免疫共沉淀实验的注意事项
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。那么免疫共沉淀实验的注意事项有哪些呢？同科生物为您介绍一下：
1、细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100）。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS），细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。
2、使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用。
3、使用对照抗体：
①单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗
②兔多克隆抗体：正常兔IgG
4、在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性，应注意以下几点：
①确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生。
②要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀。
③确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。
免疫共沉淀实验原理及方法 免疫共沉淀（CoIP）概述及原理 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，属于免疫沉淀技术的一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第一是天然状态，第二是蛋白复合物。 免疫共沉淀的优势： 与其他研究蛋白质相互作用技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相比，免疫共沉淀鉴定的相互作用蛋白是在细胞内与目的蛋白发生的天然结合，避免了人为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋白可信度更高。 免疫共沉淀的局限性和注意事项： 1. 免疫共沉淀是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋白组分很可能检测不到； 2. 由于蛋白质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使用某一种pull-down抗体，无论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来，如有必要最好使用多种不同抗体分别进行CoIP；
3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋白复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋白复合物成员也会越来越庞大； 4. 如果使用Western Blot的方法检测的蛋白复合物中的目标蛋白，则需要在试验前进行预测，具有一定的冒险性；当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较高纯度和浓度的蛋白复合物样品也非易事，并且成本较高； 5. CoIP鉴定得到的蛋白间相互作用可能是直接作用也可能是间接作用，进一步区分还需要进行GST-Pull down等实验检测； 6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使用复合物的不同成员分别独立进行CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使用复合物的任一成员进行CoIP都会得到其他所有成员[1] 免疫共沉淀的一般操作流程（中英文对照）：
化学实验室基本操作中的注意事项 中学化学实验基本操作中的高考考点较多，为便于系统复习和认真掌握化学实验操作，现总结八点注意事项，以期对同学们有所帮助。 一、注意事“先后”顺序 1．组装仪器顺序：先零后整，由低到高，由左到右，先里后外，拆装置与之顺序相反。 2．加热器试管时，先均匀加热，后局部加热。 3．制取气体时，先检查装置的气密性，后装入药品。 4．使用容量瓶、分液漏斗、滴定管前先检查是否漏水，后洗涤干净。 5．用排液法收集气体时，先移导管后撤酒精灯。 6．用石蕊试纸、淀粉碘化钾试纸、醋酸铅试纸气体性质时，要先用蒸馏水将试纸润湿。再将试纸靠近气体检验。而用pH试纸时，要先用玻璃棒蘸取待测液少许滴到放在表面皿中央的干燥pH试纸上，再与标准比色卡比较。 7．中和滴定实验时，用蒸馏水洗净的滴定管、移液管要先用待盛液洗涤2~3次后，再盛装试液。注入滴定管中的液体液面开始在“零”刻度或“零”刻度以下。 8．点燃可燃性气体时，应先验纯后点燃。净化气体时，应先净化后干燥。
