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慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤

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、包装细胞 293T 细胞的培养 一、 293T 细胞的冻存 1. 随着传代的次数增加， 293T 细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞 购进时就进行冻存。

2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 3. 倒去细胞上清液，加入 D-Hank's 液洗去残留的培养基。 4. 加入 0.25% 的胰酶，消化 10-20s 后倒去。 5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。 6. 细胞计数。 7. 将细胞离心， 1000rpm ， 2min 。 8. 根据计数结果加入细胞冻存液 （70% 完全培养基 +20%FBS+10% DMSO ）重悬细 胞，密度为3X 10 6个/ml。

10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。 二、 293T 细胞的传代 1. 当细胞生长至汇合率达到 80~90% 需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维 持细胞良好的生长状态。

2. 消化细胞，方法同上。 5 3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为 3 X10个/ml。

4. 分到 10cm 培养皿中， 10ml/ 皿。 三、 293T 细胞的复苏 1. 当细胞传代次数过多（超过 50 代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要 丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。

2. 打开水浴锅，设置温度为 40 C。 3. 查看细胞库记录， 根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞 （需戴上棉手套， 防止被冻伤） ， 迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在 1~2 min 内使细胞溶液完全溶解。

4. 将 1ml 细胞溶液加入 9 ml 完全培养基中并混匀后转入 10cm 培养皿。 5. 放回37 C、3%CO 2和95%相对湿度的培养箱中培养。 6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入 10ml 新鲜培养基。 二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定 1. 所用病毒检测引物为 WPRE 特异引物，序列如下 5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer), 5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and 5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)

2. TaqMan Uni versal PCR Master Mix (Applied Biosystems , cat. no. 4304437)

3. TaqMan DNA Template Reage nt Kit (Applied Biosystems 401970)

用于包装的293T细胞的培养 用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268) 必需选择处于生长旺盛期，细胞状态 较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。任何时候细胞汇合率都不准达 到 100%。

慢病毒的包装 1. 预先准备3个T150 瓶的293T 细胞，培养基为 DMEM + 10% FBS ，1% Glutamax ， 1% 青霉素-链霉素。

2. 将细胞分到12分到12个T150瓶中，每瓶的细胞密度是 8 X10 6个。

3. 第二天，镜下检查细胞。细胞融合度应大致为 30-40% ，分布均匀。 4. 转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入 20ml的Opti-MEM 培养 基，将细胞送回培养箱。

5. 取两支无菌的 50ml离心管，其中一支中加入 252 卩g pNLEGFP/CMV/WPREDU3 载体质粒，168卩g pCD/NL -BH*DDD 包装质粒和 84卩g pLTR -G质粒，用Opti-MEM 培养基补齐到 18ml。另一支中加入 500卩l Trans -EZ溶液和17.5 ml Opti-MEM 培 养基，用电动移液器轻轻混匀。 将Trans-EZ 稀释液滴加到质粒管中， 边加边轻轻晃匀。

cat. no. 4. TaqMa n RNaseP con trol reage nt (Applied Biosystems cat. no. 4316844)

SunBio IV Victor * + MVJ Ira ：sJuUion

Packaging Cel] 关键步骤：推荐使用 Qiagen质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。 6. 室温孵育20分钟，使DNA和Trans-EZ 充分结合形成转染复合体。 7. 取1支5ml的移液管，将得到的 DNA-Trans-EZ 复合体均匀滴加入到细胞培养板 中，每板3ml。来回晃动培养板，混匀后放回到 5%二氧化碳培养箱。每一皿细胞培养 盘不要超过6盘。

8. 6小时后，移去细胞上清，更换为 17ml的DMEM完全培养基。 9. 转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接近 60-80% 。如果所 转染质粒带有 GFP荧光，那么这时候可以看到大于 95%的细胞都是带有荧光的。

10. 将细胞送回培养箱继续培养 2天（36-48小时）。在这个过程中，细胞会逐渐融合 形成多核体，大多数的细胞依然贴壁。

11. 收集所有的上清，分装到 50ml离心管中。 12.4 C, 500g离心10分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片。 13.总的上清约为204 ml，用250- ml 0.45 卩m PVD过滤装置过滤。如果发现滤膜 被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新的滤器。

慢病毒的浓缩与纯化 方法一超速离心沉淀法 离心管，用70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫 2. 每个 Ultra-clear SW28 离心管中加入约 32ml 的预先处理的病毒上清液。 1.取 6 个 Ultra-clear SW28

外灯继续消毒30分钟。

1供曲口的等边的转榕截停

与€11•戦体苑曾对匂餐砸 ?皑箱購帚 *盯花叮刀軒魯笄再懐 3. 取一支 10ml 的移液管，吸取 12 ml 20% 的蔗糖溶液。将移液管一直插入到离心管 的底部，缓慢将蔗糖溶液打出 4 ml 。同样地，将剩下 8 ml 的蔗糖溶液分别加入到另两 个离心管中。另取一支干净的移液管，对剩下 3 管进行同样处理。

