细胞生物学实验技术

常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍 (2021-04-23 11:01:29)转载▼标签：分子生物学细胞生物学常用实用技术根本实验室技术生物学实验教育常用的分子生物学根本技术核酸分子杂交技术由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的根本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。

其根本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下〔适宜的温室度及离子强度等〕可按碱基互补原成双链。

杂交的双方是待测核酸序列及探针〔probe〕,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。

核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的DNA或RNA片段。

根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。

固相杂交固相杂交〔solid-phase hybridization〕是将变性的DNA固定于固体基质〔硝酸纤维素膜或尼龙滤膜〕上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。

斑步杂交〔dot hybridization〕是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后参加过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。

该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永别离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。

该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。

印迹杂交〔blotting hybridization〕Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反响，用放射性自显影或酶反响显色，检测特定大小分子的含量。

第二章细胞生物学实验技术一、名词解释1．显微分辨率（microscopic resolution）---在一定条件下利用显微镜所能看到的精细程度。

2．放射自显影技术（autoradiography）---用于整个细胞时，可以确定放射性标记物在细胞内的定位。

用于凝胶或琼脂平板时，能鉴定出放射性的条带或菌落。

3．双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis）---根据分子质量及等电点的不同将复杂的蛋白质混合物分开。

这种高分辨率的技术能够分离同一混合物中的上千种蛋白质。

4．倒置显微镜（inverted microscope）---一种主要用于观察培养瓶或培养皿中的活细胞生长及分裂状态的特殊显微镜。

与普通光镜相比，其光源、聚光镜和物镜的位置是倒置的，即光源在上，物镜在载物台的下方。

另外，其聚光镜和物镜有较长的工作距离，以方便放置有一定厚度的培养瓶。

二、简答题1．电子显微镜为何不能观察活标本？因为电镜样品的观察室要求高度的真空条件。

2．简述冷冻蚀刻术的原理和方法。

冷冻蚀刻（freeze－etching）技术是在冷冻断裂技术的基础上发展起来的更复杂的复型技术。

如果将冷冻断裂的样品的温度稍微升高，让样品中的冰在真空中升华，而在表面上浮雕出细胞膜的超微结构。

当大量的冰升华之后，对浮雕表面进行铂一碳复型，并在腐蚀性溶液中除去生物材料，复型经重蒸水多次清洗后，捞在载网上作电镜观察。

3．比较投射电子显微镜和扫描电子显微镜。

答：都是用于放大与分辨微小结构，都是通过标本电子束的影响来探测标本结构。

TEM：电子束穿过标本，聚焦成像于屏幕或者显像屏上。

用于研究超薄切片标本，有极高的分辨率，可给出细微的胞内结构。

SEM：电子束在标本表面进行扫描，反射的电子聚焦成像于显像屏上。

可以反映未切片标本的的表面特征。

4．扫描隧道显微镜的工作原理及其优越性是什么？扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope，STM）由Binnig等1981年发明，是根据量子力学原理中的隧道效应而设计制造的。