9．焰色反应试验中，每做一次，铂丝都应当先蘸取浓盐酸放在火焰上灼烧至无色后再做下一次。 10．配制一定物质的量溶液时，溶解或稀释后溶液应冷却再移入容量瓶。 11．气体在热固体表面时，应先将气体干燥后反应。 12．硫酸沾到皮肤上，先迅速用干布擦去，再用水冲洗，千万不得先用水冲洗；碱液沾到皮肤上，立即用较多水冲洗，再涂上硼酸溶液。 二、注意“数据”归类 1．托盘天平的准确度为0.1g；在测定晶体中结晶水含量时，为保证加热过程中使结晶水全部失去，实验中需加热、称量、再加热、再称量，直到最后两次称量不超过0.1g。 2．滴定管的准确度为0.01mL。 3．酒精灯内酒精的量不能少于容积的1/3，也不能多于2/3。4．试管在加热时，所盛液体不能超过试管容积的1/3；且要与桌面成45°角。用试管夹夹试管时应夹在离管口1/3处。 5．烧杯、烧瓶加热时，盛液体量均在容积的1/3~2/3处，蒸发皿加热液体时，盛液体量不宜超过容积的2/3。 6．液体取用时，若没有说明用量，一般取1~2mL。 7．配制一定的物质的量浓度溶液时，烧杯、玻璃棒要洗2~3次，用烧杯往容量瓶中加蒸馏水时，一般加到距离刻度线和1~2mL处，再用胶头滴管定容。
染色体免疫共沉淀（Chip）实验报告 步骤一：样品准备 试剂和仪器： Biopulverizer(biospec) 37% formaldehyde 甘氨酸(Glycine) PBS protease inhibitors 步骤二：细胞交联 1. 向客户提供的细胞沉淀中加入1ml 细胞培养基，混匀细胞后转移到15ml离心管中。 2. 向15ml离心管中加入270ul 37%甲醛溶液，使得甲醛的终浓度为1%，室温温育10min。 3. 向反应体系中各加入505ul 2.5M甘氨酸到终浓度为125mM，室温温育5min以终止交联反应。 4. 135x g，4°C离心10min，去上清，并用冰冷的10ml 1XPBS迅速漂洗两次。 5. 吸净PBS后，加入1ml PBS+protease inhibitors混合液，并转移到1.5ml离心管中。800Xg，4°C离心 5min，小心去掉上清。 步骤三：细胞裂解 试剂: 裂解缓冲液1: 50mM Hepes-KOH pH7.5; NaCl 140mM; EDTA 1mM; glycerol 10%;NP-40 0.5%; Tritonx -100 0.25%。 裂解缓冲液2: 10mM Tris-HCl pH8.0; NaCl 100mM; EDTA 1mM pH8.0; Na-Deoxycholate 0.1% Protease inhibitors。 步骤: 1. 加入蛋白酶抑制剂(终浓度为1x) 到所有的裂解缓冲液中。 2. 用1ml的裂解缓冲液1重悬上述处理的样品，4°C旋转混合10min后，800g，4°C离心5min，弃上清。 3. 用300ul 裂解缓冲液2重悬样品，冰上放置30min。 步骤四：超声破碎ＤＮＡ 仪器: Bioruptor(Diagenode) 步骤: (1)、将超声仪器Bioruptor 调到中档“Mid”(M)。 (2)、在超声池中注入一定量的冰水。 (3)、将上述1.5ml Ep管置于超声固定架中。 (4)、将带有Ep管的固定架放入已注入冰水的超声池中，超声10分钟。(30 seconds “ON” & 30 seconds “OFF”。) (5)、超声完成后，各取25ul直接接交联和纯化(具体操作见后洗脱和纯化步骤)后于2%琼脂糖凝胶电泳。超声后电泳图附件1。
化学实验操作的注意事项 ?化学实验操作应遵循的七个原则： 1.“从下往上”原则。 2.“从左到右”原则。装配复杂装置应遵循从左到右顺序。 如上装置装配顺序为：发生装置→集气瓶→烧杯。 3.先“塞”后“定”原则。 4.“固体先放”原则。 5.“液体后加”原则。 6.先验气密性(装入药口前进行)原则。 7.后点酒精灯(所有装置装完后再点酒精灯)原则。 ?化学实验中的“七个关系” （1）先后关系 ①向试管中装人固体粉末时，先将试管倾斜，把盛药品的药匙送至试管底部，然后让试管直 立，使药品全部落到试管底；向试管中放入块状固体时，先把试管横放，用镊子把药品放在试管口，然后将试管慢慢竖立起来使固体缓慢落到试管底。 ②用胶头滴管吸取少量液体时，先在滴瓶外面挤压胶头排出滴管内的空气，然后再伸入滴瓶 内松手吸取液体。 ③用托盘天平称量药品时，先游码归零，再调节平衡，然后称量。 ④给玻璃仪器加热时，先把仪器外壁擦干，然后再加热。 ⑤给试管中的药品加热时，先使试管均匀受热，然后对盛放药品的部位固定加热。 （2）左右关系 ①用托盘天平称量药品时，药品放在左盘，砝码放在右盘。 ②连接实验装置时，应按从左到右(或自下而上)的顺序进行，拆除时顺序相反。 ③橡胶塞和橡胶管与玻璃管连接时，左手拿橡胶塞或橡胶管，右手拿玻璃管(玻璃管一端用 水润湿)；给容器塞橡胶塞时，左手拿容器，右手拿塞子。 （3）上下关系 ①给试管中的固体加热时，试管口应略向下倾斜；给试管中的液体加热时，试管口应向上倾 斜(与桌面大约成45。角)。 ②用试管夹夹持试管时，应从试管底部向上套，夹在试管的中上部。 ③手拿试剂瓶倾斜液体试剂时，应让标签向上对着手心。 （4）正倒关系 ①取试剂瓶里的药品时，拿下瓶塞，倒放在桌上。 ②用胶头滴管取完液体时，胶头滴管应该正放 (保持胶头向上)，而不能倒放或平放。 （5）多少关系
