提取总rna的方法

组织细胞总RNA提取步骤及方法

细胞总RNA提取是一种常用的实验技术，用于分离和提取细胞内的总RNA。以下是一种常用的细胞总RNA提取方法的步骤：

1.收集细胞样品：根据实验需要，收集适量的细胞样品。可以选择培养细胞、悬浮细胞或组织细胞等。

2. 细胞溶解：将细胞样品转移到离心管中，并使用适当的缓冲液（如TRIzol）进行细胞溶解。缓冲液中的离子和表面活性剂能够破坏细胞膜，使RNA释放到溶液中。

3.加入氯仿：向细胞溶解液中加入等体积的氯仿，并轻轻倒置离心管混匀。氯仿会与缓冲液中的酚类结合，形成有机相和水相。

4.离心分离：将混合液在高速离心下离心10-15分钟，使其分成有机相（上层）、界面层（中间层）和水相（下层）。RNA主要分布在界面层和水相之间。

5.收集上清液：使用滴管、移液器等工具小心收集上层的有机相液体，并转移到新的离心管中。这一步的目的是尽可能减少界面层和下层的干扰物。

6. 沉淀RNA：将等体积的异丙醇（isopropanol）加入上清液中，并轻轻倒置离心管混匀。异丙醇能够沉淀RNA，将其从溶液中去除。

7.离心分离：将混合液在高速离心下离心10-15分钟，使RNA沉淀在离心管底部形成一个白色沉淀。

8.去除上清液：小心将上清液倒掉，避免损失RNA沉淀。

9.RNA洗涤：使用70%乙醇洗涤RNA沉淀，将沉淀中的杂质去除。 10. 重新溶解：将洗涤后的RNA沉淀用RNase-free水或缓冲液中重新溶解，以便后续实验使用。注意要避免酶的污染。

以上是一种常见的细胞总RNA提取方法的步骤。这个方法简单、操作方便，并且能够高效地提取细胞内的总RNA。根据实验需要，也可以根据具体步骤来进行微调和改进。

实验内容：鲫总RNA的提取与热休克蛋白基因的克隆

热休克蛋白( heat shock protein , HSP) 又称为应激蛋白,是生物细胞（包括原核细胞及真核细胞）在受热、生物应激、理化因素等应激原刺激后，发生热休克反应时所产生的一类在生物进化中最保守并由热休克基因所编码的伴随细胞蛋白。

热休克蛋白 是细胞在生理状态下必需而在应激状态时表达增多的一类保护性蛋白质，热休克蛋白对生体的意义是，可提高机体对不良环境的耐受性，保护机体或细胞在随后的致死性应激中不受或少受伤害，同时还具有保护、修复蛋白质，参与机体免疫、交叉保护等特性。。热休克蛋白根据其同源性及分子质量大小可分为3 个主要家族: HSP90 (85-90 ku) 、HSP70 (68-73 ku) 和小分子质量热休克蛋白。其中以HSP70 最为保守,研究的也最广泛，常被作为应激反应的分子指标。

一. 主要酶和试剂

Trizol Reagent、禽源反转录酶（AMV）、DEPC、Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、DNA Marker（DL2000）。

二．所需试剂的配制：

DEPC处理水（0.1‰）：1000 mL双蒸水中加入0.1 mL DEPC，过夜温育后高压灭菌。

1.5％琼脂糖：向100 mL的1×TAE中加入1.5g的琼脂糖。

50×TAE：750 mL双蒸水中溶解242 g Tris碱，加入57.1 mL乙酸，100 mL的0.5 mol/L 的EDTA（pH8.0），用双蒸水定容至1000 mL。使用时用双蒸水稀释为1×TAE。

三. 仪器与设备

PCR扩增仪；微量核酸蛋白检测仪；紫外凝胶成像仪；电热恒温水浴锅；制冰机；稳压稳流电泳仪；微型水平电泳槽

四. 实验方法

实验开始前，要将枪头、匀浆器等用0.1％DEPC水浸泡12h以上，然后高压灭菌、烘干机烘干（需提前准备）

1． 总RNA的提取

用TRIzoL Reagent试剂盒并按其说明书提取总RNA，其具体操作步骤如下：

总RNA的提取（Trizol法提取）

在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。

1. 提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；

2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；

3. 在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；

4. 取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；

5. 弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；

6. 让沉淀的RNA在室温下自然干燥；

7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。

PCR

实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa TaqTM，TaKaRa EXTaqTM和PyrobestTM DNA Polymerase。TaKaRa TaqTM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRa EXTaqTM是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。PyrobestTM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。

- 1 - 提取总rna的方法

总RNA是指从细胞或组织中提取出的含有所有类型RNA的混合物。总RNA的提取是RNA研究的重要步骤之一，可以用于分析基因表达、RNA修饰、RNA结构等。以下是一种常用的总RNA提取方法：

材料与试剂：

- 细胞或组织样本

- TRIzol试剂（Invitrogen）

- 氯仿

- 异丙醇

- 离心管

- 离心机

- 热板

步骤：

1. 将细胞或组织样本加入到离心管中，用PBS或生理盐水洗涤一遍。

2. 加入TRIzol试剂，按照试剂和样本的比例加入。比例一般为1mL TRIzol/1g细胞或组织。

3. 用均质器将样本均质，使细胞或组织完全破碎，并使其与TRIzol完全混合。

4. 加入氯仿，并彻底混合，使其与TRIzol完全分离。

5. 离心管离心15分钟（4℃，12000rpm），使混合液分为两层，上层为清亮的上清液，下层为混浊的有机相。 - 2 - 6. 将上清液转移至新的离心管中，加入相同体积的异丙醇，混匀。

7. 离心管离心10分钟（4℃，12000rpm），使RNA沉淀在管底。

8. 倒掉上清液，用75%乙醇洗涤RNA沉淀，离心管离心5分钟（4℃，7500rpm）。

9. 将乙醇洗涤RNA沉淀挥干，加入适量的RNase-free水溶解即可。

注意事项：

1. TRIzol是一种强还原剂，需避免与其他化学物质接触。

2. RNA样本处理过程中需注意RNase污染的防止，使用RNase-free试剂和器材。

3. RNA的保存需避免RNase污染和长时间保存，最好在-80℃低温下保存。