非蛋白氮的定量检验

非蛋白氮的定量检验在非蛋白氮定量的检测方法中，比较常用的方法是硫酸铜沉淀法和氨基酸测定法。

除此之外，本文根据非蛋白氮的组成结构的不同，采用水解蒸馏法对样品中的非蛋白氮进行检验。

一、硫酸铜沉淀法根据非蛋白氮的化学性质来看，大部分溶于水，一部分在常温下不溶水，但在沸水中溶解。

根据此种性质，可以先将样品煮沸，用硫酸铜将样品中的蛋白质沉淀下来，由于非蛋白氮已经溶于水，故可用过滤方法将其与样品中的蛋白质分离。

在过滤时，水的温度一定不能太低，否则象双缩脲一类的物质会因为不溶于常温水而不能被过滤掉。

用此种方法测定出的蛋白质含量称为样品的真蛋白质。

但实际上，此种方法有很大的局限性。

如果非蛋白氮不溶于沸水，或者将一般的非蛋白氮微囊化，此种方法测出的结果会与样品中的实际真蛋白有很大的差异。

二、氨基酸测定法为了真正能够判定样品中是否掺有非蛋白氮，需测定样品中的氨基酸含量。

无论采用经典的氨基酸自动分析仪分析（柱后衍生），还是采用比较快捷的HPLC分析（往前衍生），将所测定的氨基酸总量相加得到一个总氨基酸数值，然后将此数值乘以6.25为M，和用凯氏定氮法测定的粗蛋白质N相比较，M至少为N的85％（M可能略大于N）。

如果低于此数值，则可以判定该样品中掺有非蛋白氮。

三、水解蒸馏法1、原理：非蛋白氮主要包括五类：尿素及其衍生物类、氨态氮类、铵类、肽类及其衍生物、动物粪便及其它废弃物类。

如果在原料中掺有氨态氮类、铵类和粪便比较容易判断（可采用硫酸铜沉淀法加镜检），一般很少将肽类及其衍生物掺入其中，剩下比较难鉴别的就是尿素及其衍生物。

尿素和尿素衍生物经过强酸或强碱水解为氨盐或氨和其它的物质，在强碱的条件下可以蒸馏出氨气，原料中的蛋白质经过水解成氨基酸盐，氨基酸盐在强碱条件下稳定，从而可将非蛋白氮和真蛋白氮进行分离。

2、仪器和设备：酒精喷灯，试管和其它常用的仪器。

3、试剂与溶液：6mol/l 的盐酸溶液和其它常用的试剂。

4、测定方法：本文只列出用酸水解的方法。

采集有代表性样品约100g ，混匀后用四分法缩分出209左右，将其粉碎，使其全部通过60目样品筛。

精确称取0.3000g 的样品，置于容积为60ml 的试管底部（注意样品勿沾在管壁上），加入30ml 6mol/l 的盐酸溶液，将试管在距试管口1～2cm 处用喷灯加热并封口。

将封好的试管置于干燥箱内，于110℃下水解24h 。

冷却后打开试管，将水解液过滤至100ml 容量瓶中，用蒸馏水反复多次冲洗试管和滤纸，然后定容至刻度。

用10ml 移液管移取10ml 样液移入半微量式定氮仪的反应室中，加入20ml 1∶1的氢氧化钠溶液蒸馏10 min ，余下的步骤按照测定粗蛋白的方法进行操作，得出样品所消耗的盐酸的体积为V 1（ml ）。

同时作空白滴定可得消耗的盐酸的体积为V 0，设所称样品的质量为M （g ）。

5、非蛋白氮的粗蛋白质计算公式CP(%)＝（V 1-V 0）×C×O.14×6.25/M非蛋白氮的概述和检测方法文章来源：饲料工业 更新时间：2002-11-7 点击数： 1230曾 俊 苏俊黎1 非蛋白氮的概述非蛋白氮大致可以分为以下几类，①尿素及其衍生物类，如缩二脲、羟甲基尿素等；②氨态氮类，如液氨、氨水等；③铵类，如硫酸铵、氯化铵等；④肽类及其衍生物，包括氨基酸、酰胺、胺等；⑤动物粪便及其它废弃物类。