4. 用 PBS 调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过 0.1g 。 5. 按次序将所有 6 个离心管放入 Beckman SW28 超速离心转头中。 7. 小心将管子从转头中取出。倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置 10 分钟使剩余的 上清流干。吸掉剩余的液滴。在管底应当有可见的沉淀。

8. 每管中加入 100ml 不含钙和镁的 PBS 洗下沉淀。 9. 将 SW28 超速离心管插入到 50ml 锥底离心管中，盖上盖子。

10. 在4 C溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。

11.4 C, 500g离心1分钟，使溶液集中于管底。 12. 用200卩I移液器轻柔吹打使沉淀重悬。避免产生泡沫。将所有管中的液体集中到 一个 SW28 离心管中。

13. 集中后的病毒悬液分装成 50卩I每份，保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在 -80 C 。

方法二 PEG-8000 浓缩法 PEG （聚乙二醇）是高分子聚合物，具有高亲水性，在溶液中会吸收大量水分，减少病 毒之间的距离,使病毒与病毒能够很容易的聚合在一起,病毒的相对浓度提高,达到沉 淀浓缩的目的。

5X PEG8000+NaCI 配制称取 NaCI 8.766 g; PEG8000 50g 溶解在 200mI MiIIi-Q 纯水中； 121 摄氏度 30min 湿热灭绝 30min ；保存在 4 C 。

1. 使用0.45 ym滤头过滤慢病毒上清液； 3. 每20〜30min 混合一次，共进行 3-5次； 4. 4 度放置过夜； 5. 4 度, 4000 g ,离心 20min ； 6. 吸弃上清,静置管子 1 〜 2 分钟,吸走残余液体； 7. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀； 8. 集中后的病毒悬液分装成 50卩每份，保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在 -80 C 病毒滴度的测定 稀释计数法 滴度单位： TU/ml ，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。 ”TU” 为” transducing units ”的缩写， 中文为 “转导单位 ”，表示可以感染并进入到靶细胞中的 病毒基因组数。

第一天细胞准备 将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至 1X10 5/ml ,加入96孔板，100卩1/孔，

为每个病毒准备10个孔。放入37 C, 5%C0 2培养箱中培养。

第二天加病毒 在 EP 管中做 10 倍梯度稀释,连续 10 个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备 10 个 1.5ml EP 管，每管加入90卩1培养液，往第一个管中加入 10卩1病毒原液，混匀后，吸 取10^1加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度（ 10~10 -8 ）。

吸取 96 孔板中原有的培养基,加入含稀释好的病毒液。并做好标记。 第三天追加培养液 在每个孔再加入100卩1完全培养液，利于细胞的生长。 第五天观察结果并计算滴度 在荧光显微镜下观察结果,并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为 X 和 Y, 则滴度（TU/ml ） = （X+Y*10 ） *1000/2/X 孔的病毒液的含量（卩）。

定量 PCR 法 病毒感染 1 天前,取 6 孔板接种 H0S 细胞。每孔细胞为 5X10 4个。 接种细胞 24 小时后, 取两个孔的细胞用血球计数板计数, 确定感染时细胞的实际数目, 记为 N 。 弃去其他培养板中的培养基，更换为含有 5卩g/ml polybrene 的新鲜培养基。将浓缩病 毒用培养基稀释200倍，也就是取1卩1病毒加入到199卩1的培养基中。在3个培养孔 中分别加入0.5卩1, 5^1和50 ^1的稀释病毒。

感染开始后20小时，除去培养上清，换为 500^1含DNasel （Takara Mirus Bio ，终 浓度为10 U/ml）的新鲜培养基。在37 C消化15分钟，这一步是要除去残余的质粒 DNA。 然后换为 2ml 正常的培养基,继续培养 48 小时。

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慢病毒(过表达)包装步骤

慢病毒(过表达)包装步骤

慢病毒（过表达）包装步骤秦超1.转染复苏293T细胞,传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。

转染步骤：（以10cm培养皿为例）⑴最好在铺细胞后20h左右进行转染，控制转染前细胞密度70%—90%，保证细胞处于良好的状态,转染前一小时把一半培养基（约5ml）换成新的（含血清，因为此转染试剂不需换液）。

⑵加psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2.g 5ug于800ul opti—mem，混匀⑶加40ul慢病毒转染试剂于800ul opti—mem，混匀，室温静置5min⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min⑸取出细胞培养皿，将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。

2.收毒(36—48h)收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60%即可.⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中，然后2000rpm离心10min,以沉淀细胞碎片。

⑵取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管(用蛋白质浓缩管即可）中。

4000rpm离心至所需体积。

⑶浓缩完毕后，吸出浓缩后的病毒液,按每次的接毒量分装，-80℃冻存。

由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。

3.接毒接毒前12-20h铺细胞，使接毒时细胞密度约为40％—50%，务必使用生长状态良好的细胞。

将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene使其终浓度为8ug/ml细胞密度60%—70%时可以再接毒一次。

