不同量的地黄块根汁液，可使DH9和DH13生长速度提高1-3倍(图5)，说明地黄成分能够促进化感细菌的分裂增殖。
⑤在活性检测指导下初步分离了DH9发酵液滤液中的化感效应分子，该效应分子可经大孔树脂吸附、甲醇洗脱、硅胶柱和Sephadex LH-20进行初步分离纯化，所得活性组分用GC-MS分析未发现已报道的化感物质。另外，用吡啶联苯胺比色法测定活性组分，也未检测出含氰化合物，表明DH9产生的化感效应分子可能是未知的化感分子。
基于前人的研究成果和本实验室获得的初步结果，我们推测，根际化感细菌可能与地黄连作障碍有关，甚至化感细菌在土壤中长期存在并分泌化感效应分子可能是导致地黄连作障碍时间长（种植1茬后须间隔8-10年才能再次种植）的主要原因。化感细菌与地黄连作障碍的关系可能是：化感细菌是一种土壤常在菌，栽培地黄促进土壤中该类细菌生长，使其成为优势种群；化感细菌反过来通过分泌化感效应分子抑制地黄生长，地黄连作将导致其影响进一步加重；由于化感细菌可长期存活于土壤中，使得地黄种植一茬后很长时间不能再种植。这一假说整合并丰富了目前关于地黄连作障 碍的微生态失调理论与化感作用理论，将为探讨地黄连作障碍的特殊之处提供新的途径。
2.2 地黄连作障碍的防治 根据地黄连作障碍的化感细菌侵染假说，我们于2010年4月11日在山西临汾洪洞县淹底乡杨岳村安排了不同药物防治的区组实验，包括抗生素处理组、拮抗菌菌液处理组、菌肥处理组、抗生素与菌肥联合处理组，以多菌灵阳性对照组和水为阴性对照组。实验设计见表1。除了菌肥处理组采用沟施外，其它处理均为浸种30min，每处理播种块根60个，种子于播种前1天从种子地中挖出，地块为种植一年（连作1年）的300平方米地黄土地（种植地黄前施5立方米左右羊粪基肥）。重复3次。调查数据进行One-way ANOVA分析，其中百分数均进行反正弦转换。
2.2.1 不同抗生素对地黄连作障碍的防治效果 除多菌灵处理的植物数显著低于空白对照外，三种抗生素及其组合处理对地黄植物数和块根数没有显著差异，表明抗生素处理不影响地黄植株的生长。
（1）对地黄生长的影响
KTSKThKTlTShTSlKShKSlKSThKSTlCarbendazimH2O01020304050
株数(株)
2.2.2 不同菌液对地黄连作障碍的防治效果 （1）对地黄生长的影响