以下是几种常见的非蛋白氮的介绍：1．l 双缩脲又称缩二脲，是一种尿素缩合产品，其含氮量在35％上，蛋白质当量为219％。

缩二脲难溶于水，一般的定量检验方法为紫红色配位化合物比色法（原理：鱼粉中的双缩脲经抽提后，在酒石酸钠的碱性溶液中与硫酸铜生成紫红色配位化合物，在550nm波长下比色从而测出其含量）。

1．2 尿素是氮和二氧化碳在高温高压下化合而成。

纯尿素的含氮量为47％，折合蛋白当量为293．75％。

易潮解，易溶于水，一般的定量检验方法有二种：一种为二甲基氨基苯甲醛显色法；另一种为二嗪衍生物显色法。

但以上两种方法只能测定游离性尿素而不能测定其衍生物。

1．3 尿素甲醛聚合物是由尿素和甲醛聚合而成，其含氮量为38.89％，折合蛋白当量为243．06％。

该聚合物难溶于水。

1．4 硫酸铵俗称肥田粉，其含氮量为20％左右，折合蛋白当量为125％。

硫酸铵的工业品一般为白色或微带黄色的结晶，易溶于水，其分子式为（NH4）2SO4。

1．5 异亚丁基二脲又名二脲异丁烷，简称IBDU，为尿素和异丁醛在催化剂的作用下综合反应生成。

IBDU为一种子的白色粉末或颗粒，总含氮量为32．18％，折合蛋白当量为201.13％，吸湿度远低于尿素。

以上是比较常见的非蛋白氮物质。

随着科技的发展，还会有越来越多的非蛋白氮物质被合成出来，从而使反刍动物所用的非蛋白氮使用广泛，而掺假者很容易将此物质掺入饲料原料中以提高原料的粗蛋白质。

2 非蛋白氮的检验2．l 非蛋白氮的定性检验在对原料样品的检测中，一般有定性检测和定量检测。

在定性检测中，使用的比较多的为显微镜检，包括直接镜检、分层镜检（用四氯化碳或三氯甲烷分层）、反应剂镜检（用化学物质和样品中的某些物质反应而在显微下区分）、染色镜检等。

在使用的过程中，往往使用一项或多项镜检方法对样品中的物质进行判定。

对于非蛋白氮的检验，显微镜检是一种比较有效的方法。

在对样品的检测中，一般使用的是生物显微镜，其放大的倍数在36～400倍之间，为了获得更好的显微效果，可以根据实际情况作出具体的调整。

以下是镜检使用过程中的一些技巧：2.1.l 直接镜检直接镜检一般所用的倍数比较小，通过对样品不同的物理特征，如颜色、透明度、表面组织、形状等物理性状进行判定。

特别的要与典型的样品进行比较，以便能够更好区分样品与杂质的不同。

在直接镜检中，用不同的滤光片有时可以起到比较明显的效果。

虽然直接镜检比较方便和直观，但有时对于样品中的物质很难区分时，可以用其它的检验方法。

2.1.2 分层镜检将样品用四氯化碳进行脱脂和比重分离之后，样品与其它物质的区分会更加容易。

对样品中的有机物和无机物分层之后，需在常温下干燥后再进行镜检。

非蛋白氮一类的物质与原料的很多外观性质很不一样，通过两者的特异性之间的观察，可以对样品中是否掺有非蛋白氮一类的物质作出一个大概的判断。

2．1．3 反应剂镜检用反应剂和样品进行反应，非蛋白氮一类的物质的化学性质和样品不一样，通过此种方法可以对样品中的非蛋白氮进行鉴别。

经过四氯化碳分层之后，再与反应剂反应是比较好的一种方法。

而镜检时在样品中加一滴或数滴浓硫酸，观察样品与浓硫酸反应的情况是一种比较直观的鉴别方法。

因为无论动物蛋白还是植物蛋白，其与浓硫酸的反应速度和产生的现象比较明显。

2.1.4 染色镜检用染色剂对样品进行染色，使样品中的植物或动物细胞染成不同的颜色，而非蛋白氮一类的物质则和样品的染色后的表现不同，通过此种方法使两者区分开来从而加以鉴别。