https://www.doczj.com/doc/966022247.html, 染色质免疫共沉淀全套解决方案——ChIP试剂盒 染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）作为最佳的研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法，它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，ChIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；ChIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着ChIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。 当前国内科研情况而言，研究分化，转录，发育，iPS，肿瘤干细胞，表观遗传学等等领域的老师都会做ChIP实验，还有部分老师会自己买抗体，手工配置试剂。但由于这个实验本身实验步骤比较繁琐而且其中很多步骤都非常关键，所需的试剂较多，容易造成配置间的误差，实验周期较长，若未设置阴性和阳性对照，更会导致结果无法分析，从而进入无休的困惑。 经典染色质免疫共沉淀(ChIP)试剂盒(p-2002)：提供了对细胞样品进行染色质免疫沉淀反应所需的所有试剂。并且本试剂盒中含有一种阳性对照抗体(RNA聚合酶II抗体)、一种阴性对照抗体(正常小鼠的IgG)、GAPDH引物(可以作为阳性对照来保证试剂盒中试剂和操作步骤没出现问题)。在大多数生长期的哺乳动物细胞中，RNA聚合酶II会在GAPDH基因启动子上富集，准备起始转录，因此该启动子能与RNA聚合酶II发生免疫沉淀反应，而不能与正常小鼠IgG发生。在本染色质免疫沉淀反应中，细胞耦合了甲醛，提取出其中的染色质。染色质进行适当的打断，然后加入到微孔中与其表面上吸附的抗体发生免疫反应。特异性结合到微孔上的DNA从抗体-捕获蛋白-DNA复合物上释放出来，翻转后，通过本公司专门设计的高速离心柱纯化。洗脱下来的DNA可直接用于随后的各种分析。本试剂盒是基于96孔板的，市场上同类产品中最快捷的试剂盒，对CHIP过程进行了彻底的简化，操作简捷，方便易学整个处理过程不到5小时，同时可拆卸式的96孔板模式使研究人员能根据自己需要选择手工或是高通量分析。
类仪器名称 别 试管 (平口、翻 可口、具支) 直 接 坩埚 加 (坩埚钳、 热泥三角、 三脚架) 蒸发皿 燃烧匙 烧杯 隔 网 可 烧瓶： 可分为圆加 底烧瓶、平 热底烧瓶和 蒸馏烧瓶。 注意圆底 烧 瓶与蒸馏 烧 瓶的区别。 锥形瓶 不集气瓶 能 加 热滴瓶 试剂瓶 化学实验常用仪器 一、常用仪器的名称、用途、使用注意事项 主要用途使用方法和注意事项 用来盛放或溶解少①可直接加热，用试管夹夹在距试管口1/3 量药品、常温或加热处。 情况下进行少量试②放在试管内的液体，不加热时不超过 剂反应的容器，可用试管容积的l/2，加热时不超过l/3。 于制取或收集少量③加热后不能骤冷，防止炸裂。 气体。④加热时试管口不应对着任何人；给固 体加热时，试管要横放，管口略向下倾斜。主要用于固体物质 一般为瓷质。把坩埚放在三脚架上的泥 三 的高温灼烧。角上直接加热。取、放坩埚时应用坩埚 钳。定量实验时应在干燥器中冷却。 蒸发或浓缩溶液或可直接加热，但不能骤冷。 结晶。盛液量不应超过蒸发皿容积的 2/3， 结 晶时，近干时可停止加热。 取、放蒸发皿应使用坩埚钳。加热后的 蒸发皿要放在石棉网上冷却。 少量固体燃烧的反 应器。 用作配制溶液和较 加热时应放置在石棉网上，使受热均 匀。 大量剂量的反应容溶解物质用玻璃棒搅拌时，不能触及杯 器，在常温或加热时 壁或杯底，反应液量不超过容积 的2/3，加使用。（水浴加热）热时不超过1/2。 须注意常用规格的选用（如配100mL 溶液）。 用于试剂量较大而圆底烧瓶和蒸馏烧瓶可用于加热，加热 又有液体物质参加时要垫石棉网，也可用于其他热浴（如 反应的容器，可用于水浴加热等）。 装配气体发生装置。液体加入量不要超过烧瓶容积的2/3, 加 蒸馏烧瓶用于蒸馏热时不少于烧瓶容积的1/3，蒸馏时温度 以分离互溶的沸点计水银球应放在支管口处并加碎瓷片防 不同的物质。暴沸。 中和滴定反应器及液体不超过容积的1/3，中和滴定时应 蒸馏接受器。用右手振荡，（且只振荡不搅拌）。 收集或贮存少量气 瓶口磨砂，用磨砂玻片涂凡士林封盖。 燃 体及气体间的反应，烧时有固体生成时，瓶底应加少量水或 安全瓶、量气装置。铺少量细砂，不能加热，盛不同密度的 气体放置时瓶口方向不同。 须防止倒吸。 盛少量液体药品。见光易变质的试剂装入棕色瓶，带有 玻璃塞的试剂瓶不可装强碱性试剂；滴 管不能互换，倾倒液体时标签向手心， 滴瓶不存放强挥发性腐蚀性试剂（浓 溴水、浓硝酸等）。 广口：盛固体药品 棕色瓶盛见光易变质药品；盛碱液时应 橡
关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结 ChIP实验原理 在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 可以利用ChIP研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）的关联性。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。 一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。 ChIP实验步骤 第一天：