细胞生物学实验技术细胞生物学实验技术是现代生命科学研究中的关键环节，它为研究人员提供了深入了解细胞结构、功能和相互作用的途径。

本文将重点介绍一些常见的细胞生物学实验技术，包括细胞培养、染色技术、分离技术和显微镜观察等。

一、细胞培养技术细胞培养是一项基础性技术，它可以将细胞从体内取出并在适当的培养基中进行增殖和维持。

细胞培养的首要任务是提供适当的培养基，其中含有必需的营养物质、生长因子和适当的温度、湿度和气体条件。

细胞培养技术广泛应用于细胞生物学实验、组织工程、药物研发等领域。

二、染色技术染色技术是细胞生物学实验中常用的方法之一，它使研究者能够对细胞内各种结构和分子进行可视化观察。

常用的染色方法包括荧光染色、酶标染色和核酸染色等。

荧光染色利用荧光标记的抗体或染料，可使特定的细胞结构或分子在显微镜下发出荧光信号，从而观察其位置和表达水平。

酶标染色则通过酶与底物的反应，使细胞或组织显示出颜色等信号。

核酸染色则利用特定染料与细胞核酸结合，以观察DNA或RNA的分布情况。

三、分离技术分离技术在细胞生物学实验中具有重要作用，它可以将不同类型的细胞或细胞组分进行分离和纯化。

常用的分离技术包括细胞离心、流式细胞术和免疫磁珠分离等。

细胞离心是通过离心机将混合细胞悬液分离成上清液和沉淀，从而获得纯化的特定类型细胞。

流式细胞术则通过流式细胞仪测量细胞的大小、形态和表面标记物，从而实现对细胞的高通量分离和分析。

免疫磁珠分离则利用特定抗体结合在磁珠表面，以实现对需要纯化的细胞或细胞组分的选择性捕获。

四、显微镜观察显微镜观察是细胞生物学实验的重要手段，它使研究者能够观察到细胞内不同的结构和过程。

传统光学显微镜可实现对细胞形态和部分细胞器的观察，但其分辨率有限。

近年来，随着超分辨显微镜技术的发展，研究者们能够突破传统光学显微镜的分辨率极限，实现对亚细胞结构和分子过程的观察。

总结细胞生物学实验技术在现代生命科学研究中发挥着至关重要的作用。

分子生物学与细胞生物学实验基本技术2005-02实验一组织块培养法一、目的学习原代培养方法，从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。

二、概述组织块培养法是常用的、简便易行和成功率较高的原代培养方法。

可以采用剪切法，即将组织块剪切成小块后，接种于培养瓶，组织小块贴壁24h或更长时间后，细胞就从组织四周游出。

但由于在反复剪切和接种过程中对组织块的损伤，并不是每个小块都能长出细胞。

用于组织块培养的培养瓶可根据不同细胞生长的需要作适当处理，如预先涂以胶原薄层，以利于上皮样细胞等的生长。

（本节以新生牛主动脉平滑肌培养为例）三、材料（一）仪器1.净化工作台2.恒温水浴箱3.冰箱（4℃、-20℃）4.倒臵相差显微镜5.培养箱（二）玻璃器皿1.培养皿（Φ100mm）2.吸管（弯头）3.烧杯（500ml、200ml、10ml）4.广口试剂瓶（500ml）5.玻璃瓶（250ml、100ml）6.培养瓶7.废液缸（三）塑料器皿1.吸头2.枪头3.胶塞4.EP管（四）其他物品1.微量加样枪2.眼科组织剪（直尖、弯）3.眼科组织镊（直、弯）4.12.5cm组织镊（无钩、1×2钩）5.25cm敷料镊（无钩）6.止血钳（18cm直纹式、12.5cm直纹式、弯纹式）7.解剖剪（五）试剂1.D-Hanks液2.小牛血清3.RPMI16404.双抗（青霉素、链霉素）5.1N HCl6.7.4%NaHCO3四、操作步骤1.取材：打开胸腔，无菌操作下取出主动脉胸段，浸到预先配制好的含双抗（500u/ml青、链酶素）的D-Hanks液中漂洗。

