细胞总RNA提取
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从Hela细胞中提取总RNA
2013/7/23
原理：
Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍和酚等物质，能迅速破碎细胞和溶解细胞中的其它成分，抑制细胞释放出核酸酶，维持细胞中RNA的稳定性，加入氯仿离心后，RNA进入水相，再用异丙醇沉淀水相中的RNA，即可达到提取总RNA的目的。
（一） 实验前的准备
1. 物品的准备：
尽可能使用无菌、一次性塑料制品，已标明RNase-Free且未开封过的塑料制品，不必再进行其他处理，对于国产塑料制品，应按下列方法进行处理：
在一玻璃烧杯中注入含终浓度为0.1%DEPC的去离子水，将要处理的塑料制品浸泡其中12小时以上，弃DEPC水溶液，适温烘烤干燥已处理过的塑料制品，再经121℃高压灭菌15分钟， 70-80℃烘烤干燥即可使用。氯仿、异丙醇、75%乙醇(用DEPC-treated Water)、RNase-free Water
（二）正式试验
1.总RNA提取：
1) 从细胞培养平皿中收集细胞数约为1X107的细胞，加入1ml Trizol。加样枪头反复吹打混匀，直至细胞全部溶解。
2) 细胞裂解液室温放置5min，按每1ml Trizol试剂用量加入0.2ml氯仿（实际加的是300ul，理论上Trizol：氯仿最佳比例为5:1，但为了使萃取效果好所以加入300ul的氯仿）氯仿，剧烈振荡10-15s，室温静置15min(室温静置15min是为了让萃取反应完全进行)，4℃
12000 r/min离心15 min，观察分层。（注：氯仿的作用：一是萃取，二是使蛋白质变性；剧烈振荡的作用：一是使液体充分混匀，二是用机械力破坏DNA；EP管中的液体分三层，上层为水相，中间层为变性的蛋白相，下层为氯仿萃取出的有机相，其中RNA溶解在水相中。）
3) 取上清至新EP管，加入750μl异丙醇（一般Trizol：异丙醇=2:1，但为了使RNA尽量多的沉淀下来所以加入750ul），（轻微）振荡10-15 s，-20℃静置30min，4℃ 12000 r/min离心8min（可见管底有透明的胶状沉淀）后弃去上清液。（注：异丙醇的作用是使RNA变性。RNA遇有机物变性，遇水复性。-20℃静置30min是因为温度越低、静置时间越长越有利于RNA充分变性。异丙醇的量越多，温度越低，越有利于RNA的沉淀）。
4) 加入1ml预冷的75%乙醇洗涤RNA，轻轻振荡几次后，4℃ 12000r/min离心5 min，弃去上清液。（注：75%乙醇（洗去异丙醇）除具有洗涤作用外，本身易挥发，便于RNA的干燥）。
5) 干燥，在弃上清液后，保持EP管口向下，在滤纸上尽量吸干管口乙醇，然后将EP管水平放置，管口朝向酒精灯方向干燥约10min，期间可用加样枪吸干EP管管壁上的液体，注意勿触及管底的RNA。（注：为了更好的控制RNA中盐离子的含量，应尽量除净乙醇，同时注意勿使管底的RNA过分干燥，否则RNA会不容易溶解）。
6) 加入逆转录试剂盒中的DEPC处理水20µl，溶解RNA。用枪反复吹打后，吸取3µl分装于0.5ml的去RNA酶的管中，用于测RNA的浓度。
2.RNA检测：
凝胶电泳的制备。以小电泳槽为例，配制1%的琼脂糖凝胶20ml。
1) 电子天平上准确称取0.2g琼脂糖，倒入锥形瓶中，加入14 ml 1×TAE电泳缓冲液，置于微波炉中，中火约3min将其完全溶解；
2) 将锥形瓶置于冷水中，使其冷却，待凝胶温度降至约60℃时（不烫手即可），加入2ml 10×MOPS 、4ml甲醛；加1μl 显色剂EB（10mg/ml），使其终浓度达到0.5μg/ml，微微振荡混匀；
3) 在加热溶解琼脂糖的同时，将胶槽两端的挡板及梳子装好；
4) 将加有EB的琼脂糖倒入已准备好的胶槽中；
5) 室温静置，待琼脂糖凝胶凝固。
RNA样品的处理
取5μl的总RNA样品于EP管中，加入4μl逆转录试剂盒中的DEPC处理水和1μl 10×RNA上样缓冲溶液溶解RNA，置于90℃热水中加热5min，使RNA变性，冰浴冷却。
电泳及结果的观察
1）将胶槽置于电泳槽中，小心取出梳子，向电泳槽中加入适量的1×MOPS，使其没过凝胶约5mm；
2）用加样枪将处理过的RNA加入加样孔中；
3）接好电泳槽的电极，接通电源，120V恒压电泳15 min后在紫外透射反射仪上观察
RNA的完整性。
3.测RNA浓度:
取2.5µl总RNA样品在Nanadrop分光光度计中测其浓度。
1) 用DEPC处理水清洗探头3次，加一滴DEPC处理水作为空白对照并调零。
2) 测量样品的总RNA浓度，每测量完一个样品，需要用DEPC处理水清洗探头3次。期间记录所测样品的浓度，观察OD260/OD280（R）比值，为1.8-2.0时，认为RNA中蛋白或者其他有机物的污染是可以允许。当R＜1.8时，溶液中蛋白或者其他有机物的污染比较明显，当R＞2.0 时，说明RNA已经水解成为寡核苷酸。
3) 测量结束后用DEPC处理水清洗探头多次，以便下次使用及增加仪器使用寿命。
4.计算RT-PCR逆转录中所需总RNA的体积量:
按照合成20µl cDNA需要总RNA样品为2µg计算所需需总RNA的体积计算，公式如下：
逆转录中所需总RNA的体积量=2µg/测得的RNA浓度
5．RNA 逆转录合成cDNA第一条链:
按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明合成cDNA第一条链。
(1) 按顺序将下列反应物加入PCR管中(冰浴上操作)：
RNA样品 计算所得的总RNA体积量
Oligo(dT)引物 1 µl
加DEPC处理水至三者总体积为12 µl，轻轻振荡，瞬时离心3-5 s, 使反应物混匀。
（2）70℃温育5 min，4℃冷却，稍加离心。
注：70℃目的是使Oligo(dT)引物充分结合到RNA模板上；4℃冷却目的是使温度骤降防止结合到RNA模板上Oligo(dT)引物脱落下来。
（3）冰浴中加入以下反应物：
5×Reaction Buffer 4 µl
RibolockTM Ribonuclease Inhibitor(20µg/µl) 1 µl
10mM dNTP mix 2 µl
轻轻振荡，瞬时离心3-5 s, 使反应物混匀。 （4）37℃温育5 min。注：37℃温育目的是使RibolockTM Ribonuclease Inhibitor充分发挥效应，抑制RNase的活性。
（5）加入RevertAidTM M-MuLV Reverse Transciptase 1µl至终反应体积为20µl。
（6）42℃温育60 min，70℃加热10min后终止反应，冰浴冷却。注：42℃温育目的是在RevertAidTM M-MuLV Reverse Transciptase最适温度下合成cDNA；70℃加热10min目的是使RevertAidTM M-MuLV Reverse Transciptase完全灭活，不至于影响后续实验。
6． PCR扩增目的基因：
（1）向PCR 管中按顺序加入以下试剂：
2×PCR Master Mix 12.5 µl
上游引物 0.5 µl
下游引物 0.5 µl
cDNA temple （当提取的RNA的总量是2-3ug时加入的加入模板1ul）
1 µl
PCR water nucler-free 10.5 µl（25-12.5-0.5-0.5-1=10.5）
至终反应体积为25µl（加样的要求是根据体积由大变小来加）
PCR Master Mix包括（dNTP、镁离子、DNA聚合酶、Tris-Hcl缓冲溶液）
（2）设置PCR循环反应条件
预变性 94 ℃ 5 min（保证DNA完全变性，双链变成单链）
变性 94 ℃ 1 min
退火 54 ℃ 1 min
延伸 72 ℃ 1 min
总延伸 72 ℃ 10 min（保证延伸完全完成）
7． PCR产物的检测
（1）1％琼脂凝胶的配制
1）在电子天平上准确称取0.35g琼脂糖，倒入锥形瓶中，加入35ml 1×TAE电泳缓冲液，锥形瓶口用滤纸轻轻盖住，置微波炉中，中火将其煮沸，但要防止溢出。取出锥形瓶后左右晃动使琼脂糖散热；
2）将锥形瓶置于冷水中，使其迅速冷却，同时不停摇晃，使受冷均匀，待凝胶温度降至约50℃（不烫手即可），加入1.75μl EB（现在使用的是goldveiw）（10mg/ml），稍微振荡混匀；
3）安装好胶槽，插好梳子；
4）倒入已经准备好的胶槽中，室温静置，待琼脂糖凝胶冷却、凝固。
（2）PCR产物样品处理
向PCR产物中加入3µl的10×DNA Loading Buffer，混匀，离心3-5 s。
（3）将胶槽放入电泳槽中，拔去上样梳，倒入1×TAE电泳缓冲液，至覆盖胶面，超过5mm。
1）上样：第一孔加入10µl DNA Marker DL2000，随后每孔依次为假手术、术后3d、7d、14d、21d样品各10µl；
2）以90V的电压进行电泳。
30个循环