（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。 1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9ml） 2、37摄氏度孵育10min。 3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。 450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。 4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。 6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。 假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。 将2管混在一起，共800ul。 7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。当然，如果实验室有Bioruptor这种神器的话那就轻松了。 （二）、除杂及抗体哺育。 8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。去除不溶物质。 留取300ul做实验，其余保存于－80度。 300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul 加入4ul 5M NaCl （NaCl终浓度为0.2M），65度处理3h解交联，跑电泳，
免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤 一、原理： 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 二、准备工作： 预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机 1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；
2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶， 0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶) 3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上） 4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中 5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减 掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠 6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插 冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景 7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子 8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月） 9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白 在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl） 10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异 11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h 室温孵育
染色质免疫共沉淀（ChIP）实验具体方法及步骤 在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。 IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。 目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。 一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天） 1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。 2. 37℃孵育10 min。 3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5 min即可。 4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。 6. 倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2x106个细胞。这样每100 ul溶液含1x106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5x106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为 4x106个细胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800 ul。 7. 超声破碎：VCX750，25%功率，4.5 s冲击，9 s间隙。共14次。 二、除杂及抗体哺育（第一天） 1. 超声破碎结束后，10 000 g 4℃离心10 min。去除不溶物质。 2. 留取300ul做实验，其余保存于-80℃。 3. 300 ul中，100 ul加抗体做为实验组；100 ul不加抗体做为对照组；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2 M），65℃处理3 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