4.检测及培养细胞系（48h)如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin杀三天（对照组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。

如需培养成细胞系,可继续培养。

如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。

慢病毒包装实验技术方法

慢病毒包装实验技术方法

慢病毒包装实验技术方法慢病毒一般为HIV等为基础改造的接近无毒，感染后不进行复制的稳转株构建运载体。

可以将目的基因携带并整合到细胞的基因组中，持续表达（普通转染一般只表达数天，随着分裂质粒会渐渐被稀释掉），进行长期试验。

慢病毒包装的过程和转染相似，主要区别在于慢病毒包装一般为多质粒混合转染（不同质粒含有病毒的不同元件），多个质粒的总质量和PEI的质量以及转染过程都与普通转染无异。

不同的是一般在转染后48h后，也就是换液后的30小时，收集细胞上清作为病毒的粗制品，来感染目的细胞。

以研发为目的的小规模生产是采用生长在培养皿、培养瓶、多盘系统（Cell Factories, Cell Stacks）或HYPERFlask的贴壁细胞。

采用传统的磷酸钙转染或者最近发展起来的PEI转染来转染最佳密度的细胞(<50%),后者的优点是不依赖培养条件、转然后不需要换液及可用于悬浮细胞转染。

原则上，小规模生产也可以采用阳离子转染试剂如lipofectamine、fugene及293fectin,它们转染也都获得了高水平表达。

通过比较不同的细胞培养系统，Aububel等并没有发现所评估的培养系统(培养瓶，一层或十层细胞工厂)所产生的慢病毒滴度有任何差异。

利用HYPERFask，Kutner等发现采用HYPERFask培养可以比用传统培养装置培养所产生的慢病毒每个表面单位高10倍，原因可能是前者有更高的氧气利用率。

此外，HYSPERFask生产的慢病毒比传统培养皿生产的慢病毒所含细胞蛋白、核酸污染更低。

HEK293T细胞贴壁不牢，所以采用转瓶培养生产慢病毒时更困难，同时为了要保证细胞贴壁，转染条件的优化要更加小心。

在这种背景下，Patel等证实在HEK293中过表达alpha-v和beta-3整合素可以提高细胞贴壁能力，进而提高转瓶中慢病毒的产率。

然而，这种方法需要采用过表达整合素的重组HEK293。

293系列的细胞都是非常好转染的。

慢病毒包装操作方案

慢病毒包装操作方案

慢病毒包装操作流程一、材料1 细胞培养试剂试剂名称终浓度试剂品牌胎牛血清10%Invitrogen/Gibco丙酮酸钠1mM Invitrogen2 慢病毒包装试剂PEG6000溶液50%Wako3 耗材●50 mL离心管●15 mL离心管●10 cm细胞培养皿●0.45μm过滤器● 2 mL EP管二、操作流程1细胞培养1.1293T/293FT细胞的复苏1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。

在超净台内，用吸管吸取6~7mL完全培养液至15 mL离心管中；2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C 水浴中快速晃动（水不要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化；3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO对细胞造成的毒性作用）。

4)在室温条件下，250 g离心4分钟。

5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置37°C、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。

（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的培养容器。

）6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。

1.2293T/293FT细胞传代1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。

将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育1-2分钟。

在显微镜下观察，可看到大部分细胞变圆不贴壁，拍打培养瓶两侧会有大量细胞脱离，此时应立即终止消化，若细胞仍然有大部分贴壁，可适当延长孵育时间；3)加入等体积完全培养液终止消化，并用吸管吹打培养瓶底2-3次使所有细胞彻底脱壁。

干扰慢病毒设计、合成及包装的具体方法及步骤

干扰慢病毒设计、合成及包装的具体方法及步骤

干扰慢病毒设计、合成及包装的具体方法及步骤
1.shRNA序列设计与合成
（1）客户提供干扰序列；
（2）针对目的基因中洪代为设计并合成三对特异性的siRNA序列，根据siRNA序列设计对应茎环结构的shRNA序列，然后合成三对shRNA序列（结果中保证其中一条干扰效率不低于70%）。

2.shRNA慢病毒载体构建
将三个shRNA分别克隆入慢病毒载体，构建shRNA干扰慢病毒载体，并进行测序鉴定构建成功。

二、目的基因干扰慢病毒载体的包装和浓缩
1.慢病毒载体的大量包装
大量扩增效率三组shRNA慢病毒载体和慢病毒的辅助质粒，将三个质粒按一定比例大量转染293T细胞，进行慢病毒颗粒的大量包装。

2. 慢病毒的浓缩
包装48小时后收集病毒，并对病毒进行体外大比例浓缩，得到有效滴度为10^8PFU/ml的慢病毒颗粒。