以下是比较常用的染色方法：对植物细胞的染色方法：番红——固绿染色法。

取适量脱胎（视样品脂肪多少而定，可以用四氯化碳，也可以用丙酮，对于脂肪少的也可以不用脱脂）样品于烧杯中，用1％的番红水溶液浸泡l～3h 水洗（去多余的染料）。

将样品涂在玻片上，稍晾干。

滴加 0．l％的固绿（溶剂用 95％乙醇）。

过 15s 后滴加 95％的乙醇，冲去多余固绿染料。

待乙醇稍挥发后，加甘油液（甘油:水＝1:1）浸润，加盖玻片。

用生物显微镜检查。

染色结果：细胞核，木质化细胞壁呈鲜红色，纤维素细胞壁、细胞质呈绿色。

因为非蛋白氮没有细胞核、细胞质等结构，所以只要能够较好的掌握染色技巧，其对比效果比较明显。

当然，不能从染色效果判断其一定为非蛋白氮。

对动物细胞的染色方法：苏木精——曙红对染法。

取适量的脱脂样品于烧杯中，加入埃利希苏木精染色液浸泡3～5min，水洗数次（用5min左右）。

将样品涂在玻片上，滴加氨水。

3～4s后立即满加水，洗l min，稍晾一下，加 0.2％曙红水溶液浸润 3min，滴加 95％的乙醇，洗去多余曙红染料。

再稍晾一下，加甘油浸润，加盖玻片，用生物显微镜观察。

其染色的结果为：细胞核呈蓝色，细胞质呈淡红色。

通过此种方法染色，一般能够很容易的区分样品和非蛋白氮一类的物质。

为了能够更清晰的在显微镜下区分样品与杂质，也可采用以下方法（对于检验鱼粉一类的物质比较有效）：先用四氯化碳或三氯甲烷对样品分层，除去无机物，必要时再用丙酮进行脱脂，再取一定量的样品置入蒸馏水中，搅拌，除去溶于水的物质，再用60目或80目的样品筛过滤，将样品放入50～60℃的烘箱中进行烘干（时间不能过长，以保持样品原来的状态），然后在显微镜下进行检验或再对其进行处理后镜检。

在显微镜检中，只能对非蛋白氮作初步判断。

若要进一步的分析判断，还需进行定量分析检验。

2.2 非蛋白氮的定量检验在非蛋白氮定量的检测方法中，比较常用的方法是硫酸铜沉淀法和氨基酸测定法。

除此之外，本文根据非蛋白氮的组成结构的不同，采用水解蒸馏法对样品中的非蛋白氮进行检验。

2.2.l 硫酸铜沉淀法根据非蛋白氮的化学性质来看，大部分溶于水，一部分在常温下不溶水，但在沸水中溶解。

根据此种性质，可以先将样品煮沸，用硫酸铜将样品中的蛋白质沉淀下来，由于非蛋白氮已经溶于水，故可用过滤方法将其与样品中的蛋白质分离。

在过滤时，水的温度一定不能太低，否则象双缩脲一类的物质会因为不溶于常温水而不能被过滤掉。

用此种方法测定出的蛋白质含量称为样品的真蛋白质。

但实际上，此种方法有很大的局限性。

如果非蛋白氮不溶于沸水，或者将一般的非蛋白氮微囊化，此种方法测出的结果会与样品中的实际真蛋白有很大的差异。

2.2.2 氨基酸测定法为了真正能够判定样品中是否掺有非蛋白氮，需测定样品中的氨基酸含量。

无论采用经典的氨基酸自动分析仪分析（柱后衍生），还是采用比较快捷的HPLC分析（往前衍生），将所测定的氨基酸总量相加得到一个总氨基酸数值，然后将此数值乘以6.25为M，和用凯氏定氮法测定的粗蛋白质N相比较，M至少为N的85％（M可能略大于N）。

如果低于此数值，则可以判定该样品中掺有非蛋白氮。

2.2.3 水解蒸馏法原理非蛋白氮主要包括以下五类：尿素及其衍生物类、氨态氮类、铵类、肽类及其衍生物、动物粪便及其它废弃物类。

如果在原料中掺有氨态氮类、铵类和粪便比较容易判断（可采用硫酸铜沉淀法加镜检），一般很少将肽类及其衍生物掺入其中，剩下比较难鉴别的就是尿素及其衍生物。

尿素和尿素衍生物经过强酸或强碱水解为氨盐或氨和其它的物质，在强碱的条件下可以蒸馏出氨气，原料中的蛋白质经过水解成氨基酸盐，氨基酸盐在强碱条件下稳定，从而可将非蛋白氮和真蛋白氮进行分离。

仪器和设备：酒精喷灯，试管和其它常用的仪器。

试剂与溶液：6mol／1的盐酸溶液和其它常用的试剂。