免疫共沉淀与Western Blot 实验步骤: 1．以60mm细胞培养皿为例，细胞转染后24－36小时后，吸净培养液（可用PBS 小心漂洗一次）。 2．加入500μl预冷的1×lysis buffer,于4℃或冰上放置裂解细胞5分钟。 3．将细胞裂解液转移到1.5ml eppondorf管内，于冷冻离心机4℃，13000g离心30分钟。 4．将离心后的上清液分为两份：一份35μl，加入等体积的2×SDS sample buffer,混匀后于100℃煮10分钟，做为总细胞裂解液（total cell lysate，TCL）于－20℃保存，或取6－10μl进行SDS－PAGE电泳，Western blot检测目的蛋白的表达水平（接第5步）。另一份用于免疫沉淀，具体操作如下： 1）分A/G beads：按每管（一个免疫沉淀样品）加入5μl Agrose A/G beads 及5μl（1μg）抗体计算一次实验所用beads及抗体的总量，将抗体和beads混合，补充lysis buffer（补充的lysis buffer的量能使每管能均匀分配到50μl beads 及抗体的混合物），将beads及抗体的混合物按每管50μl（含5μl beads及5μl抗体）分配到1.5ml Eppendorf管中，再加入400μl1×lysis buffer，备用； 2）从步骤4中另一份用于免疫沉淀的上清液中取400μl加入到上一步（步骤1））已分好的beads中，使终体积达到850μl，将管子固定到混匀器上使混匀器匀速旋转（15rpm）免疫沉淀3小时； 3）将免疫沉淀后的溶液于4℃3000rpm离心3分钟，去上清，加入500μl 1×lysis buffer洗涤beads，于冷冻离心机4℃3000rpm离心3分钟，弃上清，共洗涤三次。 4）最后一次洗涤完毕，弃上清，管中只剩Beads，加入35μl1×lysis buffer与等体积2×SDS sample buffer混合，于100℃煮沸10分钟，稍离心后取10μl左右上样到PAGE胶，进行电泳，或－20℃冻存。 5．电泳完毕，取下PAGE胶，与PVDF膜做成"三明治"形状，用湿转法进行电转1小时。 6．电转完毕，取下PVDF膜，加入5％脱脂奶粉，于脱色摇床摇荡（75rpm）封闭1小时以消除非特异背景。
实用标准文案 有机化学实验 操作规范
实用标准文案 目录 《有机化学实验》操作规范 (1) 一、有机化学实验教学目的和要求 (1) 二、使用标准磨口玻璃仪器注意事项 (1) 三、仪器的装配 (1) 四、加热 (2) 五、回流 (2) 六、分液漏斗 (3) 七、搅拌装置 (4) 八、干燥 (4) 九、蒸馏 (5) 十、减压蒸馏 (7) 十一、水蒸气蒸馏 (9) 十二、分馏 (10) 十三、重结晶 (11) 十四、有机化合物的合成 (13)
实用标准文案 《有机化学实验》操作规范 一、有机化学实验教学目的和要求 通过有机化学实验，加深学生对有机化学基本理论与概念的理解；增强运用有机化学理论解决实验问题的能力。要求掌握： 1、本规范内所拟订的各项有机化学实验的基本技能； 2、正确选择有机化合物的合成、分离和提纯的方法； 3、养成实事求是的科学态度，良好的科学素养和工作习惯。 二、使用标准磨口玻璃仪器注意事项 1、标准口塞应保持清洁 2、使用前在磨砂口塞表面涂以少量真空油脂或凡士林，以增强磨 砂接口的密合性，同时也便于接口的装拆。 3、用后应立即拆卸洗净。否则，对接处常会粘牢，以至拆卸困难。 4、能正确说出各仪器的名称 三、仪器的装配 1、在装配仪器时，所选用的玻璃仪器和配件都要干净。否则会影 响产物的产量和质量 2、一般根据热源的高低来确定待加热仪器和其他仪器的高度。 3、仪器安装应先选好主要仪器的位置，按先下后上，从左到右顺 序安装，做到正确、整齐、稳妥、端正，其轴线应与实验台边沿平行。在拆卸时应先移走热源，后停冷凝水，再拆装置，拆卸顺序与安装相反，其顺序是由右至左，先上后下。 4、其他注意事项
染色质免疫共沉淀技术的发展 姚汪劲松发育生物学2013级2013110046 摘要：本文主要介绍了染色质免疫沉淀技术的发展历程、基本原理和优缺点，并且介绍了反向染色质免疫沉淀技术，并对两种方法进行了比较。 关键词：染色质免疫共沉淀；反向染色质免疫共沉淀；应用，研究前景。 目前，不断发展的DNA和蛋白质相互作用的方法和技术已经成为研究DNA复制、重组、修复和转录的核心。其中凝胶阻滞实验（EMSA），报告基因分析，DNA微阵列，质谱分析法MS，酵母单杂交系统和染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是被广泛应用于研究DNA 和蛋白质相互作用的方法。 真核生物基因组DNA以染色质形式存在，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达调控机制的基本途径。生物体内基因表达调控主要发生在转录过程中，转录调控是顺式作用元件(Cis-acting elements)如启动子(Promoter)、增强子(Enhancer)与反式作用因子(Trans-acting factors)相互作用的结果。基因组DNA的甲基化、组蛋白甲基化、乙酰化和磷酸化修饰，核小体重新定位及染色体结构重建都影响调控。转录调控具有细胞类型、发育阶段和外界环境刺激的差异性，哺乳动物转录调控序列分散在较大区域，组蛋白修饰状态达100多种，这些因素都增加了转录调控的复杂性。 