2.组织的冲洗、修剪：取出主动脉，用锋利的剪刀修剪除去周围组织，再用D-Hanks冲洗主动脉3次，除去血块及杂组织等。

3.平滑肌组织分离：纵向剖开主动脉，撕下主动脉内层，取主动脉中层的平滑肌组织，无血清RPMI1640漂洗3次。

4.剪切：将平滑肌组织用锋利的眼科剪反复剪切至剪成1mm3小块，在剪切过程中，可以适当向组织中滴加1～2滴培养液，以保持湿润。

细胞生物学实验技术的发展趋势随着科学技术的不断进步，生物学这一学科不断发展壮大。

其中，细胞生物学作为生物学的分支学科之一，其重要性在近年来越来越得到人们的关注。

在研究细胞的过程中，实验技术的发展也起到了至关重要的作用。

在本文中，我们将探讨细胞生物学实验技术的发展趋势。

一、单细胞分离技术单细胞分离技术是指通过分离单个细胞使其成为可以被研究和操作的独立实体。

目前这种技术已经得到了广泛的应用，比如可以用于单细胞RNA测序，单细胞蛋白质测序等领域。

接下来我们将探讨几种主要的单细胞分离技术。

1. 流式细胞分选术这是一种基于细胞表面分子的特异性性质进行分选的技术。

通过流式细胞仪可使细胞按照其表面特异性标志物进行分类，完成单细胞分选。

这种技术可以处理大量的样本，并具有精细度高、操作灵活的特点。

2. 微流控芯片技术微流控芯片技术是一种利用微型通道和微流体控制技术实现单细胞操作和分选的技术。

在一个微型芯片内的通道中，可以通过诱导力、化学力、电力等手段，完成对单个细胞的分离和培养。

3. 磁珠免疫分选技术这是一种利用磁性珠子将指定表面分子标记的细胞进行筛选的技术。

该技术能够高效地分选出含有指定表面分子的单个细胞，并且比较适合于大规模的实验。

二、生物荧光技术在细胞生物学领域，生物荧光技术也是一个重要的实验技术。

它主要利用细胞内染色体、细胞器等组成部分的特性，进行捕获、探测和成像。

这种技术能够在线性、不侵入和实时的情况下，获取关于生物样本的信息。

在此方面主要有以下几种技术。

1. 荧光融合技术荧光融合技术是一种将荧光蛋白与目标蛋白进行融合的技术。

这种技术可以用于追踪靶分子在细胞中的分布和运动过程。

2. 荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移技术是一种利用电子能级的荧光共振，使一条激发态的分子发射能量从一个分子转移到另一个分子的技术。

该技术对于测量蛋白质间的相互作用和距离的关系有着较好的应用价值。

3. 光片层析术光片层析术是一种将小颗粒物分离并进行排序的制备技术。

细胞生物学的实验方法与技巧细胞生物学是研究细胞结构和功能的科学领域。

在细胞生物学中，实验方法和技巧是非常关键的。

细胞生物学的实验技术涉及到多种技术和方法，包括细胞培养、细胞分离、荧光显微镜、分子生物学等等。

在本文中，我们将会详细讨论细胞生物学中的实验方法和技巧。

一、细胞培养技术细胞培养技术是研究细胞生长、增殖、衰老等生理状态的一种重要的实验技术。

细胞培养技术通常需要使用一个适宜的培养基，该培养基还需要添加适当的营养物质和培养物质。

在培养细胞时，需要注意适宜的温度、湿度、和二氧化碳含量等因素，这些因素可以影响细胞的状态和生命活动。

另外，在细胞培养中，不可避免地会遇到一些问题，例如细胞的寿命、细胞的死亡、菌污染等问题。

为避免这些问题，需要在实验中采取一些必要的预防措施。

例如，可以使用无菌操作技术，采用CDMF等杀菌剂消毒培养器、培养器中的培养物料，这样可以有效防止细胞因菌污染而死亡。

二、细胞分离技术细胞分离技术是研究细胞的单个特性、形态和功能的一种技术。

在实验中需要利用细胞分离技术来获得一定数量的单个细胞。

细胞分离技术有多种方法，包括分离器分离、离心分离、胶体分离和酶消化等，每种方法都有其优缺点。

其中，酶消化是一种比较常见的细胞分离方法，通过加入一定量的酶，将组织内的胶原纤维、纤维素及其他基质物质消化掉，从而获得单个细胞。

在酶消化实验中，需要根据不同细胞类型、不同组织、不同生长状态等因素进行调整，以获得最佳效果。

三、荧光显微镜技术荧光显微镜技术是一种广泛用于生物学和生命科学中的高级显微镜技术。

在细胞生物学研究中，荧光显微镜技术是最常用的技术之一，因为它可以用来标记和检测细胞内的各种生物大分子，如蛋白质、核酸、酶等。

在荧光显微镜实验中，使用的荧光探针要与待检测的细胞相匹配，例如，使用荧光染料DPH来探测细胞内外膜分子的相互作用。

同时，还需注意荧光显微镜的光源选择、荧光图像的采集和分析等问题，以获得高质量的研究数据。

细胞生物学实验报告实验名称：细胞培养实验实验目的：1. 了解细胞培养的基本原理和过程2. 观察细胞生长和分化的现象3. 掌握细胞培养的实验技术和方法实验原理：细胞培养是一种将生物体细胞从其原始生存环境中分离出来，在体外条件下进行培养的技术。