ChIP是一种在体内研究转录因子和靶基因启动子区域直接相互作用的方法，可以在体内直接确定它们之间相互作用方式的动态变化，能够得到转录因子结合位点的信息，确定其直接靶基因。它早期多被用于研究核小体上的DNA和组蛋白的相互作用以及组蛋白的修饰等方面。近年来，随着生物技术的迅速发展，ChIP技术不断发展和完善，被广泛应用于体内转录调控因子与靶基因启动子上特异核苷酸序列结合方面的研究，并成为在染色质水平研究基因表达调控的有效方法。特别是，此技术与DNA芯片和分子克隆技术相结合，可用于高通量筛选已知蛋白因子的未知DNA靶位点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况，这将有助于深入研究DNA与蛋白质相互作用的调控网络。 ChIP技术由Orlando等于1997年创立。其基本原理为将处于适当生长时期的活细胞用甲醛交联后将细胞裂解，染色体分离并打碎为一定大小的片段；然后用特异性抗体免疫沉淀目标蛋白与DNA交联的复合物，对特定靶蛋白与DNA片段进行富集。采用低pH值条件反交联，DNA与蛋白质之间的Schiff键水解，释放DNA片段。通过对目标片段的纯化与检测，获得DNA与蛋白质相互作用的序列信息。在上述ChIP过程中，甲醛能够进入细胞并使蛋白质与DNA或蛋白质与蛋白质之间通过希弗(Scihff)键交联，形成稳定结合的复合物。如果交联效果不太好，可以先用交联剂DMA(Dimethyl adipimidate)或DSG (Disuccnimidyl glutarate)处理细胞，以加强后续甲醛交联的效果。破碎DNA可采用超声物理破碎或特定酶切消化，以获得所需长度的DNA片段。由于DNA片段长度将影响抗体免疫沉淀效率，因此破碎DNA是ChIP实验成功与否的重要因素。超声效果与细胞裂解是否充分、细胞浓度及裂解液成分等因素有关。超声处理后的液体应从浑浊状态变为透明状态。选择专一性及亲和力较高的抗体是ChIP成功的关键。非特异性抗体将增加大量的非目标靶点DNA片段信息，从而掩盖了真实的蛋白质结合位点信息；而亲和力较差的抗体，则无法获得高信噪比靶点DNA片段。另一方面，在甲醛交联过程中可能会掩盖一些蛋白质的表位，这会影响到一部分蛋白质和DNA复合体的免疫沉淀反应。因此，用Western印迹或免疫组化等常用的实验方法证明的能够对目标蛋白质进行免疫结合的抗体，并不能保证一定能够成功地进行ChIP实验。例如，Weitsman 等检验了不同的雌激素受体β抗体在ChIP中的免疫沉淀能力，发现有的抗体虽然能够在标准免疫沉淀条件下与抗原结合，但不适合ChIP条件下使用，并
化学品使用注意事项 1.乙酸(浓)必须非常小心地操作。可能由于吸入或皮肤吸收而受到伤害。要戴合适的手套和护目镜。在化学通风橱\生物安全柜里使用。 2.乙腈（jing）是非常易挥发和特别易燃的，它是一种刺激物和化学窒息剂，可因吸入、咽下或皮肤吸收而发挥其效应。严重中毒的病人可按氰化物中毒方式处理。操作时要戴合适的手套和安全眼镜。只能在通风橱\生物安全柜里使用，远离热、火花和明 3.氯化铵(NH4Cl)可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。操作时要戴合适的手套和安全眼镜并在通风橱\生物安全柜里进行。 4.氢氧化铵(NH4OH)是氨的水溶液，是腐蚀剂。操作时应极为谨慎。氨会从溶液中散发出来，它是腐蚀性的和有毒的，并易引起爆炸。操作时戴合适的手套并只能在通风橱\生物安全柜里进行。 5.硫酸胺[(NH4)2SO4]可因吸入、咽下或皮肤吸收而受到伤害。戴合适的手套和安全眼镜。在化学通风橱\生物安全柜里使用。 6.硼酸(H3BO3)可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。操作时戴合适的手套和护目镜。 7.溴酚蓝可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。操作时要戴合适的手套和安全眼镜并在化学通风橱\生物安全柜内操作。 8. n-丁醇对黏膜、上呼吸道、皮肤特别是对眼睛有刺激作用。避免吸入蒸发的气体。操作时戴合适的手套和安全眼镜并在化学通风橱\生物安全柜内进行。n-丁醇也是高度易燃的，远离热、火花和明火。 9.氯仿(CHCl3)对皮肤、眼睛、黏膜和呼吸道有刺激作用。它是一种致癌剂，可损害肝和肾。它也易挥发，避免吸入挥发的气体。操作时戴合适的手套和安全眼镜并始终在化学通风橱\生物安全柜里进行。 10.柠檬酸是一种兴奋剂，可因吸入、咽下或皮肤吸收而受危害健康。它对眼睛可形成严重损伤的危险。操作时戴合适的手套和安全护目镜。勿吸入其粉末。 11.氯化钴(COCl2)可因吸入、咽下或皮肤吸收而受到危害。操作时戴合适的手套和安全眼镜。 12.硫酸铜(CuSO4)可因吸入、咽下或皮肤吸收而受到危害。操作时戴合适的手套
中学化学实验基本操作中的高考考点较多,为便于系统复习和认真掌握化学实 验操作,现总结八点注意事项,以期对同学们有所帮助。 一、注意事 " 先后 " 顺序 1.组装仪器顺序:先零后整,由低到高,由左到右,先里后外,拆装置与之顺序相 反。 2.加热器试管时,先均匀加热,后局部加热。 3.制取气体时,先检查装置的气密性,后装入药品。 4.使用容量瓶、分液漏斗、滴定管前先检查是否漏水,后洗涤干净。 5.用排液法收集气体时,先移导管后撤酒精灯。 6.用石蕊试纸、淀粉碘化钾试纸、醋酸铅试纸气体性质时,要先用蒸馏水将试纸润湿。再将试纸靠近气体检验。而用 pH 试纸时,要先用玻璃棒蘸取待测液少许滴 到放在表面皿中央的干燥 pH 试纸上,再与标准比色卡比较。 7.中和滴定实验时,用蒸馏水洗净的滴定管、移液管要先用待盛液洗涤 2~3次后, 再盛装试液。注入滴定管中的液体液面开始在 " 零 " 刻度或 " 零 " 刻度以下。 8.点燃可燃性气体时,应先验纯后点燃。净化气体时,应先净化后干燥。 9.焰色反应试验中,每做一次,铂丝都应当先蘸取浓盐酸放在火焰上灼烧至无色 后再做下一次。 10.配制一定物质的量溶液时,溶解或稀释后溶液应冷却再移入容量瓶。 11.气体在热固体表面时,应先将气体干燥后反应。 12.硫酸沾到皮肤上,先迅速用干布擦去,再用水冲洗,千万不得先用水冲洗;碱液 沾到皮肤上,立即用较多水冲洗,再涂上硼酸溶液。
二、注意 " 数据 " 归类 1.托盘天平的准确度为 0.1g ;在测定晶体中结晶水含量时,为保证加热过程中使结晶水全部失去,实验中需加热、称量、再加热、再称量,直到最后两次称量不超过0.1g 。 2.滴定管的准确度为 0.01mL 。 3.酒精灯内酒精的量不能少于容积的 1/3,也不能多于 2/3。 4.试管在加热时,所盛液体不能超过试管容积的 1/3;且要与桌面成 45°角。用试管 夹夹试管时应夹在离管口 1/3处。 5.烧杯、烧瓶加热时,盛液体量均在容积的 1/3~2/3处,蒸发皿加热液体时,盛液体量不宜超过容积的 2/3。 6.液体取用时,若没有说明用量,一般取 1~2mL。 7.配制一定的物质的量浓度溶液时,烧杯、玻璃棒要洗 2~3次,用烧杯往容量瓶中加蒸馏水时,一般加到距离刻度线和 1~2mL处,再用胶头滴管定容。 8.酸碱指示剂的用量一般在 2~3滴。 9.用 pH 试纸测出溶液的 pH ,不能含有小数;任何水溶液, H+或 OH-的浓度均不能为 "0" ,而是大于 "0" 。 10.滴定管的 "0" 刻度在滴定管的上部(但不是最上端,在量取液体体积时,液面不一定要在 "0" 刻度,得要要 "0" 刻度以下;滴定管读数时装液或放液后,需观察 1~2分钟才能观察液面高度。 11.量杯、量筒、容量瓶没有 "0" 刻度;温度计 "0" 刻度在温度计的中下部。
免疫共沉淀详细步骤 实验原理 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 实验试剂 1. RIPA Buffer配制：
基础成分： Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性） NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集） NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液） 去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存） 注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。 RIPA蛋白酶抑制剂 苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200mM的储存液，室温保存） EDTA（钙螯合剂；用H2O配制成100mM的储存液，PH 7.4） 亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存） 抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存） 胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存） RIPA磷酸（酯）酶抑制剂 激活的Na3VO4（用H2O配制成200mM的储存液，见Sodium Orthovanadate Activation Protoco） NaF（200mM的储存液，室温保存）
高考化学实验题操作及注意事项总结 一.中学化学实验操作中的七原则 掌握下列七个有关操作顺序的原则，就可以正确解答“实验程序判断题”。 1.“从下往上”原则。以Cl2实验室制法为例，装配发生装置顺序是：放好铁架台→摆好酒精灯→根据酒精灯位置固定好铁圈→石棉网→固定好圆底烧瓶。 2.“从左到右”原则。装配复杂装置遵循从左到右顺序。如上装置装配顺序为：发生装置→集气瓶→烧杯。 3.先“塞”后“定”原则。带导管的塞子在烧瓶固定前塞好，以免烧瓶固定后因不宜用力而塞不紧或因用力过猛而损坏仪器。 4.“固体先放”原则。上例中，烧瓶内试剂MnO2应在烧瓶固定前装入，以免固体放入时损坏烧瓶。总之固体试剂应在固定前加入相应容器中。 5.“液体后加”原则。液体药品在烧瓶固定后加入。如上例浓盐酸应在烧瓶固定后在分液漏斗中缓慢加入。 6.先验气密性(装入药口前进行)原则。 7.后点酒精灯(所有装置装完后再点酒精灯)原则。 二.中学化学实验中温度计的使用分哪三种情况以及哪些实验需要温度计 1.测反应混合物的温度：这种类型的实验需要测出反应混合物的准确温度，因此，应将温度计插入混合物中间。①测物质溶解度。①实验室制乙烯。 2.测蒸气的温度：这种类型的实验，多用于测量物质的沸点，由于液体在沸腾时，液体和蒸气的温度相同，所以只要测蒸气的温度。①实验室蒸馏石油。①测定乙醇的沸点。 3.测水浴温度：这种类型的实验，往往只要使反应物的温度保持相对稳定，所以利用水浴加热，温度计则插入水浴中。①温度对反应速率影响的反应。①苯的硝化反应。 三.