这种技术对于研究细胞生物学、发育生物学、药物筛选等学科具有重要意义。

本实验将通过观察细胞生长和分化的现象，加深对细胞培养技术的理解。

实验材料：1. 人体皮肤细胞2. 培养基（包含血清、抗生素、氨基酸、维生素等）3. 塑料瓶（培养皿）4. 显微镜5. 记录表实验步骤：1. 取适量人体皮肤细胞，用胰蛋白酶消化，使其从组织中分离出来。

2. 将细胞接种到塑料瓶（培养皿）中，加入适当浓度的培养基。

3. 将塑料瓶（培养皿）放入恒温培养箱中，定期观察并记录细胞生长和分化的现象。

4. 在合适的时间点，使用显微镜拍照记录细胞生长和分化的过程。

5. 实验结束后，整理数据和图片，撰写实验报告。

实验结果：经过一段时间的培养，我们观察到皮肤细胞在培养基中开始贴壁，并逐渐生长。

随着时间的推移，部分细胞开始出现分裂，形成相互连接的细胞团。

一些细胞逐渐伸展成梭形或扁平形，呈现出典型的贴壁生长形态。

在某些区域，我们观察到细胞开始分化为两种不同形态的细胞群，一种呈圆形或椭圆形，另一种呈多角形。

这些现象表明细胞已经开始分化。

实验分析：根据实验结果，我们可以得出以下结论：1. 细胞确实可以在体外条件下贴壁生长并增殖。

这证明了细胞培养技术的可行性。

2. 细胞分化是一个自然的过程，在本实验中得到了证实。

这说明细胞具有自我更新和多向分化的潜能。

3. 实验过程中需要注意无菌操作和适宜的培养条件，以确保细胞的存活和正常生长。

此外，不同种类的细胞可能需要不同的培养条件，因此在实际操作中需要针对具体细胞类型进行实验。

实验结论：通过本次实验，我们了解了细胞培养的基本原理和过程，观察了细胞生长和分化的现象，并掌握了细胞培养的实验技术和方法。

细胞生物学中的免疫组化和原位杂交技术细胞生物学是研究细胞结构、功能和特性的学科，其中免疫组化和原位杂交技术是重要的实验手段和研究工具。

本文将介绍免疫组化和原位杂交技术的原理、应用以及未来的发展方向。

一、免疫组化技术免疫组化技术是通过特异性抗体与目标分子结合来检测细胞内或组织内的特定蛋白质的方法。

免疫组化技术的原理是利用抗体与抗原之间的亲和性，通过特异性结合实现对蛋白质的检测和定位。

1. 原理免疫组化技术主要包括以下步骤：取材、固定、切片、抗原恢复、阻断、抗体标记、显色和观察。

首先，将需要检测的组织固定并制作切片。

然后，对切片进行抗原恢复处理，以破坏固定过程中引起的抗原和抗体的交联反应。

接下来，进行阻断步骤，防止非特异性抗体的结合。

随后，使用特异性抗体标记目标蛋白质。

最后，通过显色反应观察标记的抗体的位置和数量。

2. 应用免疫组化技术在细胞生物学领域有多种应用。

它可以用于检测特定蛋白质的存在和定位，从而研究细胞内各种生物分子的分布。

此外，免疫组化技术还可以用于诊断疾病，例如通过检测肿瘤标志物的表达来判断肿瘤的类型和分级。

此外，免疫组化技术还能够评估细胞的增殖、分化和凋亡等生理过程。

二、原位杂交技术原位杂交技术是通过标记的探针与靶RNA或DNA结合，从而在组织或细胞水平上检测靶分子的方法。

原位杂交技术可以提供靶RNA和DNA的空间分布和细胞定位信息。

1. 原理原位杂交技术主要包括以下步骤：制备探针、固定组织、加氢解固、杂交反应、洗涤和检测。

首先，制备标记的探针，通常使用放射性同位素或荧光标记。

然后，将组织固定，以防止RNA或DNA降解。

接着，进行加氢解固步骤，以使靶分子的结构恢复。

随后，进行杂交反应，将探针与靶RNA或DNA结合。

最后，通过洗涤和检测步骤，确定探针的结合位置和数量。

2. 应用原位杂交技术在细胞生物学和遗传学领域有广泛的应用。

它可以用于研究基因表达和功能的调控机制，例如通过检测特定RNA的存在来研究基因的转录水平。