常见的需要塞入棉花的实验有哪些需要塞入少量棉花的实验： 加热KMnO4制氧气制乙炔和收集NH3 其作用分别是：防止KMnO4粉末进入导管； 防止实验中产生的泡沫涌入导管；防止氨气与空气对流，以缩短收集NH3的时间。 四.常见物质分离提纯的10种方法 1.结晶和重结晶：利用物质在溶液中溶解度随温度变化较大，如NaCl，KNO3。 2.蒸馏冷却法：在沸点上差值大。乙醇中(水)：加入新制的CaO吸收大部分水再蒸馏。 3.过滤法：溶与不溶。 4.升华法：SiO2(I2)。 5.萃取法：如用CCl4来萃取I2水中的I2。 6.溶解法：Fe粉(A1粉)：溶解在过量的NaOH溶液里过滤分离。 7.增加法：把杂质转化成所需要的物质：CO2(CO)：通过热的CuO；CO2(SO2)：通过NaHCO3溶液。 8.吸收法：除去混合气体中的气体杂质，气体杂质必须被药品吸收：N2(O2)：将混合气体通过铜网吸收O2。 9.转化法：两种物质难以直接分离，加药品变得容易分离，然后再还原回去：Al(OH)3，Fe(OH)3：先加NaOH 溶液把Al(OH)3溶解，过滤，除去Fe(OH)3，再加酸让NaAlO2转化成A1(OH)3。 五.常用的去除杂质的方法10种
知无不“研”|一文读懂染色质免疫共沉淀技术（ChIP） 染色质免疫共沉淀技术（ChIP） 基于体内分析而发展的染色质免疫沉淀分析（Chromatin immunoprecipitation assay kit,ChIP）技术可以真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，因此能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来，这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、心血管病以及中央神经系统紊乱等疾病主要通路的一种非常有效的工具。 染色质免疫沉淀分析（ChIP）的基本原理是在活细胞状态下，当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白、蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合时，它们必然靠的比较近或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。固定的蛋白质－DNA复合物通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过抗原抗体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。通过qPCR或二代测序，筛选与目的蛋白互作的未知DNA信息。 今天小编将珍藏多年的ChIP实验心得拿出来与大家一同探讨。 应用领域 1、判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰 2、检测RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位 3、研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系 4、转录因子研究 技术流程
免疫共沉淀实验方案 一、实验试剂和材料 Dynabeads? Protein G(novex by life technologies) PBS pH7.4(含0.01%Tween-20) 0.1M Na-phosphate（Washing Buffer） 50mM Glycine pH2.8(Elution Buffer) 二、实验步骤 （一）准备磁珠 1.将瓶子倾斜旋转5min左右，使瓶中磁珠悬浮； 2.吸取50ul磁珠液于离心管中； 3.将离心管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清； 4.从磁铁架上取下离心管； （二）结合抗体 1.加入200ul用PBS(含0.01%Tween-20)稀释的抗体； 2.室温旋转孵育10min; 3.将离心管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清； 4.从磁铁架上取下离心管，用200ul PBS(含0.01%Tween-20)温和吹吸并重悬磁珠-抗体复合体； （三）免疫沉淀抗原 1.将离心管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清； 2.从磁铁架上取下离心管，加入抗原样品并温和吹吸，重悬磁珠-抗体复合物； 3.室温旋转孵育10min，使抗原结合到磁珠-抗体复合物上; 4.将离心管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清；
5.用washing buffer 3次洗涤磁珠-抗体-抗原复合物，弃上清； 6.用100ul washing buffer重悬磁珠-抗体-抗原复合物，并将磁珠悬浮液转移到干净的离心管中，以避免蛋白抗原粘附在管壁上。 （四）洗脱抗原 1.将离心管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清； 2.加入200ul Elution Buffer至离心管中，温和吹吸并重悬磁珠-抗体-抗原复合物；（不要吹打出气泡） 3.室温旋转孵育2min； 4.将离心管置于磁铁架上，并将洗脱液（含有洗脱的抗原、抗体）转移到干净的离心管中，用于后续的SDS-PAGE蛋白凝胶电泳分析。